Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud Fondecyt Initiation Fund N 11191049 til J.A.P. og NIH tilskud DA038598 til G.E.T.

Alle forsøg, herunder håndtering af dyr og vævsindsamling, blev udført i overensstemmelse med University of Florida og City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) efter den godkendte protokol 201508873 (UF) og 1071 (CCNY). For reagenser og buffer henvises til den supplerende fil.
1. Forbered akutte rotte hjerne skiver
BEMÆRK: I dette forsøg blev der anvendt voksne hanrotter (250-350 g). Denne opsætning er imidle...

Monoamin frigivelse målinger er blevet udført i årevis i en række systemer såsom heterologe celler, neuronale kulturer, hjernesynaptosomes, ex vivo akutte hjerne skiver, og hele dyr13,20,41,42,58,64,65,66,67,68</...

En overflod af neurologiske og psykiatriske sygdomme er forbundet med dysregulering eller utilstrækkelig vedligeholdelse af monoamin neurotransmitter (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homøostase1,2,3. Disse betingelser omfatter, men er ikke begrænset til, depression1,2, skizofreni2, angst2, afhængighed4, overgangsalderen5,6,7, pain8, og Parkinsons sygdom3. For eksempel har flere rottemodeller af overgangsalderen vist, at dysregulering eller reduktion af monoaminer inden for hippocampus, præfrontal cortex og striatum kan være forbundet med både depression og kognitiv tilbagegang, som ses hos kvinder, der oplever overgangsalderen. Dysreguleringen af monoaminer i disse modeller er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af HPLC-ECD, selv om undersøgelserne ikke diskriminerede mellem målt neurotransmitterindhold versus neurotransmitter release5,6,7. Monoaminer er klassisk frigives i ekstracellulære rum gennem Ca2 +-afhængige køretøj frigivelse9, og genbruges tilbage gennem deres respektive plasmamembran re-optagelse system (dopamin transporter, DAT; serotonin transporter, SERT; noradrenalin transporter, NET)10,11. Omvendt tyder data på, at disse transportører er i stand til at frigive eller efflux monoaminer, da stoffer af misbrug såsom amfetamin (AMPH) og 3,4-Methylenedioxymethamfetamin (MDMA) er kendt for at frigive DA og 5-HT, henholdsvis gennem deres transportsystemer12,13,14,15,16,17 . Således er en ordentlig mekanistisk forståelse af monoaminfrigivelsesdynamik afgørende for at udvikle specifikke og målrettede farmakokterapier.
En bred vifte af teknikker er blevet anvendt til at studere monoamin frigivelse såsom Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo mikrodialyse13, imaging19, præincubation med radiolabeled monoaminer20, optogenetik, og for nylig, genetisk kodede fluorescerende sensorer og fotometri21,22 . FSCV og in vivo mikrodialyse er de primære teknikker, der anvendes til at studere monoamin frigivelse. FSCV bruges til at studere den stimulerede eksocytotiske frigivelse af primært DA i akutte hjerneskiver og in vivo23. Fordi FSCV bruger elektroder til at stimulere eller fremkalde frigivelse, den primære kilde til neurotransmitter frigivelse er Ca2 +-afhængige køretøj frigivelse18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialyse kombineret med HPLC måler ændringer i ekstracellulære neurotransmitter niveauer ved hjælp af en sonde placeret i et hjerneområde af interesse13,32. Svarende til FSCV, en stor begrænsning for in vivo mikrodialyse er vanskeligheden ved at bestemme kilden til neurotransmitter frigivelse: Ca2 + afhængige køretøjsudløsning eller transporter afhængig. Bemærkelsesværdigt, begge metoder giver mulighed for direkte måling af monoamin frigivelse. Gennem den seneste udvikling af optogenetik, forskning viser påvisning af 5-HT og DA frigivelse i en kort tidshorisont med udsøgt celle-type specificitet21,22. Men, disse strategier kræver komplekse og dyre teknikker og udstyr, og indirekte måle monoamin frigivelse, specifikt gennem monoamin bindende for receptorer. Desuden bruges radiomærkede monoaminer også til at studere monoamindynamik. Radiomærkede monoaminer kan forudindlæses i forskellige modelsystemer såsom heterologe celler, der overekspresserer hver monoamintransporter20,33,34,35,36,37,38,39,40, primære neuroner20, synaptoomer33,39,41, 42, og akut hjerne skiver43,44. Men, radioaktivitet udgør potentiel skade for eksperimentatoren, og tritium-mærket analytter kan ikke trofast generobre endogene monoamin dynamik45,46. Superfusionssystemer kombineret med offlinedetekteringsmetoder som HPLC-ECD har gjort det muligt at påektionere monoaminer fra flere vævskilder. Her giver denne protokol som en optimeret og billig, enkel og præcis metode ved hjælp af akutte hjerneskiver til direkte at måle endogene basal og stimuleret monoaminfrigivelse.
Akutte hjerneskive giver mulighed for at teste mekanistiske hypoteser, primært når de bevarer in vivo anatomiske mikromiljø, og opretholder intakte synapser47,48,49,50,51,52. I nogle få undersøgelser er akutte hjerneskiver eller hakket hjernevæv blevet brugt sammen med en superfusionsteknik ved hjælp af KCl til at stimulere Ca2+ medieret frigivelse53,54,55,56. Superfusion systemer har været afgørende for at fremme feltets forståelse af neurotransmitter frigivelse mekanismer, herunder monoaminer. Disse systemer er imidlertid relativt dyre, og antallet af kamre til rådighed til vævsanalyse varierer fra 4-12. Til sammenligning er den metode, der præsenteres her, billig, tillader måling af 48 vævsprøver og kan raffineres til at bruge op til 96 vævsprøver. Hver brønd i 48-brøndspladen indeholder vævsholdere, der bruger filtre til at adskille det frigivne produkt fra vævet, og frigivne monoaminer indsamles og analyseres derefter af HPLC-ECD. Vigtigere er det, at denne metode giver mulighed for samtidig måling af 5-HT, DA og NE-frigivelse fra forskellige hjerneområder som den præfrontale cortex, hippocampus og dorsale striatum efter behandling med farmakologiske midler, der modulerer monoaminfrigivelse. Således kan forsøgspersonen besvare flere spørgsmål ved hjælp af et billigt multi-brønd-system, der øger antallet af testede prøver og dermed reducerer antallet af anvendte dyr.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

Monoamin neurotransmittere er forbundet med mange neurologiske og psykiatriske lidelser. Dyremodeller af sådanne forhold har vist ændringer i monoamin neurotransmitter frigivelse og optagelse dynamik. Teknisk komplekse metoder såsom elektrofysiologi, Hurtig ScanningCyclic Voltammetry (FSCV), billeddannelse, in vivo mikrodialyse, optogenetik, eller brug af radioaktivitet er påkrævet for at studere monoamin funktion. Metoden præsenteres her er en optimeret to-trins tilgang til påvisning af monoamin frigivelse i akutte hjerne skiver ved hjælp af en 48-brønd plade, der indeholder vævsholdere til undersøgelse af monoamin frigivelse, og højtydende flydende kromatografi kombineret med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) til monoamin frigivelse måling. Kort sagt blev rottehjerneafsnit, der indeholder områder af interesse, herunder præfrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum opnået ved hjælp af en vævsudsnitsbehandler eller vibratom. Disse interesseområder blev dissekeret fra hele hjernen og inkuberet i en iltet fysiologisk buffer. Levedygtigheden blev undersøgt i løbet af forsøgstiden ved 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. De akut dissekerede hjerneområder blev inkuberet under forskellige lægemiddelforhold, der vides at fremkalde monoaminfrigivelse gennem transportøren (amfetamin) eller gennem aktivering af eksocytotisk køretøjsfrigivelse (KCl). Efter inkubation blev de frigivne produkter i supernatanten indsamlet og analyseret gennem et HPLC-ECD-system. Her, basal monoamin frigivelse detekteres af HPLC fra akutte hjerne skiver. Disse data understøtter tidligere in vivo- og in vitro-resultater, der viser, at AMPH og KCl fremkalder monoaminfrigivelse. Denne metode er især nyttig til at studere mekanismer forbundet med monoamin transporter-afhængige frigivelse og giver mulighed for at screene forbindelser, der påvirker monoamin frigivelse i en hurtig og billig måde.

Denne teknik beskriver brugen af hjerneskiver til at måle frigivelsen af endogene monoaminer ved hjælp af HPLC med elektrokemisk detektion baseret i en 48-brønds plade med en indvendig vævsholder. Eksperimentel opsætning er afbildet i figur 1 og figur 2. For at sikre vævs levedygtighed ved forsøgets afslutning blev der i første omgang udført en MTT-analyse (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Efte...

Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Denne metode introducerer en simpel teknik til påvisning af endogene monoamin frigivelse ved hjælp af akutte hjerne skiver. Opsætningen bruger en 48-brønd plade, der indeholder en vævsholder til monoamin frigivelse. Frigivet monoamin analyseres af HPLC kombineret med elektrokemisk detektion. Derudover, denne teknik giver en screening metode til opdagelse af lægemidler.

En pladebaseret analyse til måling af endogen monoaminfrigivelse i akutte hjerneskiver

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Denne teknik er en tilpasning af almindeligt anvendte metoder til undersøgelse af monoamin frigivelse, så måling af endogene frigivelse snarere end forudindlæste radiomærkede monoaminer under flere farmakologiske tilstande på én gang. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det er ret omkostningseffektivt, flere farmakologiske tilstande kan undersøges på én gang, og vi kan studere endogene monoaminfrigivelse med evnen til at skelne mellem køretøjs- og transportmiddelmedieret frigivelse. For at forberede hjerneskiver fra voksne 250 til 350 gram hanrotter efter høst, placerede straks hjernen og iskold iltet dissektionsbuffer og erhverve 300 mikron koronar hjerne sektioner fra hver region af interesse.For yderligere dissektion af hjernen skiver, omhyggeligt flytte væv til glas dias og bruge en rotte hjerne atlas til at identificere dorsale striatum baseret på sin mørke striated struktur, og at identificere hippocampus baseret på dens nærhed til cortex og dens unikke spiral struktur. Adskil højre og venstre halvkugle til deres brug som kontrol og eksperimentelle skiver. Den dorsale striatum kan yderligere dissekeres i to millimeter slag.Brug derefter en plastoverførselspipette med et modificeret tip til at overføre prøverne til små beholdere nedsænket i iltet iskold dissektionsbuffer med ilt boblende. For at fremkalde monoamin frigivelse, overføre vævsprøver til hver brønd af en specialfremstillet 48 godt efflux kammer, der indeholder 0,5 til en milliliter efflux buffer per brønd med konstant blid boblende og lad prøverne til at inddrive i 30 til 50 minutter ved 37 grader Celsius. I slutningen af ekvilibreringsperioden flyttes vævsholderen med hjernevæv til brønde, der indeholder 500 mikroliter af iltet effluxbuffer med eller uden farmakologisk middel, og tappe holderen på kanten af brønden for at forhindre minimal overførsel af buffer mellem brønde i en 20 minutters inkubation ved 37 grader Celsius.I slutningen af inkubationen flyttes holderen til et nyt sæt brønde, der indeholder 500 mikroliter efflux buffer med eller uden lægemiddel af interesse og returnerer pladen til cellekulturinkubatoren i yderligere 20 minutter. Under den anden inkubation overføres opløsningen fra brøndene fra den første inkubation til mikrocentrifugrør, der indeholder 50 mikroliters af en normal perchlorsyre eller fosforsyre på is, og mærkes rørene nummer et "Ved afslutningen af den anden inkubation flyttes vævsholderen til tomme brønde med pladen på is og overfør supernatanterne fra den anden inkubation til nye mikrocentrifugerør, der indeholder 50 mikrolitere af en normal perchlor eller fosforholdig syre på is. Mærk disse rør nummer to"Når alle supernatanterne er blevet overført, tilsættes en milliliter iskold dissektionsbuffer til hver brønd af væv og brug små pincet til at overføre hver vævsprøve til et nyt mikrocentrifugerør.Fjern bufferen fra prøverørene, og opbevar vævene ved minus 80 grader Celsius, og overfør derefter de indsamlede inkubationsløsninger til mikrocentrifugfilterrør til centrifugering, og læg filtratet på is indtil HPLC-analyse. Indstil potentialet i ECD og flowhastighed til producentens anbefaling til påvisning af monoaminer. Belastning og passende aliquot af hver prøve, herunder neuro-transmitter standarder i HPLC til automatisk injektion og detektion og gøre det muligt for instrumentet at fuldføre analysen.Brug derefter HPLC-analysesoftwaren til at erhverve og analysere kromatografdataene ved hjælp af en standardkurve bestående af hver monoamin for at opnå området under kurven baseret på producentens retningslinjer. Efter seks timers funktionel analyse forbliver vævsprøver levedygtige, mens prøver inkuberet med 1%Triton X-100 viser en betydelig reduktion i MTT-transformation. Akut 20 minutters behandling af hippocampal og præfrontale cortex hjerne sektioner med amfetamin fremkalder en betydelig stigning i det ekstracellulære niveau af hver monoamin.Når prøverne er forbehandlet med fluoxetin, en selektiv serotonin re-uptake hæmmer, amfetamin induceret stigning i ekstracellulære serotonin i hippocampus og præfrontale cortex ikke forekommer, mens stigningen i ekstracellulære dopamin og noradrenalin produktion ikke påvirkes. Derudover fremkalder akut 20 minutters behandling af dorsale striatumslag med amfetamin en 35 gange stigning i ekstracellulært dopaminniveauudtryk, mens dorsal striatum punchbehandling med kokain, en monoamintransporterblokker, resulterer i en betydelig hæmning af amfetamin induceret ekstracellulær dopamin. Øget koncentration af ekstracellulært kaliumchlorid for at fremkalde membrandepolarisering er tilstrækkelig til at fremkalde eksocytotisk frigivelse af monoaminer sammenlignet med ubehandlede kontrolforhold, og hverken fluoxetin eller kokainbehandling blokerer denne dybe polariseringsinducerede stigning.Det er bydende nødvendigt at have rene snit sektioner, en præcis lokalisering af slag, og at opretholde konsekvent iltning i hele eksperimentet. Hjernen sektioner kan anvendes post eksperimenter for yderligere biokemisk behandling og analyse, såsom vestlige blotting og histologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Fremstilling af akutte Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Fødselsdepression Elektroporation og Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Mouse Akut hjerneskiver

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrofysiologiske og morfologiske karakterisering af neuronal Mikrokredsløb i akut Brain Skiver Brug parrede Patch-clamp optagelser

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Forberedelse af akut hjernen skiver bruger en optimeret N-Methyl-D-glucamine beskyttende genoprettelsesmetode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dybdegående Fysiologisk Analyse af Definerede Cell populationer i Akut Tissue Skiver af Mouse vomeronasale organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Anvendelse af automatiseret billedstyret patchklemme til undersøgelse af neuroner i hjerneskiver

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...