Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
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这项工作得到了基金会发起基金N 11191049 J.A.P.和NIH赠款DA038598对G.E.T.的支持。

所有实验，包括动物处理和组织收集，都是根据佛罗里达大学和纽约城市学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）按照批准的协议201508873（UF）和1071（CCNY）进行的。有关试剂和缓冲液，请参阅 补充文件。
1. 准备急性大鼠脑切片
注意：在该实验中，使用成年雄性大鼠（250-350g）。然而，这种设置对于不同的发育点，雌性大鼠和其他物种是有效的...

多年来，单胺释放测量已经在许多系统中进行，例如异源细胞，神经元培养物，脑突触体，离体急性脑切片和整个动物13，20，41，42，58，64，65，66，67，<sup class...

过多的神经系统和精神疾病与单胺类神经递质（多巴胺[DA]，5-羟色胺[5-HT]，去甲肾上腺素[NE]）稳态的失调或维持不足有关1，2，3。这些疾病包括但不限于抑郁症1，2，精神分裂症2，焦虑症2，成瘾4，更年期5，6，7，疼痛8和帕金森病3。例如，几种更年期大鼠模型表明，海马体、前额叶皮层和纹状体内单胺失调或减少可能与抑郁和认知能力下降有关，这在经历更年期的女性中可见。这些模型中单胺的失调已经使用HPLC-ECD进行了广泛的检查，尽管这些研究没有区分测量的神经递质含量与神经递质释放5，6，7。单胺通过Ca2 +依赖性囊泡释放9经典地释放到细胞外空间，并通过其各自的质膜再摄取系统（多巴胺转运蛋白，DAT;血清素转运蛋白，SERT;去甲肾上腺素转运蛋白，NET）10，11循环。相反，数据表明，这些转运蛋白能够释放或排出单胺，因为已知苯丙胺（AMPH）和3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）等滥用药物分别通过其转运蛋白系统释放DA和5-HT12，13，14，15，16，17.因此，对单胺释放动力学的正确机制理解对于开发特定和靶向的药物治疗至关重要。
已经采用了广泛的技术来研究单胺释放，例如快速扫描循环伏安法（FSCV）18，体内微透析13，成像19，放射性标记的单胺预孵育20，光遗传学，以及最近的遗传编码荧光传感器和光度测定法21，22.FSCV和体内微透析是用于研究单胺释放的主要技术。FSCV用于研究刺激的DA在急性脑切片和体内的胞吐释放23。由于FSCV使用电极来刺激或唤起释放，因此神经递质释放的主要来源是Ca2 +依赖性囊泡释放18，24，25，26，27，28，29，30，31.体内微透析与HPLC相结合，使用放置在感兴趣大脑区域的探针测量细胞外神经递质水平的变化13，32。与FSCV类似，体内微透析的一个主要限制是难以确定神经递质释放的来源：Ca2 +依赖性囊泡释放或转运蛋白依赖性。值得注意的是，这两种方法都可以直接测量单胺释放。通过光遗传学的最新进展，研究表明，在短时间内检测到5-HT和DA释放，具有精致的细胞类型特异性21，22。然而，这些策略需要复杂而昂贵的技术和设备，并间接测量单胺释放，特别是通过单胺与受体结合。此外，放射性标记的单胺也用于研究单胺动力学。放射性标记的单胺可以预加载到各种模型系统中，例如异源细胞过度表达每个单胺转运蛋白20，33，34，35，36，37，38，39，40，原代神经元20，突触体33，39，41，42，和急性脑切片43，44。然而，放射性对实验者造成潜在的伤害，并且氚标记的分析物可能无法忠实地概括内源性单胺动力学45，46。超聚变系统与HPLC-ECD等离线检测方法相结合，允许从多个组织来源检测单胺。在这里，该协议提供了一种优化和低成本，简单和精确的方法，使用急性脑切片直接测量内源性基底和刺激的单胺释放。
急性脑切片允许测试机械假设，主要是因为它们保留了体内解剖学微环境，并保持完整的突触47，48，49，50，51，52。在一些研究中，急性脑切片或切碎的脑组织已与使用KCl刺激Ca2 +介导的释放的超融合技术结合使用53，54，55，56。超聚变系统对于推进该领域对神经递质释放机制（包括单胺）的理解至关重要。然而，这些系统相对昂贵，可用于组织分析的腔室数量从4-12不等。相比之下，这里介绍的方法价格低廉，可以测量48个组织样品，并且可以改进以使用多达96个组织样品。48孔板内的每个孔都包含组织支架，这些组织支架使用过滤器将释放的产物从组织中分离出来，然后通过HPLC-ECD收集和分析释放的单胺。重要的是，该方法允许在用调节单胺释放的药理剂治疗后，同时测量来自不同大脑区域（如前额叶皮层，海马体和背纹状体）的5-HT，DA和NE释放。因此，实验者可以使用廉价的多孔系统回答多个问题，该系统增加了测试样品的数量，从而减少了使用的动物数量。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

单胺类神经递质与许多神经系统和精神疾病有关。这些条件的动物模型已经显示出单胺神经递质释放和摄取动力学的改变。技术上复杂的方法，如电生理学，快速扫描循环伏安法（FSCV），成像，体内微透析，光遗传学或使用放射性是研究单胺功能所必需的。这里介绍的方法是一种优化的两步法，用于检测急性脑切片中的单胺释放，使用含有组织支架的48孔板来检测单胺释放，并使用高效液相色谱联用电化学检测（HPLC-ECD）进行单胺释放测量。简而言之，使用组织切片器或振动器获得包含感兴趣区域的大鼠脑切片，包括前额叶皮层，海马体和背纹状体。从整个大脑中解剖这些感兴趣的区域，并在含氧的生理缓冲液中孵育。在整个实验过程中，通过3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定法检查了活力。急性解剖的大脑区域在不同的药物条件下孵育，已知这些药物条件通过转运蛋白（苯丙胺）或通过活化胞细胞囊泡释放（KCl）诱导单胺释放。孵育后，收集上清液中释放的产物并通过HPLC-ECD系统进行分析。在这里，通过HPLC从急性脑切片中检测到基础单胺释放。该数据支持先前的体内和体外结果，表明AMPH和KCl诱导单胺释放。该方法对于研究与单胺转运蛋白依赖性释放相关的机制特别有用，并且提供了以快速和低成本的方式筛选影响单胺释放的化合物的机会。

该技术描述了使用脑切片来测量内源性单胺的释放，使用HPLC和基于具有内部组织支架的48孔板的电化学检测。实验设置如图 1 和 图2所示。最初，为了确保在实验结束时的组织活力，进行了MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物，四氮唑）测定。经过功能实验后，与与1%Triton X-100（细胞死亡条件）孵育的急性脑切...

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A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

该方法引入了一种使用急性脑切片检测内源性单胺释放的简单技术。该装置使用含有组织支架的48孔板进行单胺释放。释放的单胺通过HPLC结合电化学检测进行分析。此外，该技术还为药物发现提供了一种筛选方法。

一种基于板的测定法，用于测量急性脑切片中内源性单胺释放

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

该技术是对检查单胺释放的常用方法的改编，允许在多种药理条件下同时测量内源性释放而不是预加载放射性标记的单胺。该技术的主要优点是它具有相当的成本效益，可以一次检查多种药理条件，并且我们可以研究内源性单胺释放，并能够区分囊泡和转运蛋白介导的释放。从成年大鼠收获后制备250~350克雄性大鼠的脑切片，立即放置脑部和冰冷的含氧解剖缓冲液，并从每个感兴趣区域获取300微米的冠状脑切片。为了进一步解剖脑切片，小心地将组织移动到载玻片上，并使用大鼠脑图谱根据其深色条纹结构识别背纹状体，并根据其与皮层的接近程度及其独特的螺旋结构来识别海马体。将左右半球分开，以用作控制切片和实验切片。背纹状体可以进一步解剖成两毫米的冲头。然后使用带有改性尖端的塑料转移移液器将样品转移到浸入含氧冰冷解剖缓冲液中的小容器中，并带有氧气气泡。为了诱导单胺释放，将组织样品转移到定制的48孔外排室的每个孔中，每孔含有0.5至1毫升的外排缓冲液，并持续温和地冒泡，并允许样品在37摄氏度下恢复30至50分钟。在平衡期结束时，将带有脑组织的组织支架移动到含有500微升含氧外排缓冲液的孔中，有或没有药理剂，在孔的边缘敲击保持器以防止孔之间缓冲液的最小转移，在37摄氏度下孵育20分钟。在孵育结束时，将支架移动到一组含有500微升外排缓冲液的新孔中，无论是否具有感兴趣的药物，并将板返回细胞培养箱再放置20分钟。在第二次孵育期间，将溶液从第一次孵育的孔转移到含有50微升一种正常高氯酸或磷酸的微量离心管中，并标记第一号管"在第二次孵育结束时，将组织支架移动到带有冰板上的空孔中，并将第二次孵育的上清液转移到含有50微升正常高氯或磷酸的新微量离心管中冰上的酸。标记这些管二号"当所有上清液都转移后，向每个组织孔中加入一毫升冰冷解剖缓冲液，并使用小镊子将每个组织样品转移到新的微量离心管中。从样品管中取出缓冲液并将组织储存在零下80摄氏度，然后将收集的培养溶液转移到微量离心机过滤管中进行离心，并将滤液放在冰上直至HPLC分析。将ECD的电位和流速设置为制造商关于检测单胺的建议。将每个样品（包括神经递质标准品）的上样和适当的等分试样放入HPLC中，用于自动进样和检测，并允许仪器完成分析。然后使用HPLC分析软件，使用由每种单胺组成的标准曲线获取和分析色谱数据，以根据制造商的指南获得曲线下的面积。经过六小时的功能分析后，组织样品仍然存活，而用1%Triton X-100孵育的样品显示出MTT转化显着降低。用苯丙胺急性20分钟治疗海马和前额叶皮层脑切片可诱导每种单胺的细胞外水平显着增加。当用氟西汀（一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂）预处理样品时，苯丙胺诱导海马体内和前额叶皮层内细胞外5-羟色胺的增加不会发生，而细胞外多巴胺和去甲肾上腺素的产生不受影响。此外，用苯丙胺急性20分钟治疗背纹状体打孔可诱导细胞外多巴胺水平表达增加35倍，而用可卡因（一种单胺转运蛋白阻滞剂）进行背纹状体穿刺治疗可显着抑制苯丙胺诱导的细胞外多巴胺。与未经处理的对照条件相比，增加细胞外氯化钾的浓度以唤起膜去极化足以诱导单胺的胞吐释放，并且氟西汀和可卡因处理均不阻断这种深度极化诱导的增加。必须有干净的切割截面，精确定位冲头，并在整个实验过程中保持一致的氧合。实验后可以使用脑切片进行进一步的生化处理和分析，例如蛋白质印迹和组织学。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

钙成像的急性下区片的制备

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

科研

神经科学

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

双突触诱发的星形胶质细胞和神经元的反应，在急性海马脑片电生理记录

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

成神经细胞迁移的小鼠急性脑片在体内电穿孔产后和时间推移成像

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

神经微电路急性脑片电生理和形态特征采用配对膜片钳记录

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

用优化的n-甲基 d-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

在小鼠犁鼻急性组织切片定义细胞群的深入生理学分析

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

小容积回收-灌注-浸没式室系统中维持的急性海马切片的突触可塑性记录

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

自动图像引导贴片夹在脑切片神经元研究中的应用

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

成人脑切片长期抑郁症诱导评估

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...