Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions Fondecyt Initiation Fund N 11191049 à J.A.P. et niH grant DA038598 à G.E.T.

Toutes les expériences, y compris la manipulation des animaux et la collecte de tissus, ont été menées conformément à l’Université de Floride et au City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), conformément aux protocoles approuvés 201508873 (UF) et 1071 (CCNY). Pour les réactifs et la mémoire tampon, reportez-vous au fichier supplémentaire.
1. Préparez des tranches de cerveau de rat aiguës
REMARQUE: Dan...

Des mesures de libération de monoamine ont été effectuées pendant des années dans un certain nombre de systèmes tels que les cellules hétérologues, les cultures neuronales, les synaptosomes cérébraux, les tranches cérébrales aiguës ex vivo et les animaux entiers13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 </sup...

Une pléthore de maladies neurologiques et psychiatriques sont associées à un dérèglement ou à un entretien insuffisant du neurotransmetteur monoamine (dopamine [DA], sérotonine [5-HT], noradrénaline [NE]) homéostasie1,2,3. Ces conditions comprennent, sans toutefois s’y limiter, la dépression1,2, la schizophrénie2, l’anxiété2, la dépendance4, la ménopause5,6,7, la douleur8 et la maladie de Parkinson3. Par exemple, plusieurs modèles de ménopause chez le rat ont montré que le dérèglement ou la réduction des monoamines dans l’hippocampe, le cortex préfrontal et le striatum peut être associé à la dépression et au déclin cognitif, ce qui est observé chez les femmes ménopausées. La dérégulation des monoamines dans ces modèles a été largement examinée à l’aide de HPLC-ECD, bien que les études n’aient pas fait de distinction entre la teneur mesurée en neurotransmetteurs et la libération de neurotransmetteurs5,6,7. Les monoamines sont classiquement libérées dans l’espace extracellulaire par libération vésiculeuse dépendante du Ca2+9 et sont recyclées par leur système de recapture de la membrane plasmique respectif (transporteur de dopamine, DAT; transporteur de sérotonine, SERT; transporteur de noradrénaline, NET)10,11. Inversement, les données suggèrent que ces transporteurs sont capables de libérer ou d’efflux des monoamines, puisque les drogues d’abus telles que l’amphétamine (AMPH) et la 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA) sont connues pour libérer du DA et du 5-HT, respectivement par le biais de leurs systèmes de transport12,13,14,15,16,17 . Ainsi, une bonne compréhension mécaniste de la dynamique de libération de monoamine est cruciale pour développer des pharmacothérapies spécifiques et ciblées.
Un large éventail de techniques ont été utilisées pour étudier la libération de monoamines telles que la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV)18, la microdialyse in vivo13, l’imagerie19, la préincubation avec des monoamines radiomarquées20, l’optogénétique et, plus récemment, les capteurs fluorescents et la photométrie génétiquement codés21,22 . Le FSCV et la microdialyse in vivo sont les principales techniques utilisées pour étudier la libération de monoamines. Le FSCV est utilisé pour étudier la libération exocytotique stimulée de DA principalement dans les tranches cérébrales aiguës et in vivo23. Étant donné que le FSCV utilise des électrodes pour stimuler ou évoquer la libération, la principale source de libération de neurotransmetteurs est la libération vésiculeuse dépendante du Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdialyse in vivo couplée à la CLHP mesure les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires à l’aide d’une sonde placée dans une zone d’intérêt cérébral13,32. Comme pour le FSCV, une limitation majeure de la microdialyse in vivo est la difficulté de déterminer la source de libération de neurotransmetteurs: libération vésiculeuse dépendante de Ca2+ ou dépendante du transporteur. Il convient de noter que les deux méthodes permettent de mesurer directement la libération de monoamine. Grâce aux progrès récents de l’optogénétique, la recherche démontre la détection de la libération de 5-HT et de DA dans un court laps de temps avec une spécificité de type cellulaire exquise21,22. Cependant, ces stratégies nécessitent des techniques et de l’équipement complexes et coûteux, et mesurent indirectement la libération de monoamine, en particulier par la liaison de la monoamine aux récepteurs. En outre, les monoamines radiomarquées sont également utilisées pour étudier la dynamique des monoamines. Les monoamines radiomarquées peuvent être préchargées dans divers systèmes modèles tels que les cellules hétérologues surexprimant chaque transporteur de monoamine20,33,34,35,36,37,38,39,40, les neurones primaires20, les synaptosomes33,39,41, 42, et des tranches de cerveau aiguës43,44. Cependant, la radioactivité présente des dommages potentiels pour l’expérimentateur, et les analytes marqués au tritium peuvent ne pas récapituler fidèlement la dynamique endogène de la monoamine45,46. Les systèmes de superfusion combinés à des méthodes de détection hors ligne telles que HPLC-ECD ont permis la détection de monoamines provenant de sources tissulaires multiples. Ici, ce protocole fournit une méthode optimisée et peu coûteuse, simple et précise utilisant des tranches cérébrales aiguës pour mesurer directement la libération endogène basale et stimulée de monoamine.
Les tranches cérébrales aiguës permettent de tester des hypothèses mécanistes, principalement car elles préservent le microenvironnement anatomique in vivo et maintiennent intactes les synapses47,48,49,50,51,52. Dans quelques études, des tranches cérébrales aiguës ou du tissu cérébral haché ont été utilisés en conjonction avec une technique de superfusion utilisant KCl pour stimuler la libération médiée par Ca2+53,54,55,56. Les systèmes de superfusion ont été essentiels pour faire progresser la compréhension du domaine des mécanismes de libération de neurotransmetteurs, y compris les monoamines. Cependant, ces systèmes sont relativement coûteux et le nombre de chambres disponibles pour l’analyse des tissus varie de 4 à 12. En comparaison, la méthode présentée ici est peu coûteuse, permet la mesure de 48 échantillons de tissus et peut être affinée pour utiliser jusqu’à 96 échantillons de tissus. Chaque puits dans la plaque de 48 puits contient des porte-tissus qui utilisent des filtres pour séparer le produit libéré du tissu, et les monoamines libérées sont ensuite collectées et analysées par HPLC-ECD. Il est important de noter que cette méthode permet de mesurer simultanément la libération de 5-HT, DA et NE de différentes zones du cerveau telles que le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal après traitement avec des agents pharmacologiques qui modulent la libération de monoamine. Ainsi, l’expérimentateur peut répondre à plusieurs questions à l’aide d’un système multi-puits peu coûteux qui augmente le nombre d’échantillons testés et réduit ainsi le nombre d’animaux utilisés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

Les neurotransmetteurs monoamines sont associés à de nombreuses affections neurologiques et psychiatriques. Des modèles animaux de telles conditions ont montré des altérations de la libération de neurotransmetteurs monoamines et de la dynamique d’absorption. Des méthodes techniquement complexes telles que l’électrophysiologie, la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV), l’imagerie, la microdialyse in vivo, l’optogénétique ou l’utilisation de la radioactivité sont nécessaires pour étudier la fonction de la monoamine. La méthode présentée ici est une approche optimisée en deux étapes pour détecter la libération de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës à l’aide d’une plaque de 48 puits contenant des supports de tissu pour examiner la libération de monoamine, et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection électrochimique (HPLC-ECD) pour la mesure de la libération de monoamine. En bref, des coupes cérébrales de rats contenant des régions d’intérêt, y compris le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal, ont été obtenues à l’aide d’un slicer tissulaire ou d’un vibratome. Ces régions d’intérêt ont été disséquées de tout le cerveau et incubées dans un tampon physiologique oxygéné. La viabilité a été examinée tout au long de la période expérimentale, par un essai de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les régions cérébrales disséquées de manière aiguë ont été incubées dans diverses conditions médicamenteuses connues pour induire la libération de monoamine par le transporteur (amphétamine) ou par l’activation de la libération vésiculeuse exocytotique (KCl). Après l’incubation, les produits libérés dans le surnageant ont été collectés et analysés à l’aide d’un système HPLC-ECD. Ici, la libération de monoamine basale est détectée par HPLC à partir de tranches cérébrales aiguës. Ces données corroborent les résultats in vivo et in vitro antérieurs montrant que l’AMPH et le KCl induisent la libération de monoamines. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les mécanismes associés à la libération dépendante du transporteur de monoamine et offre la possibilité de filtrer les composés affectant la libération de monoamine de manière rapide et peu coûteuse.

Cette technique décrit l’utilisation de tranches cérébrales pour mesurer la libération de monoamines endogènes à l’aide de la CLHP avec détection électrochimique basée sur une plaque de 48 puits avec un support de tissu interne. La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1 et à la figure 2. Initialement, pour assurer la viabilité des tissus à la fin de l’expérimentation, un essai MTT (3-(4,5-di...

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A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Cette méthode introduit une technique simple pour la détection de la libération endogène de monoamine à l’aide de tranches cérébrales aiguës. La configuration utilise une plaque de 48 puits contenant un support de tissu pour la libération de monoamine. La monoamine libérée est analysée par CLHP couplée à une détection électrochimique. De plus, cette technique fournit une méthode de dépistage pour la découverte de médicaments.

Un test sur plaque pour la mesure de la libération endogène de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Cette technique est une adaptation des méthodes couramment utilisées pour examiner la libération de monoamine, permettant la mesure de la libération endogène plutôt que des monoamines radiomarquées préchargées dans plusieurs conditions pharmacologiques à la fois. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est assez rentable, que plusieurs conditions pharmacologiques peuvent être examinées à la fois et que nous pouvons étudier la libération endogène de monoamine avec la capacité de distinguer la libération vésiculeuse de la libération médiée par le transporteur. Pour préparer des tranches de cerveau de rats mâles adultes de 250 à 350 grammes après la récolte, placez immédiatement le cerveau et le tampon de dissection oxygéné glacé et acquérez des sections cérébrales coronales de 300 microns de chaque région d’intérêt.Pour une dissection plus poussée des tranches de cerveau, déplacez soigneusement les tissus vers des lames de verre et utilisez un atlas du cerveau de rat pour identifier le striatum dorsal en fonction de sa structure striée sombre et pour identifier l’hippocampe en fonction de sa proximité avec le cortex et de sa structure spirale unique. Séparez les hémisphères droit et gauche pour leur utilisation comme tranches de contrôle et expérimentales. Le striatum dorsal peut être disséqué en poinçons de deux millimètres.Utilisez ensuite une pipette de transfert en plastique avec une pointe modifiée pour transférer les échantillons dans de petits récipients immergés dans un tampon de dissection glacé oxygéné avec bouillonnement d’oxygène. Pour induire la libération de monoamine, transférez les échantillons de tissus dans chaque puits d’une chambre d’efflux de 48 puits faite sur mesure contenant de 0,5 à un millilitre de tampon d’efflux par puits avec un bouillonnement doux constant et laissez les échantillons récupérer pendant 30 à 50 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la période d’équilibrage, déplacez le porte-tissu avec le tissu cérébral vers des puits contenant 500 microlitres de tampon d’efflux oxygéné avec ou sans agent pharmacologique, en tapotant le support sur le bord du puits pour éviter le transfert minimal de tampon entre les puits pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, déplacez le support vers un nouvel ensemble de puits contenant 500 microlitres de tampon d’efflux avec ou sans le médicament d’intérêt et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 20 minutes supplémentaires. Au cours de la deuxième incubation, transférer la solution des puits de la première incubation dans des tubes de microcentrifugation contenant 50 microlitres d’un acide perchlorique ou phosphorique normal sur de la glace, et étiqueter les tubes numéro un"À la fin de la deuxième incubation, déplacer le porte-tissu dans des puits vides avec la plaque sur glace et transférer les surnageants de la deuxième incubation vers de nouveaux tubes de microcentrifugation contenant 50 microlitres d’un perchlorique ou phosphorique normal acide sur glace. Étiquetez ces tubes numéro deux"Lorsque tous les surnageants ont été transférés, ajoutez un millilitre de tampon de dissection glacé à chaque puits de tissu et utilisez une petite pince à épiler pour transférer chaque échantillon de tissu dans un nouveau tube de microcentrifugation.Retirez le tampon des tubes d’échantillonnage et stockez les tissus à moins 80 degrés Celsius, puis transférez les solutions d’incubation collectées dans des tubes filtrants en microcentrifugation pour la centrifugation et placez le filtrat sur de la glace jusqu’à l’analyse CLHP. Réglez le potentiel de l’ECD et le débit sur la recommandation du fabricant pour la détection des monoamines. Charge et aliquote appropriée de chaque échantillon, y compris les étalons de neurotransmetteur dans la CLHP pour l’injection et la détection automatiques et permettent à l’instrument de terminer l’analyse.Ensuite, utilisez le logiciel d’analyse HPLC pour acquérir et analyser les données de chromatographie à l’aide d’une courbe standard composée de chaque monoamine pour obtenir l’aire sous la courbe en fonction des directives du fabricant. Après six heures d’analyse fonctionnelle, les échantillons de tissus restent viables, tandis que les échantillons incubés avec 1% de Triton X-100 démontrent une réduction significative de la transformation MTT. Le traitement aigu de 20 minutes des sections cérébrales de l’hippocampe et du cortex préfrontal avec des amphétamines induit une augmentation significative du niveau extracellulaire de chaque monoamine.Lorsque les échantillons sont prétraités avec de la fluoxétine, un inhibiteur sélectif du recaptage de la sérotonine, l’augmentation induite par l’amphétamine de la sérotonine extracellulaire dans l’hippocampe et le cortex préfrontal ne se produit pas, tandis que l’augmentation de la production extracellulaire de dopamine et de noradrénaline n’est pas affectée. En outre, le traitement aigu de 20 minutes des poinçons de striatum dorsal avec de l’amphétamine induit une augmentation de 35 fois de l’expression extracellulaire du niveau de dopamine, tandis que le traitement du punch striatum dorsal avec de la cocaïne, un bloqueur de transporteur de monoamine, entraîne une inhibition significative de la dopamine extracellulaire induite par les amphétamines. L’augmentation de la concentration de chlorure de potassium extracellulaire pour évoquer la dépolarisation membranaire est suffisante pour induire la libération exocytotique de monoamines par rapport aux conditions de contrôle non traitées, et ni la fluoxétine ni le traitement à la cocaïne ne bloquent cette augmentation induite par la polarisation profonde.Il est impératif d’avoir des sections de coupe propres, une localisation précise des poinçons et de maintenir une oxygénation constante tout au long de l’expérience. Les sections du cerveau peuvent être utilisées après l’expérimentation pour d’autres traitements et analyses biochimiques, tels que le transfert western et l’histologie.

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