Name: generation of self-assembled vascularized human skin equivalents
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents at JoVE.com

De auteurs danken Dr. Jim Rheinwald59 en Dr. Ellen H. van den Bogaard20 voor hun gulle gift aan N/TERT cellijnen. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (19IPLOI34760636).

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dit protocol heeft een eenvoudige en herhaalbare methode aangetoond voor het genereren van VHSE's en hun driedimensionale analyse. Belangrijk is dat deze methode afhankelijk is van weinig gespecialiseerde technieken of apparatuurstukken, waardoor deze toegankelijk is voor een reeks laboratoria. Verder kunnen celtypen worden vervangen door beperkte wijzigingen in het protocol, waardoor onderzoekers dit protocol kunnen aanpassen aan hun specifieke behoeften.
Een goede collageengelatie is een uitdagende stap in het vaststellen van huidcultuur. Vooral bij het gebruik van ruwe preparaten zonder zuivering kunnen sporenverontreinigingen het gelatieproces beïnvloeden. Om consistentie te helpen garanderen, moeten groepen experimenten worden uitgevoerd met dezelfde collageenvoorraad die zal worden gebruikt voor VHSE-generatie. Verder zou de gelatie idealiter moeten optreden bij een pH van 7-7,4 en sporenverontreinigingen kunnen de pH verschuiven. Voordat een collageenvoorraad wordt gebruikt, moet een oefenacellulaire gel in de gewenste concentratie worden gemaakt en moet de pH worden gemeten voorafgaand aan gelatie. Het voltooien van deze collageenkwaliteitscontrole voordat u begint met het zaaien van huidcomponenten, zal de problemen met de juiste gelatie en collageenhomogeniteit identificeren voordat een volledig experiment wordt opgezet. In plaats van acellulair collageen rechtstreeks op een kweekinzet te zaaien, zaait u wat collageen op een pH-strip die de hele pH-schaal evalueert en controleert u een pH van 7-7,4. Gelatie kan worden geëvalueerd door een druppel van de collageengeloplossing op een afdeklip of plastic putplaat voor weefselkweek aan te brengen (een putplaat wordt aanbevolen om de beperkte zijden van een kweekinzet te simuleren). Na gelatietijd moet het collageen stevig zijn, d.w.z. het mag niet stromen wanneer de plaat wordt gekanteld. Onder fasecontrastmicroscopie moet het collageen er homogeen en helder uitzien. Incidentele bubbels van collageen zaaien zijn normaal, maar grote amorfe klodders ondoorzichtig collageen in de heldere gel duidt op een probleem- waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende mengen, verkeerde pH en / of het niet gekoeld houden van het collageen tijdens het mengen.
De celzaden en media kunnen worden aangepast. In het bovenstaande protocol zijn de ingekapselde celhoeveelheden geoptimaliseerd voor een insert van 12 putjes bij 7,5 x10 4 fibroblasten en 7,5 x10 5 endotheelcellen per ml collageen met 1,7 x 105 keratinocyten die bovenop de huidconstructie zijn gezaaid. Celdichtheden zijn geoptimaliseerd voor dit VHSE-protocol op basis van de voorstudies en het eerdere onderzoek naar 3D vasculaire netwerkgeneratie in verschillende collageenconcentraties48 en HSE-generatie22,80,81. In vergelijkbare systemen zijn de gepubliceerde endotheelceldichtheden 1,0 x 106 cellen/ml collageen48; de fibroblastconcentraties variëren vaak van 0,4 x 105 cellen/ml collageen22,28,82 tot 1 x 105 cellen/ml collageen8,58,83,84,85; en de keratinocytconcentraties variëren van 0,5 x 105 [cellen/cm2]80 tot 1 x 105 [cellen/cm2]8. Celdichtheden kunnen worden geoptimaliseerd voor specifieke cellen en onderzoeksvragen. Driedimensionale culturen met contractiele cellen, zoals fibroblasten, kunnen samentrekken, wat leidt tot vermindering van de levensvatbaarheid en cultuurverlies86,87. Voorbereidende experimenten moeten worden voltooid om de samentrekking van het huidcompartiment te testen (die kan optreden bij meer huidcellen, meer contractiele huidcellen, langere submersieculturen of zachtere matrices) en om epidermale oppervlaktedekking te testen. Bovendien kunnen het aantal dagen in de onderdompeling en de snelheid van taps toelopen van het serumgehalte ook worden aangepast als overmatige huidcontractie optreedt of een andere mate van keratinocytdekking vereist is. Bijvoorbeeld, als contractie wordt opgemerkt tijdens de periode van dermale onderdompeling of terwijl keratinocyten een oppervlaktemonolaag vaststellen, sneller door het serum taperingsproces bewegen en VHSE's verhogen naar ALI kan helpen bij het voorkomen van extra contractie. Evenzo, als keratinocytdekking niet ideaal is, kan het veranderen van het aantal dagen dat de VHSE zonder serum wordt ondergedompeld, helpen de epidermale monolaagdekking te verhogen en de contractie te verminderen omdat serum wordt weggelaten. Veranderingen in celdichtheden of andere suggesties hierboven moeten worden geoptimaliseerd voor de specifieke culturen en onderzoeksdoelen.
Om een goede stratificatie van de epidermis tijdens de air liquid interface (ALI) periode vast te stellen, is het van cruciaal belang om regelmatig de vloeistofniveaus in elke put te controleren en te handhaven, zodat ALI en de juiste hydratatie van elke constructie gedurende de hele kweeklengte worden bewaard. Medianiveaus moeten dagelijks worden gecontroleerd en bijgehouden totdat consistente ALI-niveaus zijn vastgesteld. De epidermale laag moet er gehydrateerd uitzien, niet droog, maar er mogen geen poelen met media op de constructie zijn. Tijdens ALI ontwikkelt de constructie een ondoorzichtige wit/gele kleur die normaal is. De epidermale laag zal zich waarschijnlijk ongelijk ontwikkelen. Gewoonlijk worden de VHSE's gekanteld als gevolg van het zaaien van collageen of dermale contractie. Het is ook normaal om een hoger epidermaal gedeelte in het midden van de constructie te observeren in kleinere constructies (24 putgrootte) en een nokvorming rond de omtrek van de VHSE in 12 putgrootte. Samentrekking van de constructies13 kan deze topografische formaties veranderen en/of helemaal niet worden waargenomen.
Kleuring en beeldvorming van VHSE's introduceert mechanische manipulatie bij de VHSE's. Het is erg belangrijk om manipulatie van elke cultuur te plannen en te beperken. Wanneer manipulatie nodig is, moet u voorzichtige bewegingen aanhouden bij het verwijderen van VHSE's uit de wisselplaatmembranen, bij het toevoegen van kleurings- of wasoplossingen aan het constructieoppervlak en bij het verwijderen en vervangen van VHSE's in hun opslag-/beeldvormingsputten tijdens de voorbereiding van de beeldvorming. In het bijzonder kunnen de apicale lagen van de epidermale component kwetsbaar zijn en het risico lopen de basale epidermale lagen af te schuinen. Apicale lagen van de epidermis zijn fragiel en gaan door desquamatie, zelfs in inheems weefsel4,maar voor een nauwkeurige analyse van de epidermale structuur is het belangrijk om schade of verlies te minimaliseren. Als epidermale lagen de constructie opheffen, kunnen ze afzonderlijk worden afgebeeld. De basale lagen van de opperhuid zijn hoogstwaarschijnlijk nog steeds aan de dermis gehecht, terwijl delen van de apicale lagen kunnen losraken. Voor visualisatie van de epidermis is een nucleaire vlek nuttig om dit te observeren, omdat dichte kernen een kenmerk zijn van lagere en middenlagen van de epidermis.
Confocale beeldvorming van de VHSE postfixatie is besproken in het protocol, maar het is ook mogelijk om de VHSE's in de hele cultuur in beeld te brengen via rechtopstaande optische coherentietomografie (OCT)88,89,90,91,92,93. VHSE zijn stabiel genoeg om beeldvorming te weerstaan zonder incubatie of bevochtiging gedurende ten minste twee uur zonder merkbare effecten. Omdat OCT labelvrij en niet-invasief is, is het mogelijk om de epidermale dikte tijdens de rijping te volgen. Andere niet-invasieve beeldvormingsmodaliteiten kunnen waarschijnlijk ook worden gebruikt.
Volumetrische beeldvorming van de gecombineerde huid- en epidermale structuren kan een uitdaging zijn vanwege laserdemping dieper in de VHSE. Dit kan worden verzacht door de constructie in twee richtingen in beeld te brengen, van de epidermale kant (figuur 1) en van de huidzijde (figuur 2), waardoor een goede resolutie van de huidstructuren en de epidermis mogelijk is. Bovendien kan het monster worden gewist, waardoor volumetrische beelden van de hele structuur met minimale demping mogelijk zijn. Verschillende clearingmethoden werden geprobeerd, maar de beschreven methanol/methylsalicylaatmethode leverde de beste resultaten op. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het optimaliseren van andere clearingmethoden zijn gericht op deze beoordelingen49,61,62. Bij het wissen wordt voorgesteld om het monster volledig in beeld te brengen voordat het wordt gewist, omdat de methode de fluoroforen en/of de structuur kan beschadigen. Verder moet de beeldvorming zo snel mogelijk na het wissen worden voltooid, omdat de fluorescentie binnen enkele dagen kan vervagen.
Voor eenvoud en toegankelijkheid maakte dit protocol gebruik van de eenvoudigste mediamixen uit eerdere literatuur11,80. Hoewel het gebruik van eenvoudige mediamixen veel voordelen heeft, worden ook de beperkingen van deze keuze erkend. Andere groepen hebben de effecten van specifieke mediacomponenten op de epidermale en huidgezondheid bestudeerd en ontdekten dat andere mediaadditieven94, zoals externe vrije vetzuren/lipiden, het stratum corneum van de opperhuid verbeteren en de huidbarrièrefunctie verbeteren. Hoewel onze immunofluorescente markers een geschikte differentiatie en stratificatie in de epidermis vertonen, kan, afhankelijk van de uitgevoerde studies, aanvullende mediaoptimalisatie nodig zijn. Verder werd geen uitgebreide analyse van de epidermale BM uitgevoerd bij de evaluatie van de hier gepresenteerde VHSE's. De integriteit van de BM is een belangrijke indicatie van huidequivalenten; verschillende groepen hebben onderzoek gedaan naar de kweekduur en het effect ervan op BM-markeringen95, alsmede analyse van fibroblastaanwezigheid en toegevoegde groeifactoreffecten op BM-expressie14. Het is belangrijk op te merken dat de analyse van de BM-component moet worden geëvalueerd en geoptimaliseerd bij het gebruik van dit protocol.
In dit protocol wordt een procedure beschreven voor VHSE-generatie, die resultaten na 8 weken bij ALI aantoont. VHSE-culturen zijn gekweekt tot 12 weken bij ALI zonder merkbare verandering of verlies van levensvatbaarheid, en het is mogelijk dat ze langer levensvatbaar zijn. Belangrijk is dat dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan algemeen beschikbare celtypen, zoals blijkt uit de vervanging van huidfibroblasten door IMR90 longfibrose. Afhankelijk van de behoefte van de onderzoeker en de beschikbare bronnen, kunnen de celtypen en mediamengsels op de cultuur worden aangepast, hoewel meer verschillende celtypen mediaoptimalisatie vereisen. Samengevat zijn deze procedures bedoeld om duidelijkheid te verschaffen over de cultuur van VHSE's voor de studie van huidbiologie en -ziekte. Om de toegankelijkheid te maximaliseren, werd het protocol ontwikkeld met behulp van gemeenschappelijke apparatuur, cellijnen en reagentia als een minimale effectieve aanpak die verder kan worden aangepast aan de specifieke behoeften van onderzoeken.

De menselijke huid vervult vele essentiële biologische functies, waaronder het fungeren als een immuun / mechanische barrière, het reguleren van de lichaamstemperatuur, het deelnemen aan waterretentie en zintuiglijke rollen1,2,3,4. Anatomisch gezien is de huid het grootste orgaan in het menselijk lichaam en bestaat uit drie hoofdlagen (epidermis, dermis en hypodermis) en bezit een complex systeem van stromale, vasculaire, glandulaire en immuun / zenuwstelselcomponenten naast epidermale cellen. De epidermis zelf bestaat uit vier lagen cellen die continu worden vernieuwd om de barrièrefunctie en andere structuren van de inheemse huid (d.w.z. zweet- en talgklieren, nagels) te behouden3. Huidfysiologie is belangrijk in immuunfunctie, wondgenezing, kankerbiologie en andere gebieden, waardoor onderzoekers een breed scala aan modellen gebruiken, van in vitro monoculturen tot in vivo diermodellen. Diermodellen bieden de mogelijkheid om de volledige complexiteit van huidfysiologie te bestuderen, maar veelgebruikte diermodellen zoals muizen hebben significante fysiologische verschillen in vergelijking met mensen5. Deze beperkingen, en de hogere kosten van diermodellen, hebben ertoe geleid dat veel onderzoekers zich hebben gericht op het ontwikkelen van in vitro modellen die de fysiologie van de menselijke huid beter weerspiegelen1,6. Hiervan is een van de eenvoudigere modeltypen het menselijke epidermale equivalent (HEE; ook wel halfdikte huidmodellen genoemd) die bestaan uit alleen epidermale keratinocyten op een acellulaire huidmatrix, maar epidermale differentiatie en stratificatie in vivo vastleggen. Voortbouwend hierop worden modellen die huid- en epidermale componenten (keratinocyten en fibroblasten) bevatten, vaak aangeduid als menselijke huidequivalenten (HSE), huidmodellen van volledige dikte of organotypische huidconstructies (OSC). Kortom, deze modellen worden gegenereerd door dermale cellen in gelmatrices in tekapselen en er epidermale cellen bovenop te zaaien. Epidermale differentiatie en stratificatie kunnen vervolgens worden bereikt via gespecialiseerde media en luchtblootstelling7. Huidequivalenten zijn meestal gegenereerd door middel van zelfassemblagetechnieken met behulp van huidgels gemaakt van collageen type I (van rattenstaart of runderhuidoorsprong)1,8, maar vergelijkbare modellen hebben anderematrixcomponenten opgenomen zoals fibrine9,10, fibroblast afgeleid 11,12, cadaveric de-epidermized membranen 13 ,14,15 ,16, commercieel verkrijgde gels en andere 1,1 ,1. Momenteel zijn er huidequivalenten in de handel verkrijgbaar (zoals eerder beoordeeld1,2). Deze zijn echter voornamelijk ontwikkeld voor therapeutische doeleinden en kunnen niet gemakkelijk worden aangepast aan specifieke onderzoeksvragen.
HSE's zijn toegepast in studies naar wondgenezing, enting, toxicologie en huidziekte/ontwikkeling11,12,13,16,8,20,21,22,23. Hoewel 3D-cultuur functies van menselijk weefsel uitgebreider modelleert in vergelijking met 2D-culturen24, maakt de opname van diverse celtypen die de in vivo populatie nauwkeuriger weerspiegelen , studies van cel-celcoördinatie in complexe weefsels24,25,26mogelijk . De meeste HSE's omvatten alleen huidfibroblasten en epidermale keratinocyten27, hoewel de in vivo huidomgeving veel andere celtypen omvat. Recente studies zijn begonnen met het opnemen van meer celpopulaties; deze omvatten endotheelcellen in vasculatuur10,28, 29,30,31,32,33, 34,adipocyten in sub-cutaan weefsel35,36,zenuwcomponenten 19 ,21, stamcellen27,37, 38 , immuuncellen10,39,40, 41 ,42 , en andere ziektes . Bijzonder belangrijk onder deze is vasculatuur; hoewel sommige HSE's vasculaire cellen bevatten, missen ze over het algemeen nog steeds uitgebreide capillaire elementen met connectiviteit over de hele dermis10,29 , uitgebreide in vitro stabiliteit28en de juiste vaatdichtheid. Verder worden HSE-modellen meestal beoordeeld door middel van histologische sectionering na de cultuur, waardoor de analyse van de driedimensionale structuur van HSE's wordt beperkt. Driedimensionale analyse maakt volumetrische beoordeling van vasculaire dichtheid48,49 mogelijk,evenals regionale variatie van epidermale dikte en differentiatie.
Hoewel HSE's een van de meest voorkomende organotypische modellen zijn, zijn er veel technische uitdagingen bij het genereren van deze constructies, waaronder identificatie van geschikte extracellulaire matrix- en celdichtheden, mediarecepten, juiste luchtvloeistofinterfaceprocedures en postcultuuranalyse. Hoewel HEE- en HSE-modellen protocollen hebben gepubliceerd, bestaat er geen gedetailleerd protocol met huid vasculatuur en volumetrische beeldvorming in plaats van histologische analyse. Dit werk presenteert een toegankelijk protocol voor de cultuur van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten (VHSE) uit voornamelijk commerciële cellijnen. Dit protocol is geschreven om gemakkelijk aan te passen, waardoor het eenvoudig kan worden aangepast aan verschillende celtypen en onderzoeksbehoeften. In het belang van toegankelijkheid, beschikbaarheid en kosten werd het gebruik van eenvoudige producten en generatietechnieken voorrang gegeven boven het gebruik van commercieel beschikbare producten. Verder worden eenvoudige volumetrische beeldvormings- en kwantificeringsmethoden beschreven die het mogelijk maken de driedimensionale structuur van de VHSE te beoordelen. Door deze procedure te vertalen naar een robuust en toegankelijk protocol kunnen niet-gespecialiseerde onderzoekers deze belangrijke modellen toepassen in gepersonaliseerde geneeskunde, vasculaire weefseltechnologie, entontwikkeling en geneesmiddelenevaluatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>(Dilute from Lab stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>#41678-5000, Lot # B0143461</td>
			<td>Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11295-00</td>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>Cat # BP510-250, Lot # 190231</td>
			<td>Rnase, Dnase, Protease-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3243</td>
			<td>SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td>Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R</td>
			<td></td>
			<td>(standard lab equipment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computational Software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATLAB 2020a</td>
			<td>MathWorks, Natick, MA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica TCS SPEII confocal</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (22 x 22)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545F</td>
			<td>0.13-0.17 mm No.1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate super glue or silicone grease</td>
			<td>Glue Masters</td>
			<td>#THI0102</td>
			<td>Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media base</td>
			<td>Corning; Mediatech, Inc</td>
			<td>REF # 10-013-CM; Lot # 26119007</td>
			<td>DMEM, 1X (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 50/50</td>
			<td>Corning; Mediatech, Inc</td>
			<td>REF # 10-090-CV; Lot # 21119006</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>#V1101</td>
			<td>(standard lab reagent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat # FB12999102, Lot # AE29451050</td>
			<td>Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11295-00</td>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218</td>
			<td>Made up in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Alpha Easar</td>
			<td>Lot # 5002F2A</td>
			<td>made up in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (human)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Lot # 9352621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Light/Phase Contrast Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76317-470</td>
			<td>(standard lab equipment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#AAJ6178806</td>
			<td>DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (1x) media base</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>REF #: 10724-011; Lot # 2085518</td>
			<td>Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7</td>
			<td>Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (solid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 media base</td>
			<td>Gen Depot</td>
			<td>CM034-050, Lot # 03062021</td>
			<td>MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal punches</td>
			<td>Sona Enterprises (SE)</td>
			<td>791LP, 12PC</td>
			<td>Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8&#34;, 5/32&#34;, 3/16&#34;, 7/32&#34;, 1/4&#34;, 9/32&#34;, 5/16&#34;, 3/4&#34;, 7/16&#34;, 1/2&#34;, 5/8:, 3/4&#34;. This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8&#34; or 1/2&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>CAS # 67-56-1</td>
			<td>(optional). For clearing dehydration step.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Salicylate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8</td>
			<td>(optional). For clearing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes, 1.7 mL</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics</td>
			<td>Cat # 24-282; Lot # 19467</td>
			<td>1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x Culture grade or autoclaved</td>
			<td>APEX Bioresearch Products</td>
			<td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td>
			<td>PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Ref # 25-508; Lot # 07171015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x non-Culture grade</td>
			<td>APEX Bioresearch Products</td>
			<td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td>
			<td>PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>Ref # 15140-122, Lot # 2199839</td>
			<td>Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, glass, small</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PYREX 316060</td>
			<td>(optional). To be used as a clearing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Use for making up PDMS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>GMID 02065622, Batch # H04719H035</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>GMID 02065622, Batch # H047JC4003</td>
			<td>DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipettes (1000 &#38; 250 uL)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L</td>
			<td>M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Tips/Pistons (1000 &#38; 250 uL)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S</td>
			<td>Sterilized capillaries and pistons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tipped scoopula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplements for Keratinocyte-SFM media</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>Ref # 37000-015, Lot # 2154180</td>
			<td>Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 &#181;m pore size</td>
			<td>Corning; Costar</td>
			<td>REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057</td>
			<td>Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plates, 12 well size</td>
			<td>Greiner Bio-one; CellStar</td>
			<td>Cat # 665 180; Lot # E18103QT</td>
			<td>12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B</td>
			<td>Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x 100</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Corning; Mediatech, Inc</td>
			<td>Ref # 25-053-CI</td>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagen isolated from Rat tail</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56054-1</td>
			<td>Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum chamber, benchtop</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td>(standard lab equipment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Precision knife</td>
			<td>X-Acto</td>
			<td>X3311</td>
			<td>(X-Acto knife optional if purchased steel punches)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of self-assembled vascularized human skin equivalents

Menselijke huidequivalenten (HSE's) zijn weefselgeënsingen die epidermale en huidcomponenten van de menselijke huid modelleren. Deze modellen zijn gebruikt om huidontwikkeling, wondgenezing en enttechnieken te bestuderen. Veel HSE's missen nog steeds vasculatuur en worden bovendien geanalyseerd door middel van histologische sectionering na de cultuur, waardoor de volumetrische beoordeling van de structuur wordt beperkt. Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd met toegankelijke materialen om gevasculariseerde menselijke huidequivalenten (VHSE) te genereren; verder beschreven zijn volumetrische beeldvormings- en kwantificeringstechnieken van deze constructies. Kortom, VHSE's zijn opgebouwd in 12 putcultuur inserts waarin huid- en epidermale cellen worden gezaaid in rat tail collageen type I gel. Het huidcompartiment bestaat uit fibroblast- en endotheelcellen die door collageengel worden verspreid. Het epidermale compartiment bestaat uit keratinocyten (huidepitheelcellen) die zich onderscheiden op de lucht-vloeistofinterface. Belangrijk is dat deze methoden kunnen worden aangepast op basis van de behoeften van de onderzoeker, met resultaten die VHSE-generatie aantonen met twee verschillende fibroblastceltypen: menselijke huidfibroblasten (hDF) en menselijke longfibrose (IMR90s). VHSE's werden ontwikkeld, afgebeeld door confocale microscopie en volumematig geanalyseerd met behulp van computationele software op tijdspunten van 4 en 8 weken. Er wordt een geoptimaliseerd proces beschreven om VHSE's voor volumetrisch onderzoek te repareren, te beitsen, te repareren en te wissen. Deze uitgebreide model-, beeldvormings- en analysetechnieken zijn gemakkelijk aan te passen aan de specifieke onderzoeksbehoeften van individuele laboratoria met of zonder eerdere HSE-ervaring.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents at JoVE.com

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Het doel van dit protocol is om de generatie- en volumetrische analyse van gevasculariseerde menselijke huidequivalenten te beschrijven met behulp van toegankelijke en eenvoudige technieken voor langetermijncultuur. Voor zover mogelijk wordt de reden voor stappen beschreven om onderzoekers in staat te stellen zich aan te passen op basis van hun onderzoeksbehoeften.

Generatie van zelfgeassembleerde vasculariseerde menselijke huidequivalenten

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Het detail in dit protocol richt zich op de menselijke huidequivalentgeneratie, wat vaak technisch uitdagend is. Nieuwe menselijke huidequivalente protocolelementen, zoals vasculatuur en volumetrische beeldvorming zijn inbegrepen. De techniek maakt de eenvoudige constructie van een huidmodel mogelijk dat nauwer aansluit bij in-vivo weefsel voor de studie van ziekten, veroudering en gepersonaliseerde geneeskunde.Het meest uitdagende deel van dit protocol is een overgang tussen onderdompeling en lucht-vloeistof interface. Het zal waarschijnlijk een paar proeven duren om de timing en medianiveaus te optimaliseren voor consistente resultaten. Voeg om te beginnen 516 microliters media toe aan een koud afgedekte buis en voeg onmiddellijk 375 microliters koud collageen toe met behulp van de 1000-microliter positieve verplaatsingspipet.Verwijder de lege pipettip en schakel over op de voorbereide 250-microliter positieve verplaatsingspipet om te mengen. Meng snel, maar voorzichtig om overtollige bubbelvorming te voorkomen. Houd de punt in de oplossing, meng gelijkmatig vanuit verschillende posities van de buis totdat de oplossing van homogene kleur is, wat meestal ongeveer vijf pipetcycli of 10 seconden duurt.Verspreid onmiddellijk 125 microliters acellulair collageen op het membraan van de 12-put kweekinzet. Om een uniforme dekking te garanderen, kantelt u de plaat en gebruikt u de pipettip om het membraan te schilderen door collageen voorzichtig rond te verspreiden. Verplaats de 12-put plaat onmiddellijk naar een 37 graden Celsius celkweek incubator om deze minstens 20 minuten te laten geleren.Haal na de gelatieperiode de 12-put plaat acellulair collageen uit de incubator. Verwijder de buis met een dop van 1,7 milliliter uit nat ijs, verwijder vervolgens het stamcollageen uit de koeling en plaats het op nat ijs met het deksel open. Voeg 516 microliters gekoelde celsuspensie toe aan de koud afgedekte buis.Gebruik de pipet van 1000 microliter om onmiddellijk 375 microliter koude collageenoplossing rechtstreeks in de oplossing in de afgedekte buis te pipetten. Verwijder al het collageen uit de pipet in de buis en gooi de pipetpunt met positieve verplaatsing weg. Schakel onmiddellijk over naar de pipet van 250 microliter en meng de collageenoplossing Eenmaal gemengd, breng 250 microliters cellulaire collageenoplossing over op de acellulaire collageensteunen in de 12-put kweekinzet en verplaats vervolgens de 12-putplaat naar een celkweek-incubator van 37 graden Celsius.Kantel na de geltijd van 30 minuten voorzichtig de plaat om de gelatie te beoordelen en zorg ervoor dat het collageen is gestold. Voeg respectievelijk 500 microliters en 1000 microliters mengmedia toe aan de bovenkamer en de onderste kamer van de insert. Zorg ervoor dat de collageengel onder water staat en voeg indien nodig meer media toe.Plaats de putplaat in de celkweek-incubator voor nachtelijke incubatie. Gebruik op dag zeven van de onderdompeling een handmatige pipet om media uit de onderste en bovenste kamer van elke constructieput te verzamelen en weg te gooien. Om media te verzamelen die direct onder het doorlatende membraan vastzitten, plaatst u de pipetpunt onder het membraan en slaat u het inzetstuk tijdelijk uit zijn plaats.Voeg een milliliter menselijke huidequivalent of HSE-media aangevuld met 5%FPS toe aan de onderste kamer van elke put en 200 microliter celsuspensie aan de bovenste kamer van elke put. Zaai de keratinocyten rechtstreeks op het huidconstructieoppervlak en laat ze twee uur in de incubator bezinken. Voeg twee uur na het zaaien van de keratinocyten voorzichtig 300 microliters HSE-media toe, aangevuld met 5% FPS aan de bovenste kamer van elke constructieput.Plaats de constructie na het laden van de media terug in de incubator. Til met behulp van een handmatige pipet elke constructie op naar hun lucht-vloeistofinterface, of ALI, door mediaafval alleen uit de bovenste kamer te verwijderen. Probeer zo dicht mogelijk bij de epidermale laag te komen zonder deze aan te raken of te beschadigen.Kantel de platen iets onder verschillende hoeken om de media te verzamelen en voeg vervolgens ongeveer twee milliliter steriel water toe aan de omringende putten in de plaat om een consistente vochtigheid te behouden. Controleer de plaat een paar uur later om er zeker van te zijn dat de keratinocyten nog steeds bij de ALI zijn. Verwijder alle media in de bovenste kamer en houd bij hoeveel media uit elke put worden verwijderd.De epidermale lagen moeten er gehydrateerd uitzien, niet droog, maar er mogen geen media bovenop de constructie worden gepoold. Om de constructie voor immunofluorescente kleuring voor te bereiden, draait u een inzetstuk ondersteboven en plaatst u het over de put op de putplaat. Stabiliseer het inzetstuk met één hand terwijl u een fijne tip forceps of een precisiemes gebruikt om ongeveer de helft van de omtrek van het membraan te snijden.Snijd zo dicht mogelijk bij de plastic behuizing. Pak met behulp van de fijne tip forceps de rand van de gesneden membraanklep en pel het poreuze membraan voorzichtig van het inzetstuk en de VHSE-constructie. Als de constructie vast komt te zitten aan de zijkant van de kamer, gebruik dan de fijne tip forceps of een kleine scoopula om hem naar de put te verplaatsen.Zodra de VHSE zich in de put bevindt, gooit u de resterende stukken van het wisselplaatmembraan weg en houdt u de kweekinzetbehuizing in elke put om de VHSE's tijdens het kleuren in een ondergedompelde positie te houden. Bereid twee dagen voor beeldvorming polydimethylsiloxaan of PDMS voor. Plaats elk schoon mengvat op een weegbalans en tarra de weegschaal.Voeg de basis toe en voeg vervolgens de crosslinker toe. Roer de oplossing minstens vier minuten krachtig, waardoor kleine bubbels ontstaan. Giet na voldoende mengen het PDMS in een Petrischaal van 90 of 100 millimeter.Ontgast het PDMS in een vacuümkamer totdat alle bellen verdwijnen en het PDMS helder is. Laat het vacuüm langzaam los en verwijder het PDMS. Zet de schaal in een oven om 's nachts uit te harden op 50 tot 60 graden Celsius, zorg ervoor dat de schaal plat zit zodat PDMS gelijkmatig kan uitharden.Gebruik een dag voor de beeldvorming een stalen pons of een handprecisiemes om een cirkelvormige put van het PDMS-vel te ponsen of uit te snijden, ongeveer even groot als de VHSE-constructie. Snijd een vierkante patch rond de cirkelvormige put om een enkele PDMS-put te maken. Gebruik een glazen afdekstrip van een vergelijkbare grootte als de PDMS-put voeg cyanoacrylaatlijm toe aan het onderste oppervlak van het PDMS en smeer gelijkmatig in met een wegwerppipetpunt.Centreer het glas en druk het op de PDMS-put terwijl u een helder glazen venster binnen de geperforeerde cirkel laat. Laat de lijm een nacht drogen voor gebruik. Karakterisering van de epidermis en dermis vertonen geschikte immunofluorescente markers voor de menselijke huid in de VHSE-constructies.Cytokeratine 10 is een vroege differentiatie keratinocyt marker die meestal markeert alle suprabasale lagen in huidequivalenten. Involucrine en filaggrin zijn late differentiatiemarkers in keratinocyten en markeren de bovenste meest suprabasale lagen in huidequivalenten. Het wissen van de VHSE maakte eenvoudige beeldvorming in één instelling mogelijk en elimineerde de noodzaak om de constructie opnieuw teoriënteren om de dermis en epidermis afzonderlijk weer te geven.Volumetrische afbeeldingen maken het mogelijk om 3D-renderings te genereren om vasculatuur in elke constructie in kaart te brengen. Afbeeldingsstacks werden geladen in rekensoftware en een aangepast algoritme werd gebruikt voor 3D-rendering en kwantificering. Skeletonisatie bepaalde het definitieve centrum van elk collageen IV-gemarkeerd vat en de resulterende gegevens werden gebruikt om de diameter van het vat en de vasculaire fractie te berekenen.Na deze procedure kunnen karakteriseringsmethoden zoals barrièreanalyse, scanning elektronenmicroscopie, lipidenprofielen en andere worden uitgevoerd om te begrijpen hoe vasculatuur specifiek de epidermale rijping en stabiliteit beïnvloedt. Dit protocol maakt weefselrelevante en celtypespecifieke studies in een gevasculariseerd huidmodel mogelijk. Het is bijzonder geschikt voor onderzoek in veroudering en gepersonaliseerde geneeskunde.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered Gevasculariseerd Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

In Vitro Model van de mens cutaneous hypertrofische littekens met behulp van macromoleculaire crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Een betrouwbaar porcine fascio-cutaan flapmodel voor gevasculariseerde composiet allografts bio-engineering studies

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...