Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
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इस काम को अनुदान Fondecyt दीक्षा निधि एन जे.ए.पी. और एनआईएच अनुदान DA038598 को G.E.T. के लिए 11191049 द्वारा समर्थित किया गया था।

पशु हैंडलिंग और ऊतक संग्रह सहित सभी प्रयोगों को फ्लोरिडा विश्वविद्यालय और सिटी कॉलेज ऑफ न्यूयॉर्क इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) के अनुसार किया गया था, जो अनुमोदित प्रोटोकॉल 201508873 (?...

मोनोमाइन रिलीज माप कई प्रणालियों जैसे हेटरोलॉगस कोशिकाओं, न्यूरोनल संस्कृतियों, मस्तिष्क synaptosomes, पूर्व विवो तीव्र मस्तिष्क स्लाइस, और पूरे जानवरों में वर्षों से किया गया है13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<sup class...

न्यूरोलॉजिकल और मनोवैज्ञानिक रोगों की एक बहुतायत मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर (डोपामाइन [डीए], सेरोटोनिन [5-एचटी], नॉरपेनेफ्रिन [एनई]) होमियोस्टैसिस 1,2,3 के असंतुलन या अपर्याप्त रखरखाव से जुड़ी हुई है। इन स्थितियों में शामिल हैं, लेकिन अवसाद 1,2, सिज़ोफ्रेनिया 2, चिंता 2, लत 4, रजोनिवृत्ति 5,6,7, दर्द 8, और पार्किंसंस रोग 3 तक सीमित नहीं हैं। उदाहरण के लिए, रजोनिवृत्ति के कई चूहे मॉडलों से पता चला है कि हिप्पोकैम्पस, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स और स्ट्रिएटम के भीतर मोनोमाइन की विकृति या कमी अवसाद और संज्ञानात्मक गिरावट दोनों से जुड़ी हो सकती है, जो रजोनिवृत्ति का अनुभव करने वाली महिलाओं में देखी जाती है। इन मॉडलों में मोनोमाइन्स के विनियमन की बड़े पैमाने पर एचपीएलसी-ईसीडी का उपयोग करके जांच की गई है, हालांकि अध्ययनों ने मापा न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री बनाम न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 5,6,7 के बीच भेदभाव नहीं किया है। Monoamines शास्त्रीय रूप से Ca2 + - निर्भर vesicular release9 के माध्यम से extracellular अंतरिक्ष में जारी कर रहे हैं, और उनके संबंधित प्लाज्मा झिल्ली पुन: अपटेक प्रणाली (डोपामाइन ट्रांसपोर्टर, DAT; सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर, SERT; नॉरपेनेफ्रिन ट्रांसपोर्टर, नेट) 10,11 के माध्यम से वापस पुनर्नवीनीकरण कर रहे हैं। इसके विपरीत, डेटा से पता चलता है कि ये ट्रांसपोर्टर मोनोमाइन को जारी करने या एफीलैक्स करने में सक्षम हैं, क्योंकि एम्फ़ैटेमिन (एएमपीएच) और 3,4-मेथिलेनेडियोक्सीमेथेमफेटामाइन (एमडीएमए) जैसे दुरुपयोग की दवाओं को क्रमशः डीए और 5-एचटी जारी करने के लिए जाना जाता है, क्रमशः उनके ट्रांसपोर्टर सिस्टम 12,13,14,15,16,17 के माध्यम से। . इस प्रकार, मोनोमाइन रिलीज गतिशीलता की एक उचित यांत्रिक समझ विशिष्ट और लक्षित फार्माकोथेरेपी विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला को मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है जैसे फास्ट स्कैन चक्रीय वोल्टमेट्री (एफएससीवी) 18, विवो माइक्रोडायलिसिस 13, इमेजिंग 19, रेडियोलेबल मोनोमाइन्स 20 के साथ प्रीइनक्यूबेशन, ऑप्टोजेनेटिक्स, और हाल ही में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट सेंसर और फोटोमेट्री 21,22 . एफएससीवी और विवो माइक्रोडायलिसिस में मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्राथमिक तकनीकें हैं। FSCV का उपयोग मुख्य रूप से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में और vivo23 में डीए के उत्तेजित एक्सोसाइटोटिक रिलीज का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। क्योंकि FSCV इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए उत्तेजित या रिलीज पैदा करता है, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज का प्राथमिक स्रोत Ca2 + निर्भर vesicular रिलीज 18,24,25,26,27,28,29,30,31 है . विवो माइक्रोडायलिसिस में एचपीएलसी के साथ मिलकर ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र में रखी गई जांच का उपयोग करके एक्स्ट्रासेल्युलर न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में परिवर्तन को मापता है13,32। एफएससीवी के समान, विवो माइक्रोडायलिसिस में एक प्रमुख सीमा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के स्रोत को निर्धारित करने में कठिनाई है: Ca2 + निर्भर वेसिकुलर रिलीज या ट्रांसपोर्टर निर्भर। उल्लेखनीय है, दोनों विधियां मोनोमाइन रिलीज के प्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देती हैं। ऑप्टोजेनेटिक्स की हालिया प्रगति के माध्यम से, अनुसंधान उत्कृष्ट सेल-प्रकार की विशिष्टता 21,22 के साथ एक छोटे से समय में 5-एचटी और डीए रिलीज का पता लगाने का प्रदर्शन करता है। हालांकि, इन रणनीतियों को जटिल और महंगी तकनीकों और उपकरणों की आवश्यकता होती है, और अप्रत्यक्ष रूप से मोनोमाइन रिलीज को मापते हैं, विशेष रूप से रिसेप्टर्स के लिए मोनोमाइन बाइंडिंग के माध्यम से। इसके अलावा, रेडियोलेबल मोनोमाइन का उपयोग मोनोमाइन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। रेडियोलेबल मोनोमाइन को विभिन्न मॉडल प्रणालियों में प्रीलोडेड किया जा सकता है जैसे कि हेटरोलॉगस कोशिकाएं प्रत्येक मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर 20,33,34,35,36,37,38,39,40, प्राथमिक न्यूरॉन्स 20, synaptosomes33,39,41, 42, और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस43,44। हालांकि, रेडियोधर्मिता प्रयोगकर्ता को संभावित नुकसान पहुंचाती है, और ट्रिटियम-लेबल वाले एनालिस्ट्स अंतर्जात मोनोमाइन गतिशीलता 45,46 को ईमानदारी से पुनरावृत्ति नहीं कर सकते हैं। HPLC-ECD जैसे ऑफ-लाइन डिटेक्शन विधियों के साथ संयुक्त सुपरफ्यूजन सिस्टम ने कई ऊतक स्रोतों से मोनोमाइन का पता लगाने की अनुमति दी है। यहां, यह प्रोटोकॉल सीधे अंतर्जात बेसल और उत्तेजित मोनोमाइन रिलीज को मापने के लिए तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके एक अनुकूलित और कम लागत, सरल और सटीक विधि के रूप में प्रदान करता है।
तीव्र मस्तिष्क स्लाइस यंत्रवत परिकल्पनाओं के परीक्षण के लिए अनुमति देते हैं, मुख्य रूप से क्योंकि वे विवो संरचनात्मक माइक्रोएन्वायरमेंट में संरक्षित करते हैं, और बरकरार synapses47,48,49,50,51,52 बनाए रखते हैं। कुछ अध्ययनों में, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस या कटे हुए मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग केसीएल का उपयोग करके एक सुपरफ्यूजन तकनीक के साथ संयोजन के रूप में किया गया है ताकि Ca2 + मध्यस्थता रिलीज 53,54,55,56 को उत्तेजित किया जा सके। सुपरफ्यूजन सिस्टम न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज तंत्र के क्षेत्र की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है, जिसमें मोनोमाइन भी शामिल हैं। हालांकि, ये प्रणालियां अपेक्षाकृत महंगी हैं, और ऊतक विश्लेषण के लिए उपलब्ध कक्षों की संख्या 4-12 तक है। इसकी तुलना में, यहां प्रस्तुत विधि सस्ती है, 48 ऊतक नमूनों के माप की अनुमति देती है, और 96 ऊतक नमूनों का उपयोग करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है। 48-अच्छी तरह से प्लेट के भीतर प्रत्येक अच्छी तरह से ऊतक धारक होते हैं जो ऊतक से जारी उत्पाद को अलग करने के लिए फिल्टर का उपयोग करते हैं, और जारी मोनोमाइन को फिर एचपीएलसी-ईसीडी द्वारा एकत्र और विश्लेषण किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह विधि विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय स्ट्रिएटम से 5-एचटी, डीए और एनई रिलीज के एक साथ माप की अनुमति देती है, जो औषधीय एजेंटों के साथ उपचार के बाद मोनोमाइन रिलीज को संशोधित करती है। इस प्रकार, प्रयोगकर्ता एक सस्ती बहु-अच्छी तरह से प्रणाली का उपयोग करके कई सवालों के जवाब दे सकता है जो परीक्षण किए गए नमूनों की संख्या को बढ़ाता है और इस प्रकार उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर कई न्यूरोलॉजिकल और मनोवैज्ञानिक बीमारियों से जुड़े हुए हैं। इस तरह की स्थितियों के पशु मॉडल ने मोनोमाइन न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और अपटेक गतिशीलता में परिवर्तन दिखाया है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, फास्ट स्कैन चक्रीय वोल्टमेट्री (एफएससीवी), इमेजिंग, विवो माइक्रोडायलिसिस, ऑप्टोजेनेटिक्स, या रेडियोधर्मिता के उपयोग जैसे तकनीकी रूप से जटिल तरीकों को मोनोमाइन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। यहां प्रस्तुत विधि मोनोमाइन रिलीज की जांच के लिए ऊतक धारकों वाले 48-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करके तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में मोनोमाइन रिलीज का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित दो-चरणीय दृष्टिकोण है, और मोनोमाइन रिलीज माप के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन (एचपीएलसी-ईसीडी) के साथ मिलकर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी। संक्षेप में, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, हिप्पोकैम्पस और पृष्ठीय स्ट्रिएटम सहित रुचि के क्षेत्रों वाले चूहे के मस्तिष्क वर्गों को ऊतक स्लाइसर या वाइब्रेटोम का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। ब्याज के इन क्षेत्रों को पूरे मस्तिष्क से विच्छेदित किया गया था और एक ऑक्सीजन युक्त शारीरिक बफर में इनक्यूबेट किया गया था। व्यवहार्यता प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम भर में जांच की गई थी, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) परख द्वारा. तीव्र रूप से विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों को अलग-अलग दवा की स्थितियों में इनक्यूबेट किया गया था जो ट्रांसपोर्टर (एम्फ़ैटेमिन) के माध्यम से या एक्सोसाइटोटिक वेसिकुलर रिलीज (केसीएल) के सक्रियण के माध्यम से मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करने के लिए जाने जाते हैं। इनक्यूबेशन बाद, supernatant में जारी उत्पादों को एकत्र किया गया और एक HPLC-ECD प्रणाली के माध्यम से विश्लेषण किया गया। यहां, बेसल मोनोमाइन रिलीज तीव्र मस्तिष्क स्लाइस से एचपीएलसी द्वारा पता लगाया जाता है। यह डेटा विवो और इन विट्रो परिणामों में पिछले का समर्थन करता है जो दिखाता है कि AMPH और KCl मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करते हैं। यह विधि मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर-निर्भर रिलीज से जुड़े तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है और तेजी से और कम लागत वाले तरीके से मोनोमाइन रिलीज को प्रभावित करने वाले यौगिकों को स्क्रीन करने का अवसर प्रदान करती है।

यह तकनीक एक आंतरिक ऊतक धारक के साथ 48-अच्छी तरह से प्लेट में आधारित इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के साथ एचपीएलसी का उपयोग करके अंतर्जात मोनोमाइन की रिहाई को मापने के लिए मस्तिष्क स्लाइस के उपय?...

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A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

यह विधि तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज का पता लगाने के लिए एक सरल तकनीक का परिचय देती है। सेटअप मोनोमाइन रिलीज के लिए एक ऊतक धारक युक्त एक 48-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करता है। जारी मोनोमाइन का विश्लेषण HPLC द्वारा इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के साथ युग्मित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक दवा की खोज के लिए एक स्क्रीनिंग विधि प्रदान करती है।

तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में अंतर्जात Monoamine रिलीज के माप के लिए एक प्लेट आधारित परख

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

यह तकनीक मोनोमाइन रिलीज की जांच के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीकों का एक अनुकूलन है, जो एक समय में कई औषधीय स्थितियों के तहत प्रीलोडेड रेडियोलेबल मोनोमाइन के बजाय अंतर्जात रिलीज के माप की अनुमति देती है। इस तकनीक के मुख्य लाभ यह हैं कि यह काफी लागत प्रभावी है, एक बार में कई औषधीय स्थितियों की जांच की जा सकती है, और हम वेसिकुलर और ट्रांसपोर्टर मध्यस्थता रिलीज के बीच अंतर करने की क्षमता के साथ अंतर्जात मोनोमाइन रिलीज का अध्ययन कर सकते हैं। फसल के बाद वयस्क 250 से 350 ग्राम नर चूहों से मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने के लिए, तुरंत मस्तिष्क और बर्फ ठंडे ऑक्सीजन युक्त विच्छेदन बफर रखा, और ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र से 300 माइक्रोन कोरोनल मस्तिष्क वर्गों को प्राप्त किया।मस्तिष्क स्लाइस के आगे विच्छेदन के लिए, ऊतकों को सावधानीपूर्वक कांच की स्लाइड्स में ले जाएं और अपनी अंधेरे स्ट्राइटेड संरचना के आधार पर पृष्ठीय स्ट्रिएटम की पहचान करने के लिए एक चूहे के मस्तिष्क एटलस का उपयोग करें, और कॉर्टेक्स और इसकी अद्वितीय सर्पिल संरचना की निकटता के आधार पर हिप्पोकैम्पस की पहचान करें। नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्लाइस के रूप में उनके उपयोग के लिए दाएं और बाएं गोलार्धों को अलग करें। पृष्ठीय स्ट्रिएटम को आगे दो मिलीमीटर घूंसे में विच्छेदित किया जा सकता है।फिर एक संशोधित टिप के साथ एक प्लास्टिक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए ऑक्सीजन युक्त बर्फ ठंडा विच्छेदन बफर में डूबे छोटे कंटेनरों में नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए ऑक्सीजन bubbling के साथ. मोनोमाइन रिलीज को प्रेरित करने के लिए, ऊतक के नमूनों को एक कस्टम के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें 48 अच्छी तरह से एफिलेक्स चैंबर जिसमें 0.5 से एक मिलीलीटर तक एफिलेक्स बफर होता है, जिसमें लगातार कोमल बुदबुदाहट के साथ प्रति अच्छी तरह से होता है और नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 से 50 मिनट तक ठीक होने की अनुमति मिलती है। संतुलन अवधि के अंत में, मस्तिष्क के ऊतकों के साथ ऊतक धारक को उन कुओं में ले जाएं जिनमें फार्माकोलॉजिकल एजेंट के साथ या बिना ऑक्सीजन युक्त एफिलेक्स बफर के 500 माइक्रोलीटर होते हैं, 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए कुओं के बीच बफर के न्यूनतम हस्तांतरण को रोकने के लिए कुएं के किनारे पर धारक को टैप करते हैं।इनक्यूबेशन के अंत में, धारक को कुओं के एक नए सेट पर ले जाएं जिसमें ब्याज की दवा के साथ या बिना 500 माइक्रोलीटर एफीलेक्स बफर होते हैं और प्लेट को अतिरिक्त 20 मिनट के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में वापस कर देते हैं। दूसरे इनक्यूबेशन के दौरान, पहले इनक्यूबेशन से कुओं से समाधान को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, जिसमें बर्फ पर एक सामान्य परक्लोरिक या फॉस्फोरिक एसिड के 50 माइक्रोलीटर होते हैं, और ट्यूबों को नंबर एक लेबल करते हैं "दूसरे इनक्यूबेशन के अंत में, ऊतक धारक को बर्फ पर प्लेट के साथ खाली कुओं में ले जाएं और सुपरनेटेंट को दूसरे इनक्यूबेशन से नए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें एक सामान्य परक्लोरिक या फॉस्फोरिक के 50 माइक्रोलीटर होते हैं। बर्फ पर एसिड। इन ट्यूबों को नंबर दो लेबल करें "जब सभी supernatants स्थानांतरित कर दिए गए हैं, तो ऊतक के प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर बर्फ ठंडा विच्छेदन बफर जोड़ें और प्रत्येक ऊतक के नमूने को एक नई माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए छोटे चिमटी का उपयोग करें।नमूना ट्यूबों से बफर को हटा दें और ऊतकों को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, फिर एकत्रित इनक्यूबेशन समाधानों को सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज फिल्टर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और एचपीएलसी विश्लेषण तक बर्फ पर फिल्टर रखें। मोनोमाइन का पता लगाने के लिए निर्माता की सिफारिश के लिए ईसीडी और प्रवाह दर की क्षमता निर्धारित करें। ऑटो इंजेक्शन और पता लगाने के लिए HPLC में न्यूरो-ट्रांसमीटर मानकों सहित प्रत्येक नमूने का लोड और उपयुक्त एलीकोट और उपकरण को विश्लेषण पूरा करने की अनुमति देता है।फिर निर्माता के दिशानिर्देशों के आधार पर वक्र के तहत क्षेत्र प्राप्त करने के लिए प्रत्येक मोनोमाइन से बने एक मानक वक्र का उपयोग करके क्रोमैटोग्राफ डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एचपीएलसी विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। कार्यात्मक विश्लेषण के छह घंटे के बाद, ऊतक के नमूने व्यवहार्य रहते हैं, जबकि 1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ इनक्यूबेट किए गए नमूने एमटीटी परिवर्तन में महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन करते हैं। हिप्पोकैम्पस और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स मस्तिष्क वर्गों के तीव्र 20 मिनट के उपचार एम्फ़ैटेमिन के साथ प्रत्येक मोनोमाइन के बाह्य कोशिकीय स्तर में महत्वपूर्ण वृद्धि को प्रेरित करता है।जब नमूनों को फ्लुओक्सेटिन के साथ प्रीट्रीट किया जाता है, तो एक चयनात्मक सेरोटोनिन री-अपटेक इनहिबिटर, हिप्पोकैम्पस और प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के भीतर एक्स्ट्रासेल्युलर सेरोटोनिन में एम्फ़ैटेमिन प्रेरित वृद्धि नहीं होती है, जबकि एक्स्ट्रासेल्युलर डोपामाइन और नॉरपेनेफ्रिन उत्पादन में वृद्धि प्रभावित नहीं होती है। इसके अलावा, एम्फ़ैटेमिन के साथ पृष्ठीय स्ट्रिएटम घूंसे का तीव्र 20 मिनट का उपचार बाह्य कोशिकीय डोपामाइन स्तर की अभिव्यक्ति में 35 गुना वृद्धि को प्रेरित करता है, जबकि कोकेन के साथ पृष्ठीय स्ट्रिएटम पंच उपचार, एक मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर अवरोधक, एम्फ़ैटेमिन प्रेरित एक्स्ट्रासेल्युलर डोपामाइन के एक महत्वपूर्ण निषेध में परिणाम देता है। झिल्ली विध्रुवीकरण को उत्पन्न करने के लिए बाह्य कोशिकीय पोटेशियम क्लोराइड की एकाग्रता में वृद्धि अनुपचारित नियंत्रण स्थितियों की तुलना में मोनोमाइन की एक्सोसाइटोटिक रिलीज को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, और न तो फ्लुओक्सेटीन और न ही कोकीन उपचार इस गहरे ध्रुवीकरण प्रेरित वृद्धि को अवरुद्ध करता है।स्वच्छ कट वर्गों, घूंसे का एक सटीक स्थानीयकरण, और पूरे प्रयोग के दौरान लगातार ऑक्सीकरण बनाए रखने के लिए यह आवश्यक है। मस्तिष्क वर्गों का उपयोग आगे जैव रासायनिक प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए प्रयोग के बाद किया जा सकता है, जैसे कि पश्चिमी ब्लोटिंग और हिस्टोलॉजी।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

कैल्शियम इमेजिंग के लिए तीव्र subventricular क्षेत्र स्लाइस की तैयारी

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

तीव्र hippocampal स्लाइस में Synaptically पैदा Astroglial और neuronal प्रतिक्रियाएँ की दोहरी electrophysiological रिकॉर्डिंग

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

माउस तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में Neuroblast प्रवासन के विवो प्रसव के बाद electroporation में और समय चूक इमेजिंग

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में neuronal microcircuits के electrophysiological और morphological विशेषता बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

एक अनुकूलित N-मिथाइल-D-glucamine सुरक्षात्मक वसूली विधि का उपयोग कर तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

में गहराई शारीरिक माउस vomeronasal अंग की तीव्र ऊतक स्लाइस में परिभाषित सेल आबादी के विश्लेषण

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

एक छोटी मात्रा रीसाइक्लिंग में बनाए रखा तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में Synaptic प्लास्टिक रिकॉर्डिंग-, छिड़काव-, और डुबकी-प्रकार चैंबर प्रणाली

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

ब्रेन स्लाइस में न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए स्वचालित छवि-निर्देशित पैच दबाना का आवेदन

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

वयस्क सेरेबेलर स्लाइस में दीर्घकालिक अवसाद प्रेरण का आकलन

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...