Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
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この作品は、フォンデサイト開始基金N 11191049をJ.A.P.に付与し、NIHはG.E.TにDA038598を付与することによって支援されました。

動物の取り扱いと組織の収集を含むすべての実験は、承認されたプロトコル201508873(UF)と1071(CCNY)に従って、フロリダ大学とニューヨーク市立動物の世話と使用委員会(IACUC)に従って行われました。試薬および緩衝液については 、補足ファイルを参照してください。
1. 急性ラット脳スライスを準備する
注:この実験では、成人雄ラット(250〜350...

モノアミン放出測定は、異種細胞、神経細胞培養、脳シナプトソーム、エキソウビボ急性脳スライス、および動物全体で長年にわたって行われてきた13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<sup class="xref...

多くの神経疾患および精神疾患は、単アミン神経伝達物質(ドーパミン[DA]、セロトニン[5-HT]、ノルエピネフリン[NE])恒常性1,2,3の調節不全または不十分な維持に関連している。これらの状態は、うつ病1、2、統合失調症2、不安2、中毒4、更年期5、6,7、疼痛8、およびパーキンソン病3を含むが、これらに限定されない。例えば、更年期のいくつかのラットモデルは、海馬、前頭前野、線条体内のモノアミンの調節不全または減少が、更年期障害を経験している女性に見られるうつ病と認知機能の両方に関連している可能性があることを示している。これらのモデルにおけるモノアミンの調節異常はHPLC-ECDを用いて広範囲に検討されてきたが、この研究は測定された神経伝達物質の含有量と神経伝達物質の放出を区別しなかった5,6,7.モノアミンは、Ca2+依存性のvesicular release9を介して古典的に細胞外空間に放出され、それぞれの原形質膜再取り込みシステム(ドーパミントランスポーター、DAT;セロトニントランスポーター、SERT;ノルエピネフリントランスポーター、NET)10,11を介してリサイクルされる。逆に、アンフェタミン(AMPH)や3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA)などの乱用薬がトランスポーターシステムを介してDAおよび5-HTをそれぞれ放出することが知られているため、これらのトランスポーターはモノアミンを放出または流出させ得ることを示唆している。.したがって、モノアミン放出ダイナミクスの適切な機械学的理解は、特定の標的薬物療法を開発するために重要である。
高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)18、生体内マイクロダイアルシス13、イメージング19、放射性標識モノアミン20のプレインキュベーション、光遺伝学、さらに最近では遺伝子組み換え蛍光センサーとフォトメトリクス21,22などのモノアミン放出を研究するために幅広い技術が採用されています。.FSCVおよび生体内マイクロ透析は、モノアミン放出の研究に使用される主要な技術である。FSCVは、急性脳スライスおよびin vivo23におけるDAを中心に刺激された興奮性放出を研究するために使用される。FSCVは電極を使用して放出を刺激または誘発するため、神経伝達物質放出の主な原因はCa2+依存性の小胞放出18、24、25、26、27、28、29、30、31である.生体内のミクロジアル症とHPLCを併用すると、関心のある脳領域に配置されたプローブを用いて細胞外神経伝達物質レベルの変化を測定する13,32。FSCVと同様に、生体内のミクロジアルシスに対する大きな制限は、神経伝達物質放出源の決定における困難である:Ca2+依存性の小胞放出またはトランスポーター依存性である。注目に値する、両方の方法は、モノアミン放出の直接測定を可能にする。光遺伝学の最近の進歩を通じて、研究は、絶妙な細胞型特異性21,22と短い時間スパンでの5-HTおよびDA放出の検出を実証する。しかし、これらの戦略は、複雑で高価な技術と機器を必要とし、間接的にモノアミン放出を測定し、特に受容体にモノアミン結合を介して。また、放射線標識モノアミンは、モノアミンのダイナミクスの研究にも使用されます。放射性標識モノアミンは、各モノアミントランスポーター20、33、34、35、36、37、38、39、40、一次ニューロン20、シナプトソーム33、39、41、異種細胞などの様々なモデルシステムにプリロードされ得る、42、および急性脳スライス43,44。しかし、放射能は実験者に潜在的な害をもたらし、トリチウム標識された検体は内因性モノアミンダイナミクス45,46を忠実に再現しない可能性がある。HPLC-ECDなどのオフライン検出法と組み合わせたスーパーフュージョンシステムは、複数の組織源からのモノアミンの検出を可能にしました。ここでは、このプロトコルは、急性脳スライスを使用して、内因性基底および刺激されたモノアミン放出を直接測定するための最適化された低コスト、シンプル、および正確な方法として提供される。
急性脳スライスは、主に生体内の解剖学的微小環境を維持し、無傷のシナプス47,48,49,50,51,52を維持するため、機械学的仮説をテストすることを可能にする。いくつかの研究では、急性脳スライスまたは切り刻まれた脳組織は、Ca2+媒介放出53,54,55,56を刺激するためにKClを使用したスーパーフュージョン技術と組み合わせて使用されてきた。超灌流システムは、モノアミンを含む神経伝達物質放出機構の分野の理解を進めるために重要であった。しかし、これらのシステムは比較的高価であり、組織分析に利用可能なチャンバーの数は4〜12の範囲です。これに対し、ここで提示する方法は安価であり、48の組織サンプルの測定を可能にし、そして96までの組織サンプルを使用するように精製され得る。48ウェルプレート内の各ウェルには、フィルターを使用して放出された製品を組織から分離する組織ホルダーが含まれ、放出されたモノアミンをHPLC-ECDによって収集して分析します。重要なことに、この方法は、モノアミン放出を調節する薬理学的薬剤による治療後に、前頭前野、海馬、および後方線条体などの異なる脳領域からの5-HT、DA、およびNE放出の同時測定を可能にする。これにより、実験者は、試験するサンプル数を増加させ、使用する動物の数を減らす安価なマルチウェルシステムを用いて複数の質問に答えることができる。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

モノアミン神経伝達物質は、多数の神経疾患と精神医学的疾患に関連付けられている.このような状態の動物モデルは、モノアミン神経伝達物質の放出および取り込みダイナミクスの変化を示している。電気生理学、高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)、イメージング、生体内ミクロジアル、光遺伝学、または放射能の使用などの技術的に複雑な方法は、モノアミン機能を研究するために必要とされる。ここで紹介する方法は、モノアミン放出を調べる組織ホルダーを含む48ウェルプレートを用いて急性脳スライス中のモノアミン放出を検出するための最適化された2段階のアプローチであり、モノアミン放出測定のための電気化学的検出(HPLC-ECD)と組み合わせた高性能液体クロマトグラフィーである。簡単に言えば、前頭前野、海馬、および側頭線を含む目的の領域を含むラット脳切片は、組織スライサーまたはビブラートームを用いて得られた。これらの関心領域は、脳全体から解剖され、酸素化された生理学的緩衝液中にインキュベートされた。実験時間を通じて、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイによって生存率を調べた。急性解剖された脳領域は、トランスポーター(アンフェタミン)を介してモノアミン放出を誘導することが知られている様々な薬物条件で、またはexocttic小胞体放出(KCl)の活性化を通じてインキュベートされた。インキュベーション後、上清中の放出物を収集し、HPLC-ECDシステムを介して分析した。ここで、基礎モノアミン放出は、急性脳スライスからHPLCによって検出される。このデータは、AMPHおよびKClがモノアミン放出を誘導することを示すインビボおよびインビトロの結果をサポートする。この方法は、モノアミン輸送体依存性放出に関連するメカニズムを研究するのに特に有用であり、迅速かつ低コストでモノアミン放出に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする機会を提供する。

この技術は、内部組織ホルダーを備えた48ウェルプレートに基づく電気化学的検出を用いたHPLCを用いた内因性モノアミンの放出を測定するための脳スライスの使用を説明する。実験用セットアップは 図1 および 図2に示されている。最初に、実験の終わりまでに組織の生存率を確保するために、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール...

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A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

この技術は、モノアミン放出を調べるための一般的に使用される方法の適応であり、一度に複数の薬理学的条件下で予め放射性標識モノアミンを予め取り付けせずに内因性放出の測定を可能にする。この技術の主な利点は、それがかなり費用対効果が高く、複数の薬理学的条件を一度に調べることができ、そして、我々は、静脈とトランスポーター媒介放出を区別する能力を有する内因性モノアミン放出を研究することができるということです。収穫後に成人250から350グラムの雄ラットの脳スライスを調製するために、すぐに脳と氷を冷た酸素化解剖バッファーに置き、対象領域ごとに300ミクロンのコロナ脳切片を獲得した。脳スライスのさらなる解剖のために、慎重に組織をガラススライドに移動し、ラット脳アトラスを使用して、暗い線条体構造に基づいて裏線条体を識別し、皮質とそのユニークなスパイラル構造への近接性に基づいて海馬を識別する。コントロールスライスと実験スライスとして使用するために、左右半球を分離します。また、後回り線条体をさらに2ミリメートルのパンチに解剖することができる。次に、修正されたチップを備えたプラスチックトランスファーピペットを使用して、酸素バブリングで酸素化された氷冷解剖バッファーに浸した小さな容器にサンプルを移します。モノアミン放出を誘導するには、一定の穏やかな泡立ちで1ウェルあたり0.5から1ミリリットルの流出バッファーを含む48ウェル流出チャンバーをカスタムメイドの各ウェルに組織サンプルを移し、サンプルが摂氏37度で30〜50分間回復することを可能にする。平衡期間の終わりに、脳組織を含む組織ホルダーを、薬理剤の有無にかかわらず500マイクロリットルの酸素化流出緩衝バッファーを含むウェルに移動し、ウェルの端にあるホルダーをタップして、摂氏37度で20分間のウェル間の緩衝液の最小限の移動を防ぎます。インキュベーションの最後に、関心のある薬物の有無にかかわらず500マイクロリットルの流出バッファーを含む新しいウェルセットにホルダーを移動し、さらに20分間プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。第2インキュベーション中に、1回のインキュベーションから氷上の1つの正常な過塩素酸またはリン酸の50マイクロリットルを含むマイクロ遠心分離チューブに、第1インキュベーションから溶液を移す。 そしてチューブナンバーワンにラベルを付ける「2回目のインキュベーションの終わりに、組織ホルダーを氷上のプレートと一緒に空の井戸に移動し、上清を2番目のインキュベーションから、通常の過塩素性またはリンの50マイクロリットルを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。氷の上の酸。これらのチューブ番号2にラベルを付ける"上清のすべてが転送されたら、組織の各ウェルに氷冷解離バッファーの1ミリリットルを追加し、各組織サンプルを新しいマイクロ遠心チューブに移すために小さなピンセットを使用します。サンプルチューブからバッファーを取り出し、組織をマイナス80°Cで保存し、収集したインキュベーション溶液をマイクロ遠心分離用フィルターチューブに移して遠心分離し、HPLC分析まで氷の上に濾液を置きます。ECD と流量の可能性をモノアミンの検出に関するメーカーの推奨に設定します。各サンプルの負荷と適切なアリコートは、自動注入および検出のためのHPLCへの神経伝達物質の標準を含み、測定器が分析を完了することを可能にする。次に、HPLC解析ソフトウェアを使用して、各モノアミンで構成される標準曲線を使用してクロマトグラフデータを取得および分析し、メーカーのガイドラインに基づいて曲線下の領域を取得します。6時間の機能分析の後、組織サンプルは生存可能であり、1%Triton X-100でインキュベートされたサンプルはMTT変換の有意な減少を示す。アンフェタミンを伴う海馬および前頭前野の脳切片の急性20分治療は、各モノアミンの細胞外レベルの有意な増加を誘発する。サンプルがフルオキセチン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤で前処理されると、アンフェタミンは海馬内および前頭前野の細胞外セロトニンの増加を誘発し、細胞外ドーパミンおよびノルエピネフリン産生の増加は影響を受けない。さらに、アンフェタミンによるドーサル線条体パンチの急性20分間の治療は、細胞外ドーパミンレベル発現の35倍の増加を誘発し、一方、コカインによるドーサル線条体パンチ治療、モノアミントランスポーターブロッカー、アンフェタミン誘導細胞外ドーパミンの有意な阻害をもたらす。膜脱分極を誘発するために塩化細胞外カリウムの濃度を高めることは、未処理の対照条件と比較してモノアミンの外皮放出を誘導するのに十分であり、フルオキセチンもコカイン処理もこの深い分極化を誘発しない。クリーンカットセクション、パンチの正確な局在化を持ち、実験全体を通して一貫した酸素化を維持することが不可欠です。脳切片は、ウェスタンブロッティングやヒストロジーなどのさらなる生化学的処理および分析のために実験後に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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