5.4K Views
•
09:04 min
•
February 12th, 2021
DOI :
February 12th, 2021
•0:05
Introduction
0:42
Generation of 3D Collagen Dermal Component
1:44
Cell Laden Collagen Seeding of Dermal Compartment
3:16
Seeding of Epidermal Component and Stratification Induction
4:53
Immunofluorescent Staining of 3D Constructs
5:46
Prepare Imaging Wells
7:14
Results: Characterization of in Vitro Vascularized Human Skin Equivalents (VHSE)
8:22
Conclusion
Transcript
Detaljerna i detta protokoll behandlar mänsklig hudekvivalenter generation, vilket ofta är tekniskt utmanande. Nya mänskliga hudekvivalenta protokollelement, såsom vaskulatur och volymetrisk avbildning ingår. Tekniken möjliggör enkel konstruktion av en hudmodell som närmare matchar in vivo-vävnad för studier av sjukdomar, åldrande och personlig medicin.
Den mest utmanande delen av detta protokoll är en övergång mellan nedsänkning och luft-flytande gränssnitt. Det kommer sannolikt att ta några försök att optimera tids- och medienivåerna för konsekventa resultat. Till att börja med tillsätt 516 mikroliter media till ett kallt täckt rör och tillsätt omedelbart 375 mikroliter kallt kollagen med hjälp av 1000-mikroliter positiv deplacementpipett.
Ta bort den tomma pipettspetsen och byt till den beredda 250 mikroliter positiva deplacementpipetten för att blanda. Blanda snabbt, men försiktigt för att förhindra överdriven bubbelbildning. Håll spetsen i lösningen, blanda jämnt från olika positioner av röret tills lösningen är av homogen färg, vilket vanligtvis tar cirka fem pipettcykler eller 10 sekunder.
Sprid omedelbart 125 mikroliter acellulärt kollagen på membranet i 12-brunnskulturinsatsen. För att säkerställa en enhetlig täckning, luta plattan och använd pipettspetsen för att måla membranet genom att försiktigt sprida kollagen runt. Flytta omedelbart 12-brunnsplattan till en 37-graders Celsius cellkulturinkubator för att låta den gel i minst 20 minuter.
Efter gelationsperioden, ta 12-brunnsplattan av acellulärt kollagen ur inkubatorn. Ta bort det 1,7 milliliter kapsejsade röret från våt is, ta sedan bort lagerkollaget från kylning och placera det på våt is med locket öppet. Tillsätt 516 mikroliter kyld cellfjädring till det kallappade röret.
Använd 1000-mikroliterpipetten för att omedelbart pipett 375 mikroliter kall kollagenlösning direkt i lösningen inuti det kapsejsade röret. För ut allt kollagen från pipetten i röret och kassera pipettspetsen med positiv deplacement. Byt omedelbart till 250-mikroliterpipetten och blanda kollagenlösningen När den är blandad överför du 250 mikroliter cellulär kollagenlösning till de acellulära kollagenstöden i 12-brunnskulturinsatsen och flyttar sedan 12-brunnsplattan till en 37 grader Celsius cellkulturinkubator.
Efter 30 minuters geltid, luta försiktigt plattan för att bedöma gelationen och se till att kollagenet har stelnat. Tillsätt 500 mikroliter och 1000 mikroliter blandningsmedier i skärens övre kammare respektive nedre kammare. Se till att kollagengelen är nedsänkt och tillsätt mer media om det behövs.
Placera brunnsplattan i cellkulturinkubatorn för inkubation över natten. På nedsänkning dag sju, använd en manuell pipett för att samla och kassera media från botten och översta kammaren i varje konstruktionsbrunn. För att samla in media som fastnat direkt under det genomsläppliga membranet, placera pipettspetsen under membranet och slå ut insatsen tillfälligt.
Tillsätt en milliliter mänsklig hudekvivalenter eller HSE-media kompletterat med 5%FPS till den nedre kammaren i varje brunn och 200 mikroliter cellfjädring till den övre kammaren i varje brunn. Frö keratinocyterna direkt på den dermala konstruktionsytan och låt dem bosätta sig i två timmar i inkubatorn. Två timmar efter sådd av keratinocyterna, tillsätt försiktigt 300 mikroliter HSE-media, kompletterat med 5% FPS till den övre kammaren i varje konstruktionsbrunn.
När du har laddat mediet placerar du tillbaka konstruktionen i inkubatorn. Använd en manuell pipett och lyft varje konstruktion till deras luft-vätskegränssnitt, eller ALI, genom att endast avlägsna medieavfall från den övre kammaren. Försök att komma så nära epidermalskiktet som möjligt utan att röra eller skada det.
Luta plattorna något i olika vinklar för att samla upp mediet och tillsätt sedan cirka två milliliter sterilt vatten till de omgivande brunnarna i plattan för att upprätthålla jämn fuktighet. Kontrollera plattan några timmar senare för att se till att keratinocyterna fortfarande är vid ALI. Ta bort alla medier i den övre kammaren och håll reda på hur mycket media som tas bort från varje brunn.
De epidermala lagren ska se hydratiserade, inte torra ut, men det bör inte finnas media som slås ovanpå konstruktionen. För att förbereda konstruktionen för immunofluorescerande färgning, vänd ett skär upp och ner och placera det över brunnen på brunnsplattan. Stabilisera insatsen med en hand medan du använder fina spetstångar eller en precisionskniv för att skära ungefär hälften av membranets omkrets.
Skär så nära plasthöljet som möjligt. Använd de fina spetstångarna, ta tag i kanten på den skurna membranluckan och skala försiktigt det porösa membranet från insatsen samt VHSE-konstruktionen. Om konstruktionen fastnar på sidan av kammaren, använd de fina spetstångarna eller en liten skopa för att flytta den till brunnen.
När VHSE är i brunnen, kassera eventuella återstående delar av insatsmembranet och håll kulturinsatshuset i varje brunn för att hålla VHSEs i nedsänkt position under färgning. Två dagar före avbildning, förbered polydimethylsiloxane eller PDMS. Placera alla rena blandningskärl på en vågbalans och tjära vågen.
Lägg till basen och lägg sedan till tvärlänken. Rör om lösningen kraftigt i minst fyra minuter, vilket skapar små bubblor. Häll PDMS i en 90 eller 100 millimeters petriskål efter tillräcklig blandning.
Avgasar PDMS i en vakuumkammare tills alla bubblor försvinner och PDMS är klart. Släpp vakuumet långsamt och ta bort PDMS. Placera skålen i en ugn för att härda över natten vid 50 till 60 grader Celsius, se till att skålen sitter platt för PDMS att bota jämnt.
En dag före avbildning, använd en stålslag eller en handhållen precisionskniv för att stansa eller skära ut en cirkulär brunn från PDMS-arket, ungefär lika stort som VHSE-konstruktionen. Klipp en fyrkantig patch runt den cirkulära brunnen för att skapa en enda PDMS-brunn. Använd en glaskåpa av liknande storlek som PDMS-brunnen tillsätt cyanoakrylatlim till PDMS bottenyta och smeta jämnt med en engångspipettspets.
Centrera glaset och tryck det på PDMS-brunnen medan du lämnar ett tydligt glasfönster i den stansade cirkeln. Låt limet torka över natten innan du använder det. Karakterisering av epidermis och dermis visar lämpliga immunofluorescerande markörer för mänsklig hud i VHSE konstruktioner.
Cytokeratin 10 är en tidig differentiering keratinocyte markör som vanligtvis markerar alla suprabasal lager i huden motsvarigheter. Involucrin och filaggrin är sena differentieringsmarkörer i keratinocyter och markerar de övre mest suprabasala skikten i hudekvivalenter. Rensa VHSE tillåtet för enkel bildbehandling i en inställning och eliminerade behovet av att omorientera konstruktionen för att avbilda dermis och epidermis separat.
Volymetriska bilder gör det möjligt att generera 3D-renderingar för att kartlägga vaskulaturen i varje konstruktion. Bildstaplar laddades in i beräkningsprogram och en anpassad algoritm användes för 3D-rendering och kvantifiering. Skeletonization bestäms det slutgiltiga centret för varje kollagen IV-märkt kärl och de resulterande uppgifterna användes för att beräkna kärldiameter samt vaskulär fraktion.
Efter denna procedur kan karakteriseringsmetoder som barriäranalys, skanning av elektronmikroskopi, lipidprofiler och andra utföras för att förstå hur vaskulatur specifikt påverkar epidermal mognad och stabilitet. Detta protokoll möjliggör vävnadsrelevanta och celltypspecifika studier i en vascularized hudmodell. Det är särskilt lämpligt för forskning inom åldrande och personlig medicin.
Målet med detta protokoll är att beskriva generering och volymetrisk analys av vascularized mänskliga huden motsvarigheter med hjälp av tillgängliga och enkla tekniker för långsiktig kultur. I möjligaste mån beskrivs logiken för steg för att ge forskare möjlighet att anpassa utifrån sina forskningsbehov.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved