5.4K Views
•
09:04 min
•
February 12th, 2021
DOI :
February 12th, 2021
•0:05
Introduction
0:42
Generation of 3D Collagen Dermal Component
1:44
Cell Laden Collagen Seeding of Dermal Compartment
3:16
Seeding of Epidermal Component and Stratification Induction
4:53
Immunofluorescent Staining of 3D Constructs
5:46
Prepare Imaging Wells
7:14
Results: Characterization of in Vitro Vascularized Human Skin Equivalents (VHSE)
8:22
Conclusion
Transcript
Detaljene i denne protokollen tar for seg tilsvarende generering av menneskelig hud, noe som ofte er teknisk utfordrende. Nye menneskehudekvivalente protokollelementer, som vaskulatur og volumetrisk avbildning er inkludert. Teknikken muliggjør enkel konstruksjon av en hudmodell som passer bedre til in-vivo vev for studiet av sykdommer, aldring og personlig medisin.
Den mest utfordrende delen av denne protokollen er en overgang mellom nedsenking og luftvæskegrensesnitt. Det vil sannsynligvis ta noen få forsøk å optimalisere timingen og medienivåene for konsistente resultater. Til å begynne med, legg til 516 mikroliter medier til et kaldt avkortet rør, og tilsett umiddelbart 375 mikroliter kaldt kollagen ved hjelp av pipetten med 1000 mikroliter positiv forskyvning.
Fjern den tomme pipettespissen og bytt til den klargjorte 250-mikroliter positive forskyvningspipetten som skal blandes. Bland raskt, men forsiktig for å forhindre overflødig bobledannelse. Hold spissen i løsningen, bland jevnt fra forskjellige posisjoner på røret til løsningen er av homogen farge, som vanligvis tar omtrent fem pipettesykluser eller 10 sekunder.
Disperger straks 125 mikroliter acellulær kollagen på membranen til 12-brønns kulturinnsatsen. For å sikre jevn dekning, vipp platen og bruk pipettespissen til å male membranen ved å forsiktig spre kollagen rundt. Flytt umiddelbart 12-brønnsplaten til en 37-graders Celsius cellekulturinkubator for å la den gele i minst 20 minutter.
Etter gelasjonsperioden, ta 12-brønnsplaten av acellulært kollagen ut av inkubatoren. Fjern det 1,7 milliliter kappede røret fra våt is, fjern deretter lager kollagenet fra kjøling og legg det på våt is med lokket åpent. Tilsett 516 mikroliter avkjølt cellefjæring til det kaldkledde røret.
Bruk pipetten på 1000 mikroliter til umiddelbart å pipette 375 mikroliter kald kollagenoppløsning direkte inn i oppløsningen inne i det avkappede røret. Utvis alt kollagen fra pipetten inn i røret og kast pipettespissen for positiv forskyvning. Bytt umiddelbart til pipetten med 250 mikroliter og bland kollagenoppløsningen Når den er blandet, overfør 250 mikroliter cellulær kollagenoppløsning til de acellulære kollagenstøttene i 12-brønns kulturinnsatsen, og flytt deretter 12-brønnsplaten til en 37 grader Celsius cellekulturinkubator.
Etter 30 minutters geltid, vipp platen forsiktig for å vurdere gelasjonen og sørg for at kollagenet har størknet. Tilsett 500 mikroliter og 1000 mikroliter blandemedier til henholdsvis det øvre kammeret og det nedre kammeret på innsatsen. Forsikre deg om at kollagengelen er nedsenket, og legg til flere medier om nødvendig.
Plasser brønnplaten i cellekulturinkubatoren for overnatting inkubasjon. På nedsenkningsdag syv bruker du en manuell pipette til å samle og kaste medier fra bunnen og det øverste kammeret i hver konstruksjonsbrønn. For å samle medier som sitter fast under den gjennomtrengelige membranen, plasser pipettespissen under membranen og slå innsatsen midlertidig ut av sted.
Tilsett en milliliter menneskelig hudekvivalent eller HMS-medier supplert med 5% FPS til det nedre kammeret til hver brønn og 200 mikroliter cellefjæring til toppkammeret i hver brønn. Frø keratinocyttene direkte på den dermale konstruksjonsoverflaten og la dem bosette seg i to timer i inkubatoren. To timer etter sådd av keratinocyttene, tilsett forsiktig 300 mikroliter HMS-medier, supplert med 5% FPS til det øverste kammeret i hver konstruksjonsbrønn.
Etter at du har lastet inn mediet, plasserer du konstruksjonen tilbake i inkubatoren. Bruk en manuell pipette, løft hver konstruksjon til deres luft-væske grensesnitt, eller ALI, ved å fjerne medieavfall fra det øvre kammeret. Prøv å komme så nær det epidermale laget som mulig uten å berøre eller skade det.
Vipp platene litt i forskjellige vinkler for å samle mediet, og tilsett deretter omtrent to milliliter sterilt vann til de omkringliggende brønnene i platen for å opprettholde konsistent fuktighet. Sjekk platen noen timer senere for å sikre at keratinocyttene fortsatt er på ALI. Fjern alle medier i det øvre kammeret, og hold oversikt over hvor mye medier som fjernes fra hver brønn.
De epidermale lagene skal se hydrert ut, ikke tørre, men det bør ikke være medier samlet på toppen av konstruksjonen. For å forberede konstruksjonen for immunfluorescerende farging, snu en innsats opp ned og legg den over brønnen på brønnplaten. Stabiliser innsatsen med en hånd mens du bruker fine spiss tang eller en presisjonskniv for å kutte omtrent halvparten av membranens omkrets.
Kutt så nær plasthuset som mulig. Bruk de fine spisspinnene til å gripe kanten på den kuttede membranklaffen og skrell forsiktig den porøse membranen av innsatsen så vel som VHSE-konstruksjonen. Hvis konstruksjonen sitter fast på siden av kammeret, bruk de fine spisspinnene eller en liten scoopula for å flytte den til brønnen.
Når VHSE er i brønnen, kast eventuelle gjenværende deler av innsatsmembranen og hold kulturinnsatshuset i hver brønn for å holde VHSEene i en nedsenket posisjon under farging. To dager før avbildning, klargjør polydimetylsiloksan eller PDMS. Plasser et rent blandebeholder på en veievekt og tjære vekten.
Legg til basen, og legg deretter til krysskoblingen. Rør løsningen kraftig i minst fire minutter, og lag små bobler. Etter tilstrekkelig blanding, hell PDMS i en 90 eller 100 millimeter Petri-tallerken.
Degas PDMS i et vakuumkammer til alle bobler forsvinner og PDMS er klar. Slipp vakuumet langsomt og fjern PDMS. Legg retten i en ovn for å kurere over natten ved 50 til 60 grader Celsius, og sørg for at parabolen sitter flatt for at PDMS skal kurere jevnt.
En dag før bildebehandling, bruk en stålstans eller en håndholdt presisjonskniv for å stanse eller kutte ut en sirkulær brønn fra PDMS-arket, omtrent like stor som VHSE-konstruksjonen. Klipp en firkantet patch rundt den sirkulære brønnen for å lage en enkelt PDMS-brønn. Bruk en glassdekselslipp av samme størrelse som PDMS-brønnen, tilsett cyanoacrylatlim på undersiden av PDMS og smør jevnt med en engangs pipettespiss.
Sentrer glasset og trykk det godt på PDMS mens du etterlater et klart glassvindu i den stansede sirkelen. La limet tørke over natten før bruk. Karakterisering av epidermis og dermis viser passende immunfluorescerende markører for menneskelig hud i VHSE-konstruksjonene.
Cytokeratin 10 er en tidlig differensiering keratinocyttmarkør som vanligvis markerer alle suprabasale lag i hudekvivalenter. Involucrin og filaggrin er sen differensieringsmarkører i keratinocytter og markerer de øvre mest suprabasale lagene i hudekvivalenter. Tømming av VHSE tillot enkel avbildning i en innstilling og eliminerte behovet for å omorganisere konstruksjonen for å avbilde dermis og epidermis separat.
Volumetriske bilder gjør det mulig å generere 3D-gjengivelser for å kartlegge vaskulatur gjennom hver konstruksjon. Bildestakker ble lastet inn i databehandlingsprogramvare, og en egendefinert algoritme ble brukt til 3D-gjengivelse og kvantifisering. Skeletonization bestemte det definitive senteret til hvert kollagen IV-merket fartøy, og de resulterende dataene ble brukt til å beregne kardiameter samt vaskulær brøkdel.
Etter denne prosedyren kan karakteriseringsmetoder som barriereanalyse, skanning av elektronmikroskopi, lipidprofiler og andre utføres for å forstå hvordan vaskulatur spesifikt påvirker epidermal modning og stabilitet. Denne protokollen muliggjør vevsrelevante og celletypespesifikke studier i en vaskulær hudmodell. Det er spesielt egnet for forskning innen aldring og personlig medisin.
Målet med denne protokollen er å beskrive generering og volumetrisk analyse av vaskulære menneskelige hudekvivalenter ved hjelp av tilgjengelige og enkle teknikker for langsiktig kultur. I den grad det er mulig, beskrives begrunnelsen for tiltak for å gi forskere muligheten til å tilpasse seg basert på deres forskningsbehov.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved