Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni Fondecyt Initiation Fund N 11191049 a J.A.P. e dalla sovvenzione NIH DA038598 a G.E.T.

Tutti gli esperimenti, compresa la manipolazione degli animali e la raccolta dei tessuti, sono stati condotti in conformità con l'Università della Florida e il City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), seguendo il protocollo approvato 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Per i reagenti e il tampone, fare riferimento al file supplementare.
1. Preparare fette di cervello di ratto acuto
NOTA: In questo esperimento sono stat...

Le misurazioni del rilascio di monoammine sono state eseguite per anni in un certo numero di sistemi come cellule eterologhe, colture neuronali, sinaptosomi cerebrali, fette di cervello acute ex vivo e animali interi13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<...

Una pletora di malattie neurologiche e psichiatriche sono associate a disregolazione o insufficiente mantenimento del neurotrasmettitore monoamminico (dopamina [DA], serotonina [5-HT], noradrenalina [NE]) omeostasi1,2,3. Queste condizioni includono, ma non sono limitate a, depressione1,2, schizofrenia2, ansia2, dipendenza4, menopausa5,6,7, dolore8 e morbo di Parkinson3. Ad esempio, diversi modelli di menopausa su ratti hanno dimostrato che la disregolazione o la riduzione delle monoammine all'interno dell'ippocampo, della corteccia prefrontale e dello striato può essere associata sia alla depressione che al declino cognitivo, che si osserva nelle donne in menopausa. La disregolazione delle monoammine in questi modelli è stata ampiamente esaminata utilizzando HPLC-ECD, sebbene gli studi non abbiano discriminato tra il contenuto di neurotrasmettitori misurato rispetto al rilascio di neurotrasmettitori5,6,7. Le monoammine vengono rilasciate classicamente nello spazio extracellulare attraverso il rilascio vescicolare Ca2+-dipendente9 e vengono riciclate attraverso il rispettivo sistema di ricaptazione della membrana plasmatica (trasportatore della dopamina, DAT; trasportatore della serotonina, SERT; trasportatore della noradrenalina, NET)10,11. Al contrario, i dati suggeriscono che questi trasportatori sono in grado di rilasciare o efflussare monoammine, poiché le droghe d'abuso come l'anfetamina (AMPH) e la 3,4-metilendiossimetanfetamina (MDMA) sono note per rilasciare DA e 5-HT, rispettivamente attraverso i loro sistemi di trasporto12,13,14,15,16,17 . Pertanto, una corretta comprensione meccanicistica delle dinamiche di rilascio delle monoammine è cruciale per lo sviluppo di farmacoterapie specifiche e mirate.
Una vasta gamma di tecniche è stata impiegata per studiare il rilascio di monoammine come la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV)18, la microdialisi in vivo13, l'imaging19, la preincubazione con monoammine radiomarcate20, l'optogenetica e, più recentemente, i sensori fluorescenti geneticamente codificati e la fotometria21,22 . FSCV e microdialisi in vivo sono le tecniche primarie utilizzate per studiare il rilascio di monoammine. FSCV è usato per studiare il rilascio esocitotico stimolato di, principalmente, DA in fette cerebrali acute e in vivo23. Poiché FSCV utilizza elettrodi per stimolare o evocare il rilascio, la fonte primaria di rilascio di neurotrasmettitori è il rilascio vescicolare Ca2+-dipendente18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdialisi in vivo abbinata all'HPLC misura i cambiamenti nei livelli di neurotrasmettitori extracellulari utilizzando una sonda posizionata in un'area cerebrale di interesse13,32. Simile a FSCV, una delle principali limitazioni alla microdialisi in vivo è la difficoltà nel determinare la fonte di rilascio del neurotrasmettitore: rilascio vescicolare dipendente da Ca2 + o trasportatore dipendente. Degno di nota, entrambi i metodi consentono la misurazione diretta del rilascio di monoammina. Attraverso il recente progresso dell'optogenetica, la ricerca dimostra il rilevamento del rilascio di 5-HT e DA in un breve lasso di tempo con una squisita specificità del tipo cellulare21,22. Tuttavia, queste strategie richiedono tecniche e attrezzature complesse e costose e misurano indirettamente il rilascio di monoammina, in particolare attraverso il legame della monoammina ai recettori. Inoltre, le monoammine radiomarcate sono utilizzate anche per lo studio della dinamica delle monoammine. Le monoammine radiomarcate possono essere precaricate in vari sistemi modello come cellule eterologhe che sovraesprimono ogni trasportatore di monoammine20,33,34,35,36,37,38,39,40, neuroni primari20, sinaptosomi33,39,41, 42, e fette di cervello acute43,44. Tuttavia, la radioattività rappresenta un potenziale danno per lo sperimentatore e gli analiti marcati con trizio potrebbero non ricapitolare fedelmente la dinamica endogena delle monoammine45,46. I sistemi di superfusione combinati con metodi di rilevamento off-line come HPLC-ECD hanno permesso il rilevamento di monoammine da più fonti tissutali. Qui, questo protocollo fornisce come metodo ottimizzato e a basso costo, semplice e preciso utilizzando fette di cervello acute per misurare direttamente il rilascio basale endogeno e stimolato di monoammina.
Le fette di cervello acute consentono di testare ipotesi meccanicistiche, principalmente in quanto preservano il microambiente anatomico in vivo e mantengono intatte le sinapsi47,48,49,50,51,52. In alcuni studi, fette di cervello acute o tessuto cerebrale tritato sono stati utilizzati in combinazione con una tecnica di superfusione che utilizza KCl per stimolare il rilascio mediato da Ca2+53,54,55,56. I sistemi di superfusione sono stati fondamentali per far progredire la comprensione del campo dei meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori, comprese le monoammine. Tuttavia, questi sistemi sono relativamente costosi e il numero di camere disponibili per l'analisi dei tessuti varia da 4 a 12. In confronto, il metodo qui presentato è economico, consente la misurazione di 48 campioni di tessuto e può essere raffinato per utilizzare fino a 96 campioni di tessuto. Ogni pozzetto all'interno della piastra a 48 pozzetti contiene supporti per tessuti che utilizzano filtri per separare il prodotto rilasciato dal tessuto e le monoammine rilasciate vengono quindi raccolte e analizzate da HPLC-ECD. È importante sottolineare che questo metodo consente la misurazione simultanea del rilascio di 5-HT, DA e NE da diverse aree cerebrali come la corteccia prefrontale, l'ippocampo e lo striato dorsale dopo il trattamento con agenti farmacologici che modulano il rilascio di monoammine. Pertanto, lo sperimentatore può rispondere a più domande utilizzando un sistema multi-pozzo economico che aumenta il numero di campioni testati e quindi riduce il numero di animali utilizzati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

I neurotrasmettitori monoamminici sono associati a numerosi disturbi neurologici e psichiatrici. Modelli animali di tali condizioni hanno mostrato alterazioni nel rilascio di neurotrasmettitori monoamminici e nelle dinamiche di assorbimento. Metodi tecnicamente complessi come l'elettrofisiologia, la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV), l'imaging, la microdialisi in vivo, l'optogenetica o l'uso della radioattività sono necessari per studiare la funzione della monoammina. Il metodo qui presentato è un approccio ottimizzato in due fasi per rilevare il rilascio di monoammina in fette cerebrali acute utilizzando una piastra a 48 pozzetti contenente supporti tissutali per esaminare il rilascio di monoammina e cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con rilevamento elettrochimico (HPLC-ECD) per la misurazione del rilascio di monoammina. In breve, le sezioni cerebrali di ratto contenenti regioni di interesse, tra cui la corteccia prefrontale, l'ippocampo e lo striato dorsale sono state ottenute utilizzando un'affettatrice di tessuto o vibratoma. Queste regioni di interesse sono state sezionate da tutto il cervello e incubate in un tampone fisiologico ossigenato. La vitalità è stata esaminata durante il corso del tempo sperimentale, mediante il test 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Le regioni cerebrali acutamente sezionate sono state incubate in diverse condizioni farmacologiche che sono note per indurre il rilascio di monoammina attraverso il trasportatore (anfetamina) o attraverso l'attivazione del rilascio vescicolare esocitotico (KCl). Dopo l'incubazione, i prodotti rilasciati nel surnatante sono stati raccolti e analizzati attraverso un sistema HPLC-ECD. Qui, il rilascio basale di monoammina viene rilevato dall'HPLC da fette di cervello acute. Questi dati supportano i precedenti risultati in vivo e in vitro che mostrano che AMPH e KCl inducono il rilascio di monoammina. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i meccanismi associati al rilascio dipendente dal trasportatore di monoammine e offre l'opportunità di esaminare i composti che influenzano il rilascio di monoammina in modo rapido e a basso costo.

Questa tecnica descrive l'uso di fette di cervello per misurare il rilascio di monoammine endogene utilizzando HPLC con rilevamento elettrochimico basato su una piastra a 48 pozzetti con un supporto tissutale interno. L'impostazione sperimentale è illustrata nella Figura 1 e nella Figura 2. Inizialmente, per garantire la vitalità dei tessuti entro la fine della sperimentazione, è stato eseguito un test MTT (3-(4,5-dimetiltiazo...

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A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Questo metodo introduce una semplice tecnica per il rilevamento del rilascio endogeno di monoammina utilizzando fette di cervello acute. La configurazione utilizza una piastra a 48 pozzetti contenente un supporto in tessuto per il rilascio di monoammina. La monoammina rilasciata viene analizzata mediante HPLC accoppiato con il rilevamento elettrochimico. Inoltre, questa tecnica fornisce un metodo di screening per la scoperta di farmaci.

Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Questa tecnica è un adattamento dei metodi comunemente usati per esaminare il rilascio di monoammina, consentendo la misurazione del rilascio endogeno piuttosto che di monoammine radiomarcate precaricate in più condizioni farmacologiche contemporaneamente. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è abbastanza conveniente, più condizioni farmacologiche possono essere esaminate contemporaneamente e possiamo studiare il rilascio endogeno di monoammina con la capacità di distinguere tra rilascio mediato vescicolare e trasportatore. Per preparare fette di cervello da ratti maschi adulti da 250 a 350 grammi dopo il raccolto, posizionare immediatamente il cervello e il tampone di dissezione ossigenato ghiacciato e acquisire sezioni cerebrali coronali da 300 micron da ciascuna regione di interesse.Per un'ulteriore dissezione delle fette di cervello, spostare con attenzione i tessuti su vetrini di vetro e utilizzare un atlante cerebrale di ratto per identificare lo striato dorsale in base alla sua struttura striata scura e per identificare l'ippocampo in base alla sua vicinanza alla corteccia e alla sua struttura a spirale unica. Separare gli emisferi destro e sinistro per il loro uso come fette di controllo e sperimentali. Lo striato dorsale può essere ulteriormente sezionato in due pugni millimetrici.Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con una punta modificata per trasferire i campioni in piccoli contenitori immersi in un tampone di dissezione ghiacciato ossigenato con gorgogliamento di ossigeno. Per indurre il rilascio di monoammina, trasferire i campioni di tessuto in ciascun pozzetto di una camera di efflusso a 48 pozzetti su misura contenente da 0,5 a un millilitro di tampone di efflusso per pozzetto con costante gorgogliamento delicato e consentire ai campioni di recuperare per 30-50 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine del periodo di equilibratura, spostare il portaseffa con tessuto cerebrale in pozzetti contenenti 500 microlitri di tampone di efflusso ossigenato con o senza agente farmacologico, toccando il supporto sul bordo del pozzo per impedire il trasferimento minimo di tampone tra i pozzetti per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, spostare il titolare in una nuova serie di pozzetti contenenti 500 microlitri di tampone di efflusso con o senza il farmaco di interesse e restituire la piastra all'incubatore di colture cellulari per altri 20 minuti. Durante la seconda incubazione, trasferire la soluzione dai pozzetti della prima incubazione in tubi di microcentrifuga contenenti 50 microlitri di un normale acido perclorico o fosforico su ghiaccio ed etichettare i tubi numero uno"Alla fine della seconda incubazione, spostare il supporto del tessuto in pozzetti vuoti con la piastra su ghiaccio e trasferire i supernatanti dalla seconda incubazione a nuovi tubi microcentrifuga contenenti 50 microlitri di un normale perclorico o fosforico acido su ghiaccio. Etichettare questi tubi numero due"Quando tutti i supernatanti sono stati trasferiti, aggiungere un millilitro di tampone di dissezione ghiacciata a ciascun pozzetto di tessuto e utilizzare piccole pinzette per trasferire ogni campione di tessuto in un nuovo tubo di microcentrifuga.Rimuovere il tampone dalle provette del campione e conservare i tessuti a meno 80 gradi Celsius, quindi trasferire le soluzioni di incubazione raccolte in tubi filtranti microcentrifuga per la centrifugazione e posizionare il filtrato sul ghiaccio fino all'analisi HPLC. Impostare il potenziale dell'ECD e la portata in base alla raccomandazione del produttore per il rilevamento delle monoammine. Carico e aliquota appropriata di ciascun campione, compresi gli standard neuro-trasmettitori nell'HPLC per l'iniezione automatica e il rilevamento e consentono allo strumento di completare l'analisi.Quindi utilizzare il software di analisi HPLC per acquisire e analizzare i dati del cromatografo utilizzando una curva standard composta da ciascuna monoammina per ottenere l'area sotto la curva in base alle linee guida del produttore. Dopo sei ore di analisi funzionale, i campioni di tessuto rimangono vitali, mentre i campioni incubati con l'1% di Triton X-100 dimostrano una significativa riduzione della trasformazione MTT. Il trattamento acuto di 20 minuti delle sezioni cerebrali della corteccia ippocampale e prefrontale con anfetamina induce un aumento significativo del livello extracellulare di ciascuna monoammina.Quando i campioni sono pretrattati con fluoxetina, un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina, l'aumento indotto dall'anfetamina della serotonina extracellulare all'interno dell'ippocampo e della corteccia prefrontale non si verifica, mentre l'aumento della dopamina extracellulare e della produzione di noradrenalina non è influenzato. Inoltre, il trattamento acuto di 20 minuti dei pugni dello striato dorsale con anfetamina induce un aumento di 35 volte dell'espressione extracellulare del livello di dopamina, mentre il trattamento con pugno dello striato dorsale con cocaina, un bloccante trasportatore monoamminico, provoca una significativa inibizione della dopamina extracellulare indotta da anfetamine. Aumentare la concentrazione di cloruro di potassio extracellulare per evocare la depolarizzazione della membrana è sufficiente per indurre il rilascio esocitotico di monoammine rispetto alle condizioni di controllo non trattate, e né la fluoxetina né il trattamento con cocaina bloccano questo aumento indotto dalla polarizzazione profonda.È imperativo avere sezioni di taglio pulite, una localizzazione precisa dei punzoni e mantenere un'ossigenazione costante durante l'esperimento. Le sezioni cerebrali possono essere utilizzate dopo la sperimentazione per ulteriori elaborazioni e analisi biochimiche, come il western blotting e l'istologia.

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