Name: generation of self-assembled vascularized human skin equivalents
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents at JoVE.com

Yazarlar, Dr. Jim Rheinwald59 ve Dr. Ellen H. van den Bogaard20'ye N/TERT hücre hatları cömert hediyeleri için teşekkür ediyor. Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (19IPLOI34760636) tarafından desteklendi.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, VHSE'lerin üretimi ve üç boyutlu analizleri için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermiştir. Daha da önemlisi, bu yöntem birkaç özel teknik veya ekipman parçasına dayanır ve bu da onu çeşitli laboratuvarlar için erişilebilir hale getirir. Ayrıca, hücre tipleri protokoldeki sınırlı değişikliklerle değiştirilebilir ve araştırmacıların bu protokolü özel ihtiyaçlarına uyarlamalarına izin verebilir.
Uygun kollajen jelasyonu cilt kültürünün oluşturulmasında zorlu bir adımdır. Özellikle saflaştırma olmadan ham preparatlar kullanırken, eser kirleticiler jelleşme sürecini etkileyebilir. Tutarlılığı sağlamaya yardımcı olmak için, deney grupları VHSE üretimi için kullanılacak aynı kollajen stoğu ile yapılmalıdır. Ayrıca, jelleşme ideal olarak 7-7.4 pH'da gerçekleşmelidir ve eser kirleticiler pH'ı değiştirebilir. Herhangi bir kollajen stoğu kullanmadan önce, istenen konsantrasyonda bir uygulama asellüler jel yapılmalı ve jelleşmeden önce pH ölçülmelidir. Dermal bileşen tohumlama başlamadan önce bu kollajen kalite kontrolünü tamamlamak, tam bir deney kurmadan önce uygun jelleşme ve kollajen homojenliği ile ilgili sorunları belirleyecektir. Hücresel kollajeni doğrudan bir kültür kesici ucuna tohumlemek yerine, tüm pH ölçeğini değerlendiren ve 7-7.4 pH'ını doğrulayan bir pH şeridine biraz kolajen tohumlayın. Jelleşme, kollajen jel çözeltisinin bir damlacığı bir kapak ucuna veya doku kültürü plastik kuyu plakasına uygulanarak değerlendirilebilir (bir kültür kesici ucun sınırlı taraflarını simüle etmek için bir kuyu plakası önerilir). Jelleşme süresinden sonra kollajen katı olmalı, yani plaka eğildiğinde akmamalıdır. Faz kontrastı mikroskopisi altında kollajen homojen ve net görünmelidir. Kollajen tohumlamadan kaynaklanan kabarcıklar normaldir, ancak berrak jel içindeki büyük amorf opak kollajen lekeleri, yetersiz karıştırma, yanlış pH ve / veya karıştırma sırasında kollajenin soğutulmaması nedeniyle bir sorun olduğunu gösterir.
Hücre tohumlama miktarları ve ortam ayarlanabilir. Yukarıdaki protokolde, kapsüllenmiş hücre miktarları, dermal yapının üzerine tohumlanmış 1,7 x 10 5 keratinosit ile kollajen mL başına 7,5 x10 4 fibroblast ve 7,5 x10 5 endotel hücresinde 12 kuyulu bir kesici uç için optimize edilmiştir. Hücre yoğunlukları, çeşitli kollajen konsantrasyonlarında 3D vasküler ağ neslini araştıran ön çalışmalara ve önceki araştırmaya dayanarak bu VHSE protokolü için optimize edilmiştir48 ve HSE nesil22,80,81. Benzer sistemlerde, yayınlanan endotel hücre yoğunlukları 1.0 x 106 hücre / mL kollajen48'dir; fibroblast konsantrasyonları genellikle kollajen22, 28,82 ila1 x 105hücre / mL kollajen 8 ,58 ,83,84,850.4 x 105hücre / mL arasında değişir; ve keratinosit konsantrasyonları 0,5 x 105 [hücreler/cm2]80 ila 1 x 105 [hücreler/cm2]8arasında değişmektedir. Hücre yoğunlukları belirli hücreler ve araştırma sorusu için optimize edilebilir. Fibroblastlar gibi kontrtil hücreli üç boyutlu kültürler, canlılık azalmasına ve kültür kaybına yol açabilir86,87. Dermal bölmenin daralmasını (daha fazla dermal hücre, daha fazla kontrantil dermal hücre, daha uzun dalgıçlık kültürleri veya daha yumuşak matrislerle ortaya çıkabilir) test etmek ve epidermal yüzey kapsamını test etmek için ön deneyler tamamlanmalıdır. Ayrıca, aşırı dermal kasılma meydana gelirse veya farklı bir keratinosit kapsama oranı gerekiyorsa, dalgıçlıktaki gün sayısı ve serum içeriğinin koniklik oranı da özelleştirilebilir. Örneğin, dermal submersion döneminde veya keratinositler bir yüzey monolayer kurarken kasılma fark edilirse, serum konikleme işleminde daha hızlı hareket etmek ve VHSE'leri ALI'ye yükseltmek ek kasılmaların önlenmesine yardımcı olabilir. Benzer şekilde, keratinosit kapsamı ideal değilse, VHSE'nin serum olmadan batırıldığı gün sayısını değiştirmek epidermal monolayer kapsamını artırmaya ve serum dışarıda bırakıldığından kasılma azaltabilir. Hücre yoğunluklarındaki değişiklikler veya yukarıdaki diğer öneriler, belirli kültürler ve araştırma hedefleri için optimize edilmelidir.
Hava sıvı arayüzü (ALI) döneminde epidermisin uygun bir tabakalaşmasını sağlamak için, her bir kuyuda sıvı seviyelerini düzenli olarak kontrol etmek ve korumak önemlidir, böylece ALI ve her yapının uygun hidrasyon kültür uzunluğu boyunca tutulur. Tutarlı ALI düzeyleri belirlenene kadar medya düzeyleri günlük olarak denetlenmeli ve izlenmelidir. Epidermal tabaka kuru değil, nemli görünmelidir, ancak yapıda ortam havuzları olmamalıdır. ALI sırasında, yapı normal olan opak beyaz/sarı bir renk geliştirecektir. Epidermal tabaka muhtemelen düzensiz bir şekilde gelişecektir. Yaygın olarak, VHSE'ler kollajen tohumlama veya dermal kasılma nedeniyle eğilir. Yapının ortasında daha küçük yapılarda (24 kuyu boyutunda) daha yüksek bir epidermal kısım ve VHSE çevresi çevresinde 12 kuyu boyutunda bir sırt oluşumu gözlemlemek de normaldir. Yapıların daralması13 bu topoğrafik oluşumları değiştirebilir ve/veya hiç gözlemlenmeyebilir.
VHSE'lerin boyanması ve görüntülenmesi VHSE'lere mekanik manipülasyonu tanıtır. Her kültürün manipülasyonunun planlandırılması ve sınırlandırılması çok önemlidir. Manipülasyon gerektiğinde, VHSE'leri kesici uç zarlarından çıkarırken, yapı yüzeyine boyama veya yıkama çözümleri eklerken ve görüntüleme hazırlığı sırasında depolama/görüntüleme kuyularındaki VHSE'leri çıkarırken ve değiştirirken nazik hareketleri koruyun. Özellikle, epidermal bileşenin apikal katmanları kırılgan olabilir ve bazal epidermal tabakaları kesme riski altındadır. Epidermisin apikal katmanları kırılgandır ve doğal dokuda bile desquamasyondan geçer4, ancak epidermal yapının doğru analizi için hasarı veya kaybı en aza indirmek önemlidir. Epidermal katmanlar yapıyı kaldırırsa, ayrı ayrı görüntülenebilirler. Epidermisin bazal katmanları büyük olasılıkla hala dermis'e bağlıyken, apikal katmanların bölümleri ayrılabilir. Epidermisin görselleştirilmesi için, yoğun çekirdek epidermisin alt ve orta katmanlarının bir özelliği olduğundan, nükleer bir leke bunu gözlemlemede yardımcı olur.
VHSE post-fiksasyonunun konfokal görüntülemesi protokolde tartışılmıştır, ancak VHSE'leri kültür boyunca dik tabanlı optik tutarlılık tomografisi (OCT)88 , 89,90,91,92,93ile görüntülemek de mümkündür. VHSE, gözle görülür etkileri olmadan en az iki saat boyunca inkübasyon veya nemlendirme olmadan görüntülemeye dayanacak kadar kararlıdır. OCT etiketsiz ve noninvaziv olduğundan, olgunlaşma sırasında epidermal kalınlığı izlemek mümkündür. Diğer noninvaziv görüntüleme yöntemleri de kullanılabilir.
VHSE'nin daha derinlerinde lazer zayıflaması nedeniyle kombine dermal ve epidermal yapıların hacimsel görüntülemesi zor olabilir. Bu, yapının epidermal taraftan (Şekil 1) ve dermal taraftan ( Şekil2) olmak üzere iki yönde görüntülenmesi ile azaltılabilir ve dermal vasküler yapıların ve epidermisin iyi çözülmesini sağlar. Ek olarak, numune temizlenebilir ve tüm yapının hacimsel görüntülerinin minimum zayıflama ile olmasını sağlar. Çeşitli temizleme yöntemleri denendi, ancak açıklanan methanol / metil salisilat yöntemi en iyi sonuçları verdi. Diğer takas yöntemlerini optimize etmek isteyen araştırmacılar bu incelemelere yönlendirilir49,61,62. Temizleme ise, yöntem floroforlara ve/veya yapıya zarar verebileceği için, temizlemeden önce numunenin tam olarak görüntülenebilmesi önerilir. Ayrıca, floresan birkaç gün içinde solabileceğinden, görüntüleme temizlendikten sonra mümkün olan en kısa sürede tamamlanmalıdır.
Basitlik ve erişilebilirlik için, bu protokol önceki literatürde bulunan en basit ortam karışımlarını kullandı11,80. Basit medya karışımlarını kullanmanın birçok avantajı olsa da, bu seçimin sınırlamaları da kabul edilmektedir. Diğer gruplar, belirli medya bileşenlerinin epidermal ve dermal sağlık üzerindeki etkilerini incelediler ve dış serbest yağ asitleri / lipitler gibi diğer medya katkı maddeleri94'ünepidermisin stratum korneumunu artırdığını ve cilt bariyeri işlevini iyileştirdiğini buldular. İmmünofluoresan belirteçlerimiz epidermisin içinde uygun farklılaşma ve tabakalaşma gösterse de, yapılan çalışmalara bağlı olarak ek medya optimizasyonu gerekebilir. Ayrıca, burada sunulan VHSE'ler değerlendirilirken epidermal BM'nin kapsamlı bir analizi yapılmamıştır. BM'nin bütünlüğü cilt eşdeğerlerinin önemli bir göstergesidir; çeşitli gruplar, kültür süresi ve BM işaretleri95 üzerindeki etkisinin yanı sıra fibroblast varlığının analizi ve BM ekspresyörü üzerinde büyüme faktörü etkileri hakkında araştırmalar yapmıştır14. Bu protokol kullanırken BM bileşeninin analizinin değerlendirilmesi ve optimize edilmesi gerektiğini belirtmek önemlidir.
Bu protokolde, ALI'de 8 hafta sonra sonuçları gösteren VHSE oluşturma prosedürü açıklanmaktadır. VHSE kültürleri ALI'de gözle görülür bir değişiklik veya canlılık kaybı olmadan 12 haftaya kadar kültürlenmiştir ve daha uzun süre yaşayabilir olmaları mümkündür. Daha da önemlisi, bu protokol dermal fibroblastların IMR90 akciğer fibroblastları ile değiştirilmesinde gösterildiği gibi, yaygın olarak bulunan hücre tiplerine kolayca uyarlanabilir. Araştırmacının ihtiyacına ve kullanılabilir kaynaklara bağlı olarak, daha farklı hücre türleri medya optimizasyonu gerektirebileceğinden, kültür üzerindeki hücre türleri ve ortam karışımları ayarlanabilir. Özetle, bu prosedürler cilt biyolojisi ve hastalıklarının incelenmesi için VHSE'lerin kültürü hakkında netlik sağlamak içindir. Erişilebilirliği en üst düzeye çıkarmak için protokol, araştırma çalışmalarının özel ihtiyaçlarına göre daha da özelleştirilebilen minimal etkili bir yaklaşım olarak ortak ekipman, hücre hatları ve reaktifler kullanılarak bu basit ve sağlam şekilde geliştirilmiştir.

İnsan derisi, bağışıklık/ mekanik bariyer görevi, vücut sıcaklığını düzenleme, su tutma ve duyusalrollerekatılma dahil olmak üzere birçok temel biyolojik işlevi yerine getirir 1,2,3,4. Anatomik olarak, cilt insan vücudundaki en büyük organdır ve üç ana katmandan (epidermis, dermis ve hipodermis) oluşur ve epidermal hücrelere ek olarak stromal, vasküler, glandüler ve bağışıklık / sinir sistemi bileşenlerinden oluşan karmaşık bir sisteme sahiptir. Epidermisin kendisi, bariyer fonksiyonunu ve doğal cildin diğer yapılarını (yani ter ve yağ bezleri, tırnaklar) korumak için sürekli yenilenen dört hücre katmanından oluşur3. Cilt fizyolojisi bağışıklık fonksiyonu, yara iyileşmesi, kanser biyolojisi ve diğer alanlarda önemlidir ve araştırmacıların in vitro monokültürlerden in vivo hayvan modellerine kadar çok çeşitli modeller kullanmasına yol açmaktadır. Hayvan modelleri cilt fizyolojisinin tüm karmaşıklığını inceleme yeteneği sunar, ancak fareler gibi yaygın olarak kullanılan hayvan modelleri insanlara kıyasla önemli fizyolojik farklılıklara sahiptir5. Bu sınırlamalar ve hayvan modellerinin artan maliyeti, birçok araştırmacının insan derisinin fizyolojisini daha yakından yansıtan in vitro modeller geliştirmeye odaklanmasına neden oldu1,6. Bunlardan daha basit model türlerinden biri, hücresel dermal matris üzerinde sadece epidermal keratinositlerden oluşan, ancak in vivo olarak görülen epidermal farklılaşma ve tabakalaşmayı yakalayan insan epidermal eşdeğeridir (HEE; yarı kalınlıkta cilt modelleri olarak da adlandırılır). Bunun üzerine inşa edilen dermal ve epidermal bileşenler (keratinositler ve fibroblastlar) içeren modeller genellikle insan derisi eşdeğerleri (HSE), tam kalınlıkta cilt modelleri veya organotipik cilt yapıları (OSC) olarak adlandırılır. Kısaca, bu modeller jel matrisler içindeki dermal hücrelerin kapsüllenerek ve üstte epidermal hücrelerin tohumlanarak oluşturulur. Epidermal farklılaşma ve tabakalaşma daha sonra özel ortam ve hava maruziyeti ile elde edilebilir7. Cilt eşdeğerleri en sık kollajen tip I (fare kuyruğu veya sığır derisi kökenli)1,8,ancak benzer modeller fibrin 9,10, fibroblast gibi diğer matris bileşenlerini içeren dermal jeller kullanılarak kendi kendine montaj teknikleri ile üretilmiştir. türetilmiş11,12, kadavra epidermizlenmiş membranlar13,14,15,16, ticari olarak mevcut jeller ve diğerleri 1,12,13,17,18,19. Şu anda, ticari olarak mevcut cilt eşdeğerleri vardır (daha önce incelenmiş olduğu gibi1,2). Bununla birlikte, bunlar öncelikle terapötik amaçlar için geliştirilmiştir ve belirli araştırma sorularına kolayca özelleştirilemez.
HSE'ler yara iyileşmesi, greftleme, toksikoloji ve cilt hastalığı/gelişimi 11,12,13,16,8 ,20,21,22,23çalışmalarında uygulanmıştır. 3D kültürü, 2D kültürlere kıyasla insan dokusunun işlevlerini daha kapsamlı bir şekilde modellese de24, in vivo popülasyonu daha doğru yansıtan çeşitli hücre türlerinin dahil edilmesi, karmaşık dokularda hücre-hücre koordinasyonu çalışmalarına olanak sağlar24,25,26. Çoğu HSE sadece dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositleriçerir 27In vivo cilt ortamı diğer birçok hücre tipini içermelerine rağmen. Son çalışmalar daha fazla hücre popülasyonu dahil başladı; Bunlar arasında10,28 , 29,30,31 ,32,33,34,alt deri dokusundaki adipositler35,36,sinir bileşenleri19,2'dekiendotel hücreleribulunur.1 , kök hücreler27,37,38, bağışıklık hücreleri10,39,40,41,42ve diğer hastalık/kansere özgü modeller16, 40,43,44,45,46,47. Bunlar arasında özellikle önemli olan vaskülattır; Bazı HSE'ler vasküler hücreler içerirken, genel olarak hala tüm dermis10, 29,genişletilmiş in vitro stabilite28 ve uygun damar yoğunluğu boyunca bağlantıya sahip kapsamlı kılcal elementlerden yoksunlar. Ayrıca, İsG modelleri tipik olarak HSE'lerin üç boyutlu yapısının analizini sınırlayan kültür sonrası histolojik bölümleme yoluyla değerlendirilir. Üç boyutlu analiz, vasküler yoğunluğun hacimsel olarak değerlendirilmesinisağlar 48,49 ve epidermal kalınlık ve farklılaşmanın bölgesel varyasyonunu sağlar.
HSE'ler en yaygın organotipik modellerden biri olmasına rağmen, uygun hücre dışı matris ve hücre yoğunluklarının tanımlanması, medya tarifleri, uygun hava sıvısı arayüz prosedürleri ve kültür sonrası analiz dahil olmak üzere bu yapıların oluşturulmasında birçok teknik zorluk vardır. Ayrıca, HEE ve HSE modelleri protokoller yayınlamış olsa da, histolojik analizden ziyade dermal vaskülat ve hacimsel görüntülemeyi içeren ayrıntılı bir protokol yoktur. Bu çalışma, esas olarak ticari hücre hatlarından damarlı insan derisi eşdeğerleri (VHSE) kültürü için erişilebilir bir protokol sunun. Bu protokol, farklı hücre türlerine ve araştırma ihtiyaçlarına doğrudan adaptasyon sağlayan kolayca özelleştirilebilir olacak şekilde yazılmıştır. Erişilebilirlik, kullanılabilirlik ve maliyet açısından, basit ürünlerin kullanımı ve üretim teknikleri, piyasada bulunan ürünlerin kullanımına göre önceliklendirilmiştir. Ayrıca, VHSE'nin üç boyutlu yapısının değerlendirilmesine izin veren basit hacimsel görüntüleme ve nicelleştirme yöntemleri açıklanmıştır. Bu prosedürün sağlam ve erişilebilir bir protokole çevrilmesi, uzman olmayan araştırmacıların bu önemli modelleri kişiselleştirilmiş tıp, damarlı doku mühendisliği, greft geliştirme ve ilaç değerlendirmesinde uygulamalarını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 N NaOH</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S318-100</td>
			<td>(Dilute from Lab stock)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>#41678-5000, Lot # B0143461</td>
			<td>Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11295-00</td>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>Cat # BP510-250, Lot # 190231</td>
			<td>Rnase, Dnase, Protease-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3243</td>
			<td>SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-186</td>
			<td>Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R</td>
			<td></td>
			<td>(standard lab equipment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computational Software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATLAB 2020a</td>
			<td>MathWorks, Natick, MA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica TCS SPEII confocal</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass (22 x 22)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545F</td>
			<td>0.13-0.17 mm No.1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate super glue or silicone grease</td>
			<td>Glue Masters</td>
			<td>#THI0102</td>
			<td>Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media base</td>
			<td>Corning; Mediatech, Inc</td>
			<td>REF # 10-013-CM; Lot # 26119007</td>
			<td>DMEM, 1X (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 50/50</td>
			<td>Corning; Mediatech, Inc</td>
			<td>REF # 10-090-CV; Lot # 21119006</td>
			<td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco&#39;s Mod. Of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F12 50/50 Mix) with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>#V1101</td>
			<td>(standard lab reagent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cat # FB12999102, Lot # AE29451050</td>
			<td>Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11295-00</td>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218</td>
			<td>Made up in 0.1% BSA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Alpha Easar</td>
			<td>Lot # 5002F2A</td>
			<td>made up in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (human)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Lot # 9352621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Light/Phase Contrast Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76317-470</td>
			<td>(standard lab equipment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#AAJ6178806</td>
			<td>DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM (1x) media base</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>REF #: 10724-011; Lot # 2085518</td>
			<td>Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7</td>
			<td>Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (solid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9</td>
			<td>L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 media base</td>
			<td>Gen Depot</td>
			<td>CM034-050, Lot # 03062021</td>
			<td>MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal punches</td>
			<td>Sona Enterprises (SE)</td>
			<td>791LP, 12PC</td>
			<td>Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8&#34;, 5/32&#34;, 3/16&#34;, 7/32&#34;, 1/4&#34;, 9/32&#34;, 5/16&#34;, 3/4&#34;, 7/16&#34;, 1/2&#34;, 5/8:, 3/4&#34;. This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8&#34; or 1/2&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>CAS # 67-56-1</td>
			<td>(optional). For clearing dehydration step.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Salicylate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8</td>
			<td>(optional). For clearing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes, 1.7 mL</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics</td>
			<td>Cat # 24-282; Lot # 19467</td>
			<td>1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x Culture grade or autoclaved</td>
			<td>APEX Bioresearch Products</td>
			<td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td>
			<td>PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Ref # 25-508; Lot # 07171015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x non-Culture grade</td>
			<td>APEX Bioresearch Products</td>
			<td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td>
			<td>PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>Ref # 15140-122, Lot # 2199839</td>
			<td>Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, glass, small</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PYREX 316060</td>
			<td>(optional). To be used as a clearing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Use for making up PDMS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>GMID 02065622, Batch # H04719H035</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>GMID 02065622, Batch # H047JC4003</td>
			<td>DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipettes (1000 &#38; 250 uL)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L</td>
			<td>M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Tips/Pistons (1000 &#38; 250 uL)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S</td>
			<td>Sterilized capillaries and pistons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round tipped scoopula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplements for Keratinocyte-SFM media</td>
			<td>Gibco; Life Technologies Corporation</td>
			<td>Ref # 37000-015, Lot # 2154180</td>
			<td>Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 &#181;m pore size</td>
			<td>Corning; Costar</td>
			<td>REF # 3462 - Clear; Lot # 14919057</td>
			<td>Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plates, 12 well size</td>
			<td>Greiner Bio-one; CellStar</td>
			<td>Cat # 665 180; Lot # E18103QT</td>
			<td>12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B</td>
			<td>Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x 100</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Corning; Mediatech, Inc</td>
			<td>Ref # 25-053-CI</td>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagen isolated from Rat tail</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56054-1</td>
			<td>Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum chamber, benchtop</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td>(standard lab equipment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Precision knife</td>
			<td>X-Acto</td>
			<td>X3311</td>
			<td>(X-Acto knife optional if purchased steel punches)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of self-assembled vascularized human skin equivalents

İnsan derisi eşdeğerleri (HSE'ler), insan derisinin epidermal ve dermal bileşenlerini modelleyen doku mühendisliği yapılardır. Bu modeller cilt gelişimi, yara iyileşmesi ve aşılama tekniklerini incelemek için kullanılmıştır. Birçok HSE vaskülürden yoksun olmaya devam eder ve ayrıca yapının hacimsel değerlendirmesini sınırlayan kültür sonrası histolojik bölümleme yoluyla analiz edilir. Burada sunulan, damarlı insan derisi eşdeğerleri (VHSE) oluşturmak için erişilebilir malzemeler kullanan basit bir protokoldür; ayrıca bu yapıların hacimsel görüntüleme ve nicelleştirme teknikleri tanımlanmıştır. Kısaca, VHSE'ler dermal ve epidermal hücrelerin sıçan kuyruk kollajen tipi I jel içine tohum edildiği 12 kuyu kültürü kesici uçta inşa edilir. Dermal bölme, kollajen jel boyunca dağılmış fibroblast ve endotel hücrelerinden oluşur. Epidermal bölme, hava-sıvı arayüzünde farklılık gösteren keratinositlerden (cilt epitel hücreleri) oluşur. Daha da önemlisi, bu yöntemler araştırmacının ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilir ve sonuçlar VHSE neslini iki farklı fibroblast hücre tipiyle gösterir: insan dermal fibroblastları (hDF) ve insan akciğer fibroblastları (IMR90'lar). VHSE'ler geliştirildi, konfokal mikroskopi ile görüntülendi ve 4 ve 8 haftalık zaman noktalarında hesaplama yazılımı kullanılarak hacimsel olarak analiz edildi. Hacimsel muayene için VHSE'leri düzeltmek, lekelemek, görüntülemek ve temizlemek için optimize edilmiş bir süreç açıklanmıştır. Bu kapsamlı model, görüntüleme ve analiz teknikleri, önceden HSE deneyimi olan veya olmayan bireysel laboratuvarların özel araştırma ihtiyaçlarına göre kolayca özelleştirilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents at JoVE.com

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Bu protokolün amacı, uzun vadeli kültür için erişilebilir ve basit teknikler kullanarak damarlı insan derisi eşdeğerlerinin neslini ve hacimsel analizini tanımlamaktır. Mümkün olduğu ölçüde, adımların gerekçesi, araştırmacılara araştırma ihtiyaçlarına göre özelleştirme olanağı sağlamak için açıklanmıştır.

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Bu protokolde sağlanan ayrıntı, genellikle teknik olarak zorlayıcı olan insan derisi eşdeğeri üretimi ele alıyor. Vaskülat ve hacimsel görüntüleme gibi yeni insan derisi eşdeğeri protokol elemanları dahildir. Teknik, hastalıkların, yaşlanmanın ve kişiselleştirilmiş tıbbın incelenmesi için in-vivo doku ile daha yakından eşleşen bir cilt modelinin basit bir şekilde inşasını sağlar.Bu protokolün en zorlu kısmı, dalgıçlık ve hava sıvısı arayüzü arasındaki bir geçiştir. Tutarlı sonuçlar için zamanlama ve medya seviyelerini optimize etmek için muhtemelen birkaç deneme yapılacaktır. Başlamak için, soğuk kaplı bir tüpe 516 mikrolitre ortam ekleyin ve hemen 1000 mikrolitre pozitif deplasman pipetini kullanarak 375 mikrolitre soğuk kollajen ekleyin.Boş pipet ucunu çıkarın ve karıştırmak için hazırlanan 250 mikroliter pozitif deplasmanlı pipete geçin. Aşırı kabarcık oluşumunu önlemek için hızlı, ancak hafifçe karıştırın. Ucu çözeltide tutarak, çözelti tipik olarak yaklaşık beş pipet döngüsü veya 10 saniye süren homojen renkte olana kadar tüpün farklı konumlarından düzgün bir şekilde karıştırın.12 kuyulu kültür kesici ucunun zarına hemen 125 mikrolitre hücresel kollajen dağıtın. Düzgün kapsama alanı sağlamak için plakayı eğin ve kollajeni hafifçe etrafa yayarak zarı boyamak için pipet ucunu kullanın. 12 kuyu plakasını hemen 37 derecelik bir santigrat hücre kültürü inkübatörüne taşıyarak en az 20 dakika jel hale getirmek için hareket ettirin.Jelleşme döneminden sonra, 12 kuyulu kollajen plakasını inkübatörden alın. 1,7 mililitrelik kapaklı tüpü ıslak buzdan çıkarın, ardından stok kolajenini soğutmadan çıkarın ve kapağı açık ıslak buza yerleştirin. Soğuk kapaklı tüpe 516 mikrolitre soğutulmuş hücre süspansiyonu ekleyin.1000 mikrolitre pipet kullanarak 375 mikrolitre soğuk kollajen çözeltisini doğrudan kapaklı tüpün içindeki çözeltiye hemen pipetledi. Tüm kollajenleri pipetten tüpe atın ve pozitif deplasman pipet ucunu atın. Hemen 250 mikrolitre pipete geçin ve kollajen çözeltisini karıştırın Karıştırılınca, 250 mikrolitre hücresel kollajen çözeltisini 12 kuyulu kültür kesici uçtaki hücresel kollajen desteklerine aktarın, ardından 12 kuyu plakasını 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne taşıyın.30 dakikalık jel süresinden sonra, jeli değerlendirmek ve kolajenin katılaşmış olduğundan emin olmak için plakayı hafifçe eğin. Kesici ucun üst odasına ve alt odasına sırasıyla 500 mikrolitre ve 1000 mikrolitre karışım ortamı ekleyin. Gerekirse daha fazla ortam ekleyerek kollajen jelinin suya batırıldığından emin olun.Kuyu plakasını gece kuluçka için hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Yedinci submersion gününde, her yapının alt ve üst odasındaki medyayı toplamak ve atmak için manuel bir pipet kullanın. Geçirgen membranın doğrudan altına sıkışmış medyayı toplamak için pipet ucunu zarın altına yerleştirin ve kesici ucu geçici olarak yerinden atın.Her kuyunun alt odasına bir mililitre insan derisi eşdeğeri veya %5 FPS ile desteklenmiş İsG ortamı ve her kuyunun üst odasına 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Keratinositleri doğrudan dermal yapı yüzeyine tohumlayın ve inkübatörde iki saat yerleşmelerini sağlar. Keratinositlerin tohumlanlarından iki saat sonra, her yapının üst odasına% 5 FPS ile desteklenmiş 300 mikrolitre HSE ortamı dikkatlice ekleyin.Ortamı yükledikten sonra, yapıyı inkübatöre geri yerleştirin. Manuel pipet kullanarak, her yapıyı yalnızca üst bölmeden medya atıklarını kaldırarak hava sıvısı arayüzüne veya ALI'ye kaldırın. Epidermal tabakaya dokunmadan veya zarar vermeden mümkün olduğunca yaklaşmaya çalışın.Ortamı toplamak için plakaları farklı açılarda hafifçe eğin, ardından tutarlı nemi korumak için plakadaki çevredeki kuyulara yaklaşık iki mililitre steril su ekleyin. Keratinositlerin hala ALI'de olduğundan emin olmak için birkaç saat sonra plakayı kontrol edin. Her kuyudan ne kadar ortam çıkarıldığını takip ederek üst bölmedeki herhangi bir ortamı kaldırın.Epidermal katmanlar kuru değil, nemli görünmelidir, ancak yapının üstünde birikmiş ortam olmamalıdır. Yapıyı immünoresan lekelenmeye hazırlamak için, bir kesici ucu ters çevirin ve kuyu plakasının üzerine yerleştirin. Membran çevresinin yaklaşık yarısını kesmek için ince uçlu önps veya hassas bir bıçak kullanırken kesici ucu tek elle sabitleyin.Plastik muhafazaya mümkün olduğunca yakın kesin. İnce uçlu asaları kullanarak, kesilmiş membran kapağının kenarını tutun ve gözenekli zarı kesici ucun yanı sıra VHSE yapısından hafifçe soyun. Yapı odanın kenarına sıkışırsa, kuyuya taşımak için ince uçlu uzun uçluları veya küçük bir kepçeyi kullanın.VHSE kuyuya girdikten sonra, kesici uç zarının kalan parçalarını atın ve boyama sırasında VHSE'leri batık bir konumda tutmak için kültürün her kuyuda muhafazasını tutun. Görüntülemeden iki gün önce polidimetilsiloksina veya PDMS hazırlayın. Herhangi bir temiz karıştırma kabını tartım terazisine yerleştirin ve tartıyı daralayın.Tabanı ekleyin, sonra çapraz bağlantıyı ekleyin. Çözeltiyi en az dört dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve küçük kabarcıklar oluşturun. Yeterli karıştırmadan sonra, PDMS'yi 90 veya 100 milimetrelik bir Petri kabına dökün.Tüm kabarcıklar kaybolana ve PDMS temizlenine kadar PDMS'yi vakum odasında gazdan arındırın. Vakumun yavaşça serbest bırakılması ve PDMS'nin çıkarılması. Yemeği, PDMS'nin eşit şekilde tedavi etmesi için düz oturduğundan emin olarak, 50 ila 60 santigrat derecede bir gecede kürleme için bir fırına yerleştirin.Görüntülemeden bir gün önce, VHSE yapısıyla aynı boyutta, PDMS sayfasından dairesel bir kuyuyu delmek veya kesmek için çelik bir zımba veya el tipi hassas bıçak kullanın. Tek bir PDMS kuyusu oluşturmak için dairesel kuyunun etrafına kare bir yama kesin. PDMS ile benzer boyutta bir cam kapak kayması kullanarak PDMS'nin alt yüzeyine siyanoakrilat tutkal ekleyin ve tek kullanımlık pipet ucuyla eşit şekilde sürün.Camı ortalayın ve delikli daire içinde açık bir cam pencere bırakırken PDMS'ye iyi bastırın. Kullanmadan önce tutkalın gece boyunca kurumasına izin verin. Epidermisin ve dermisin karakterizasyonu VHSE yapılarında insan cildi için uygun immünofluoresan belirteçleri gösterir.Sitokeratin 10, genellikle cilt eşdeğerlerindeki tüm suprabasal katmanları işaretleyen erken farklılaşma keratinosit belirtecidir. involucrin ve filaggrin keratinositlerde geç farklılaşma belirteçleridir ve cilt eşdeğerlerinde en üst en suprabasal tabakaları işaretler. VHSE'nin temizlenmesi, tek bir ayarda basit görüntülemeye izin verdi ve dermis ve epidermisi ayrı ayrı görüntülemek için yapıyı yeniden yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırdı.Hacimsel görüntüler, her yapı boyunca vaskülat haritalamak için 3D renderlar oluşturmayı mümkün klar. Görüntü yığınları hesaplama yazılımına yüklendi ve 3D işleme ve niceleme için özel bir algoritma kullanıldı. İskeletleşme, kollajen IV işaretli her damarın kesin merkezini belirledi ve elde edilen veriler damar çapının yanı sıra vasküler fraksiyonu hesaplamak için kullanıldı.Bu işlemi takiben, vaskülatürün özellikle epidermal olgunlaşma ve stabiliteyi nasıl etkilediğini anlamak için bariyer analizi, tarama elektron mikroskopisi, lipit profilleri ve diğerleri gibi karakterizasyon yöntemleri yapılabilir. Bu protokol, damarlı bir cilt modelinde doku ile ilgili ve hücre tipine özgü çalışmalara olanak sağlar. Özellikle yaşlanma ve kişiselleştirilmiş tıp araştırmaları için uygundur.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

A Reliable Porcine Fascio-Cutaneous Flap Model for Vascularized Composite Allografts Bioengineering Studies

Vaskülarize Kompozit Allogreftler Biyomühendislik Çalışmaları için Güvenilir Bir Domuz Fasyo-Kutanöz Flap Modeli

Vascularized Composite Allografts (VCA) such as hand, face, or penile transplant represents the cutting-edge treatment for devastating skin defects, ...