Name: cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification
Uploaded: 2021-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Bu çalışma NIH R15-HL135675-01 ve NIH 2 R15-HL135675-02 tarafından T.J.L.'ye desteklenmiştir.

1. Tamponları ve reaktifleri hazırlayın
<ol><li>Fosfataz ve proteaz inhibitörlerinin taze çözeltilerini hazırlayın.<ol><li>100 mM'lik bir stok hazırlamak için 1 mL'lik %100 etanol'e 17.4 mg fenilmetansülfonil florür (PMSF) ekleyin. NOT: PMSF'yi kullanırken koruyucu ekipman kullanın, çünkü yutulduğunda veya solunduğunda ve cilt veya gözlerle temas ettiğinde tehlikelidir. Gözler ve cilt için aşındırıcıdır.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarına göre, ticari olarak temin edilebilen bir prot...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

Bu yöntem, yüksek hızlı santrifüjleme11 kullanılmadan hücre altı fraksiyonasyona yönelik daha önce yayınlanmış bir yaklaşımın değiştirilmiş bir versiyonudur. Bu modifiye yöntem, en iyi sonuçları elde etmek için daha özel ekipman gerektirir, ancak daha kapsamlı ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.
İlk protokolün geliştirilmesi, nekroptoz12 sırasında protein lokalizasyonunun analizi için mitokondriyal ve membran ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Subselüler fraksiyonasyon, hücrelerin lize edildiği ve çeşitli yöntemlerle kurucu bileşenlerine ayrıldığı bir prosedürdür. Bu teknik, araştırmacılar tarafından memeli hücrelerinde protein lokalizasyonunu belirlemek veya aksi takdirde tespit edilemeyecek düşük bolluktaki proteinlerin zenginleştirilmesi için kullanılabilir. Hücre altı fraksiyonasyon yöntemleri şu anda mevcut olsa da, satın alınabilecek ticari kitler gibi, bu prosedürün üstesinden gelmeye çalıştığı çeşitli sınırlamalardan muzdariptirler. Çoğu hücre fraksiyonasyon yöntemi, farklı hücresel bileşenleri çözündürmek için artan miktarda deterjan içeren tamponların kullanımına dayanan sadece deterjan bazlı 1,2'dir. Bu yöntem hızlı ve kullanışlı olsa da, saf olmayan fraksiyonlarla sonuçlanır. Bunlar, araştırmacıların hücrenin bir veya iki bileşenini kolayca izole etmelerini sağlamak için tasarlanmıştır, ancak aynı anda bir numuneden birden fazla hücre altı fraksiyonu izole edecek kadar karmaşık değildir. Yalnızca deterjanlara güvenmek genellikle membranla kaplı organellere ve plazma zarının ayrım gözetmeksizin çözünmesine neden olur ve bu bileşenlerin ayrılmasını zorlaştırır. Bu kitlerin kullanımından kaynaklanan ek bir komplikasyon, bileşenlerin çoğu tescilli formülasyonlar olduğundan, araştırmacıların belirli uygulamalar için bunları değiştirememesi / optimize edememesidir. Son olarak, bu kitler, daha büyük numuneler için ideal olandan daha az olmasını sağlayan kullanım sayısındaki sınırlamalarla yasaklayıcı bir şekilde pahalı olabilir.
Deterjanlara dayanmayan mitokondrilerin izolasyonu için kitlerin mevcudiyetine rağmen, plazma zarını izole etmek ve standart izolasyon protokollerinden önemli ölçüde daha düşük miktarda numune vermek için tasarlanmamışlardır 3,4. Diferansiyel santrifüjleme yöntemleri daha fazla zaman alıcı olsa da, genellikle sadece deterjan bazlı kitlerle elde edilemeyen farklı fraksiyonlarla sonuçlanırlar1. Çözünürleştirici deterjanların tek başına kullanılmadan ayrılması, ultrasantrifüjleme ve izopiknik yoğunluk gradyanları kullanılarak daha fazla saflaştırmaya izin vererek daha az çapraz kontaminasyona neden olur. Bu fraksiyonasyon protokolü, deterjan ve yüksek hızlı santrifüjleme tabanlı yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanarak U937 monositlerinden hücre altı fraksiyonların izolasyonunu göstermektedir. Bu yöntem, bir memeli hücresinin nükleer, sitoplazmik, mitokondriyal ve plazma zarı bileşenlerinin, fraksiyonlar arasında minimum kirlenme ile izolasyonunu kolaylaştıracaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

Bu protokol, deterjanlar, mekanik lizis ve izopiknik yoğunluk gradyanı santrifüjleme kombinasyonunu kullanarak memeli hücrelerinden hücre altı protein fraksiyonları elde etmek için bir yöntemi açıklar. Bu prosedürün en büyük avantajı, hücre altı fraksiyonları elde etmek için çözünürleştirici deterjanların tek kullanımına dayanmamasıdır. Bu, plazma zarını hücrenin diğer zara bağlı organellerinden ayırmayı mümkün kılar. Bu prosedür, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve seçici bir yöntemle hücrelerde protein lokalizasyonunun belirlenmesini kolaylaştıracaktır. Bu yöntem, sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve plazma membran proteinlerini insan monosit hücre hattı U937'den izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu hücre hattı için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu prosedür diğer hücre hatlarının hücre altı fraksiyonasyonu için uygun bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir. Prosedürün potansiyel tuzakları ve bunlardan nasıl kaçınılacağı, diğer hücre hatları için dikkate alınması gereken değişiklikler gibi tartışılmaktadır.

Bu prosedürün şematik bir akış şeması (Şekil 1), süspansiyonda yetiştirilen U9375 hücrelerini başarılı bir şekilde fraksiyone etmek için atılan adımları görsel olarak özetlemektedir. İzopiknik yoğunluk gradyanının tepesinden eşit hacimlerde (1 mL) toplanan fraksiyonlar, mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının saflaştırılmasını göstermektedir (Şekil 2). Dış mitokondriyal membran6'ya<...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Bu protokol önemlidir, çünkü dört hücresel bölmeyi birbirinden, sitoplazmadan, çekirdekten, mitokondriden ve zardan ayırmak için bir yöntem sağlar. Sadece bu değil, aynı zamanda güvenilir sonuçlara sahip ölçeklenebilir, tekrarlanabilir bir prosedürdür. Bu tekniğin en büyük avantajı, dört hücresel bölmenin minimum deterjan kullanımıyla ayrılmasıdır ve bu da çok daha tekrarlanabilir, güvenilir bir fraksiyonasyon prosedürüne izin verir.Sitozolik protein izolasyonu için, RPMI 1640'ta U937 hücrelerini, 37 santigrat derecede %10 fetal sığır serumu ve% 5 karbondioksit ile sekizinci hücrelere toplam altı x 10 oranında büyütün. Kültürü santrifüj edin ve oda sıcaklığındaki PBS'deki hücre peletini mililitre başına altı hücreye dört ila 10 arasında bir son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın ve kümeleri parçalamak için hafifçe pipetleyin. İkinci bir santrifüjlemeden sonra, peleti buz gibi soğuk lizis tamponu A'da, mililitre başına yedinci hücrelere iki x 10 arasında son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın.Aşağı akış nükleer protein ekstraksiyonu için buz üzerindeki konik bir tüpe 7,5 mililitre hücre ekleyin ve kalan hücreleri santrifüjleme ile pelet edin. Peleti sitoplazmik izolasyon tamponunda, mililitre başına yedinci hücrelere iki ila 10 arasında son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın, hücreleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe etmeden önce, kümeleri parçalamak için hafifçe pipetleyin. Kuluçkanın sonunda, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücresel kalıntıları tortulamak için süpernatantı santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hiçbir pelet gözlenmeyene kadar santrifüjleme sırasını tekrarlayın. Numune enkazdan arındırıldığında, sitozolik fraksiyon içeren süpernatantı dört santigrat derecede bir aya kadar saklayın.Daha sonra, lizis tamponu A'da depolanan hücre peletini, mililitre başına altıncı hücrelere dört x 10 arasında bir son konsantrasyona kadar askıya alın. Hücre homojenizasyonu için, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve fazla sayısallık ve sistolik kirleticileri gidermek için süpernatantı atın. Pelet, buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için peleti buz gibi soğuk hücre homojenizasyon tamponunda, mililitre başına altı hücreye dört ila 10 arasında bir son konsantrasyonda yeniden askıya alın.Bu arada, boncuk bazlı mekanik lizis için, soğuması için buz üzerinde 50 mililitrelik etekli bir tüpte 15 mililitre lizis tamponu B'ye 30 gram önceden yıkanmış paslanmaz çelik 3.2 milimetre boncuk ekleyin. Kuluçkanın sonunda, etekli tüpteki tamponu hücre süspansiyonu ile değiştirin ve hücreleri sekiz hızda beş dakika boyunca karıştırın. Lizisten sonra, homojenatı temiz bir tüpe aktarın.Homojenatı santrifüj edin, ardından süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Numuneden kalan kalıntıları gidermek için, homojenatı belirtildiği gibi üç kez santrifüj edin ve her santrifüjlemeden sonra süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Son santrifüjlemeden sonra, ham mitokondriyal fraksiyonu izole etmek için, süpernatantı santrifüjleme için yeni bir tüpe aktarın.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve ham mitokondriyal fraksiyon içeren peleti buz üzerine yerleştirin. Membran fraksiyonunu izole etmek için, toplanan süpernatanı santrifüj edin ve süpernatantı attıktan sonra ham membran fraksiyonu içeren peleti buz üzerine yerleştirin. İzopiknik yoğunluk gradyanı saflaştırması için, ham mitokondriyal ve membran fraksiyonu peletlerini 200 mikrolitre lizis tamponu B ve 1.8 mililitre iyodiksanol içinde yeniden askıya alın.Her numune için süreksiz bir iyodiksanol gradyanı oluşturmak için, önce numune başına sekiz mililitrelik açık, ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünün altına bir mililitre% 15 iyodiksantanol ekleyin. Daha sonra, sıralı olarak, her tüpte% 15 iyodiksanol tabakasının altında bir mililitre% 20 iyodiksanol,% 25 iyodiksanol, bir mililitre% 30 iyodiksanol ve bir mililitre% 35 iyodiksanol alttan alta yerleştirin. Bir gradyanın alt tabakasının altına ham mitokondriyal pelet süspansiyonunun iki mililitresini ve ikinci gradyanın alt tabakasının altına ham membran pelet süspansiyonunun iki mililitresini ekleyin.Her bir gradyanın üstüne bir mililitre% 10 iyodiksanol dikkatlice katlayın ve mitokondriyal ve membran fraksiyonlarını yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile saflaştırmadan önce% 10 iyodiksantal ilavesiyle tüpleri birbirlerinin 10 mikrogramı içinde dengeleyin. Ayırmanın sonunda, her numuneden görünür bantları toplamak için ince duvarlı tüplerin kenarını delmek için bir iğne kullanın. Nükleer protein izolasyonu için, lizis tamponu A'da asılı kalan hücrelerin 7.5 mililitrelik alikotunu santrifüj edin ve peleti pipetleme ve vorteks ile 800 mikrolitre buz soğuk hücre çözünürlük tamponunda yeniden askıya alın.Nükleer proteinleri korurken, plazma ve organel zarlarını bozmak için buz üzerindeki süspansiyonu 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sonunda, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve mikrolitre Benzonaz başına bir birim ile desteklenmiş 800 mikrolitre buz gibi soğuk nükleer lizis tamponunda hafifçe pipetleme yaparak peleti yeniden askıya alın. Nükleer membranı bozmak için karışımı uçtan uca rotatörde dört santigrat derecede inkübe edin.30 dakika sonra, nükleik asitleri kesmek için darbeler arasında beş saniyelik bir duraklama ile% 20 güçte beş saniye boyunca karışımı üç kez sonikleştirin. Son sonikasyondan sonra, homojenatı santrifüj edin ve pelet rahatsız etmeden süpernatantı nükleer fraksiyon olarak toplayın. Yoğunluk gradyanı saflaştırmasından sonra fraksiyonların her birinin batı lekesi, mitokondriyal fraksiyonun% 25 ve% 30 iyodiksanol tabakalarına lokalizasyonunu ve membran fraksiyonunun% 10 ve% 15 iyodiksanol tabakalarına lokalizasyonunu gösterir.Batı kan analizi ayrıca, izole edilen her numunenin saf olduğunu ve hücrenin diğer kısımlarından proteinler tarafından kontaminasyondan arındırılmış olduğunu doğrulamaktadır. Ek olarak, her numunenin bant yoğunluğunun densitometrik analizi, verilerin tekrarlanabilirliğini ve istatistiksel önemini doğrulamaktadır. Fraksiyonasyonun yanlış uygulanması, hücresel bileşenlerin çapraz kontaminasyonuna neden olabilir.Örneğin, sitozolik fraksiyondaki yüksek bir Histon H3 konsantrasyonu, sitozolik fraksiyonun yanlış açıklığa kavuşturulmasından kaynaklanabilir. İzopiknik yoğunluk saflaştırması sırasındaki arıza, membran fraksiyonunun kirlenmesine neden olabilir. Batı kan analizinden önce, fraksiyonların protein miktarına göre jel yüklemesine izin vermek için gerçekten protein içerdiğini doğrulamak ve prosedürün uygun şekilde uygulandığını doğrulamak için bir protein niceleme testi yapmak yararlı olabilir.Sitoplazmik fraksiyonun bir pelet içermemesi çok önemlidir. Batı lekeleri veya ELISA'lar, belirli koşullar altında farklı proteinlerin hücre altı yerini analiz etmenize izin vermek için bu prosedürü takiben gerçekleştirilebilir. Bu teknik, hiperglisemi koşulları altında farklı hücre ölüm faktörlerinin kaçakçılığını analiz etmemizi sağladı.Ve böylece, bizim için bu, hiperglisemik kaymanın apoptozdan nekroza geçiş mekanizmasına ışık tutmaya yardımcı oldu.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Situ Ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...