Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd Fondecyt Initiation Fund N 11191049 til J.A.P. og NIH grant DA038598 til G.E.T.

Alle eksperimenter, inkludert dyrehåndtering og vevsinnsamling, ble utført i samsvar med University of Florida og City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), etter den godkjente protokollen 201508873 (UF) og 1071 (CCNY). For reagenser og buffer, se tilleggsfilen.
1. Forbered akutte rottehjerneskiver
MERK: I dette eksperimentet ble voksne hannrotter (250-350 g) brukt. Dette oppsettet er imidlertid funksjonelt for for...

Monoaminfrigjøringsmålinger har blitt utført i årevis i en rekke systemer som heterologe celler, nevronkulturer, hjernesynaptosomer, ex vivo akutte hjerneskiver og hele dyr13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<sup c...

En mengde nevrologiske og psykiatriske sykdommer er forbundet med dysregulering eller utilstrekkelig vedlikehold av monoamin nevrotransmitter (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homeostase1,2,3. Disse forholdene inkluderer, men er ikke begrenset til, depresjon1,2, schizofreni2, angst2, avhengighet4, overgangsalder5,6,7, smerte8 og Parkinsons sykdom3. For eksempel har flere rottemodeller av overgangsalderen vist at dysregulering eller reduksjon av monoaminer i hippocampus, prefrontal cortex og striatum kan være forbundet med både depresjon og kognitiv nedgang, som ses hos kvinner som opplever overgangsalderen. Dysreguleringen av monoaminer i disse modellene har blitt grundig undersøkt ved hjelp av HPLC-ECD, selv om studiene ikke diskriminerte mellom målt nevrotransmitterinnhold kontra nevrotransmitterutløsning5,6,7. Monoaminer slippes klassisk ut i det ekstracellulære rommet gjennom Ca2 +-avhengig vesikulær frigjøring9, og resirkuleres tilbake gjennom deres respektive plasmamembranreopptakssystem (dopamintransportør, DAT; serotonintransportør, SERT; noradrenalintransportør, NET)10,11. På den annen side tyder data på at disse transportørene er i stand til å frigjøre eller efluksmonaminer, siden rusmidler som amfetamin (AMPH) og 3,4-Metylendioxymethamfetamin (MDMA) er kjent for å frigjøre HENHOLDSVIS DA og 5-HT gjennom sine transportørsystemer12,13,14,15,16,17 . Dermed er en riktig mekanistisk forståelse av monoaminfrigjøringsdynamikk avgjørende for å utvikle spesifikke og målrettede farmakoterapier.
Et bredt spekter av teknikker har blitt brukt til å studere monoaminutgivelse som Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo microdialysis13, imaging19, preincubation med radiomerket monoaminer20, optogenetikk og mer nylig genetisk kodede fluorescerende sensorer og fotometri21,22 . FSCV og in vivo mikrodialyse er de primære teknikkene som brukes for å studere monoaminfrigjøring. FSCV brukes til å studere den stimulerte eksocytotiske frigjøringen av, først og fremst, DA i akutte hjerneskiver og in vivo23. Fordi FSCV bruker elektroder for å stimulere eller fremkalle frigjøring, er den primære kilden til nevrotransmitterutløsning Ca2 +-avhengig vesikulær frigjøring18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialyse kombinert med HPLC måler endringer i ekstracellulære nevrotransmitternivåer ved hjelp av en sonde plassert i et hjerneområde av interesse13,32. I likhet med FSCV er en stor begrensning for in vivo-mikrodialyse vanskeligheten med å bestemme kilden til nevrotransmitterfrigjøring: Ca2 + avhengig vesicular release eller transportøravhengig. Bemerkelsesverdig tillater begge metodene direkte måling av monoaminfrigjøring. Gjennom den nylige utviklingen av optogenetikk viser forskning deteksjon av 5-HT og DA-utgivelse på kort tid med utsøkt celletypespesifisitet21,22. Disse strategiene krever imidlertid komplekse og kostbare teknikker og utstyr, og måler indirekte monoaminfrigjøring, spesielt gjennom monoaminbinding til reseptorer. Videre brukes radiomerkede monoaminer også til å studere monoamindynamikk. Radiomerkede monoaminer kan forhåndslastes i ulike modellsystemer som heterologe celler som overekspresserer hver monoamintransportør20,33,34,35,36,37,38,39,40, primære nevroner20, synaptosomer33,39,41, 42, og akutte hjerneskiver43,44. Imidlertid utgjør radioaktivitet potensiell skade på eksperimentet, og de tritium-merkede analyttene kan ikke trofast rekapitulere endogen monoamindynamikk45,46. Superfusjonssystemer kombinert med off-line deteksjonsmetoder som HPLC-ECD har tillatt påvisning av monoaminer fra flere vevskilder. Her gir denne protokollen som en optimalisert og rimelig, enkel og presis metode ved hjelp av akutte hjerneskiver for å direkte måle endogen basal og stimulert monoaminfrigjøring.
Akutte hjerneskiver gjør det mulig å teste mekanistiske hypoteser, først og fremst når de bevarer in vivo anatomisk mikromiljø, og opprettholder intakte synapser47,48,49,50,51,52. I noen få studier har akutte hjerneskiver eller hakket hjernevev blitt brukt i forbindelse med en superfusjonsteknikk ved hjelp av KCl for å stimulere Ca2 + mediert release53,54,55,56. Superfusjonssystemer har vært avgjørende for å fremme feltets forståelse av nevrotransmitterutløsningsmekanismer, inkludert monoaminer. Imidlertid er disse systemene relativt dyre, og antall kamre tilgjengelig for vevsanalyse varierer fra 4-12. Til sammenligning er metoden som presenteres her billig, tillater måling av 48 vevsprøver, og kan raffineres til å bruke opptil 96 vevsprøver. Hver brønn i 48-brønnsplaten inneholder vevsholdere som bruker filtre for å skille det frigjorte produktet fra vevet, og frigjorte monoaminer samles deretter inn og analyseres av HPLC-ECD. Viktigst, denne metoden tillater samtidig måling av 5-HT, DA og NE-frigjøring fra forskjellige hjerneområder som prefrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum etter behandling med farmakologiske midler som modulerer monoaminfrigjøring. Dermed kan eksperimentet svare på flere spørsmål ved hjelp av et billig multi-brønnsystem som øker antall prøver som er testet og dermed reduserer antall dyr som brukes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

Monoamin nevrotransmittere er forbundet med mange nevrologiske og psykiatriske plager. Dyremodeller av slike forhold har vist endringer i monoamin nevrotransmitter frigjøring og opptaksdynamikk. Teknisk komplekse metoder som elektrofysiologi, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), avbildning, in vivo mikrodialyse, optogenetikk eller bruk av radioaktivitet er nødvendig for å studere monoaminfunksjon. Metoden som presenteres her er en optimalisert to-trinns tilnærming for å oppdage monoaminfrigjøring i akutte hjerneskiver ved hjelp av en 48-brønns plate som inneholder vevsholdere for å undersøke monoaminfrigjøring, og høyytelses væskekromatografi kombinert med elektrokjemisk deteksjon (HPLC-ECD) for monoaminfrigjøringsmåling. Kort sagt ble rottehjerneseseksjoner som inneholder interesseregioner, inkludert prefrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum oppnådd ved hjelp av en vevsskive eller vibratom. Disse interesseområdene ble dissekert fra hele hjernen og inkubert i en oksygenert fysiologisk buffer. Levedyktighet ble undersøkt gjennom hele det eksperimentelle tidsforløpet, med 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. De akutt dissekerte hjerneregionene ble inkubert under varierende narkotikatilstander som er kjent for å indusere monoaminfrigjøring gjennom transportøren (amfetamin) eller gjennom aktivering av eksocytotisk vesikulær frigjøring (KCl). Etter inkubasjon ble de utgitte produktene i supernatanten samlet og analysert gjennom et HPLC-ECD-system. Her oppdages basal monoaminfrigjøring av HPLC fra akutte hjerneskiver. Disse dataene støtter tidligere in vivo- og in vitro-resultater som viser at AMPH og KCl induserer monoaminfrigjøring. Denne metoden er spesielt nyttig for å studere mekanismer forbundet med monoamintransportøravhengig frigjøring og gir en mulighet til å screene forbindelser som påvirker monoaminfrigjøring på en rask og rimelig måte.

Denne teknikken beskriver bruken av hjerneskiver for å måle frigjøring av endogene monoaminer ved hjelp av HPLC med elektrokjemisk deteksjon basert i en 48-brønns plate med en indre vevsholder. Eksperimentelt oppsett er avbildet i figur 1 og figur 2. I utgangspunktet, for å sikre vev levedyktighet ved slutten av eksperimenteringen, ble en MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, en tetrazole) analyse ...

Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Denne metoden introduserer en enkel teknikk for påvisning av endogen monoaminfrigjøring ved hjelp av akutte hjerneskiver. Oppsettet bruker en 48-brønns plate som inneholder en vevsholder for monoaminfrigjøring. Frigjort monoamin analyseres av HPLC kombinert med elektrokjemisk deteksjon. I tillegg gir denne teknikken en screeningmetode for narkotikaoppdagelse.

En platebasert analyse for måling av endogen monoaminfrigjøring i akutte hjerneskiver

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Denne teknikken er en tilpasning av ofte brukte metoder for å undersøke monoaminfrigjøring, slik at måling av endogen frigjøring i stedet for forhåndslastede radiomerkede monoaminer under flere farmakologiske forhold på en gang. De viktigste fordelene med denne teknikken er at det er ganske kostnadseffektivt, flere farmakologiske forhold kan undersøkes samtidig, og vi kan studere endogen monoaminfrigjøring med evnen til å skille mellom vesikulær og transportørmediert utgivelse. For å forberede hjerneskiver fra voksne 250 til 350 gram hannrotter etter høsting, plasserte umiddelbart hjernen og iskald oksygenert disseksjonsbuffer, og skaffer seg 300 mikron koronal hjerneseksjoner fra hver interesseregion.For ytterligere disseksjon av hjerneskivene, flytt forsiktig vevet til glasssklier og bruk et rottehjerneatlas for å identifisere dorsal striatum basert på den mørke strikkede strukturen, og for å identifisere hippocampus basert på nærheten til cortex og dens unike spiralstruktur. Skill høyre og venstre halvkule for bruk som kontroll og eksperimentelle skiver. Dorsal striatum kan videre dissekeres i to millimeter slag.Bruk deretter en plastoverføringspipette med en modifisert spiss for å overføre prøvene til små beholdere nedsenket i oksygenert iskald disseksjonsbuffer med oksygenboblende. For å indusere monoaminfrigjøring, overfør vevsprøvene til hver brønn av en skreddersydd 48 brønnutløpskammer som inneholder 0,5 til en milliliter effluxbuffer per brønn med konstant skånsom boblende og la prøvene gjenopprette i 30 til 50 minutter ved 37 grader Celsius. På slutten av likevektsperioden flytter du vevsholderen med hjernevev til brønner som inneholder 500 mikroliter oksygenert effluxbuffer med eller uten farmakologisk middel, og banker holderen på kanten av brønnen for å forhindre minimal overføring av buffer mellom brønner i en 20 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen flytter du holderen til et nytt sett med brønner som inneholder 500 mikroliter effluxbuffer med eller uten stoffet av interesse og returnerer platen til cellekulturinkubatoren i ytterligere 20 minutter. Under den andre inkubasjonen, overfør løsningen fra brønnene fra den første inkubasjonen til mikrosentrifugerør som inneholder 50 mikroliter av en normal perklorsyre eller fosforsyre på is, og merk rørene nummer én"På slutten av den andre inkubasjonen flytter du vevsholderen for å tømme brønner med platen på is og overfører supernatantene fra den andre inkubasjonen til nye mikrosentrifugerør som inneholder 50 mikroliter av en normal perklorisk eller fosforisk syre på is. Merk disse rørene nummer to"Når alle supernatantene er overført, tilsett en milliliter iskald disseksjonsbuffer til hver vevsbrønn og bruk små pinsett for å overføre hver vevsprøve til et nytt mikrocentrifugerør.Fjern bufferen fra prøverørene og lagre vevet ved minus 80 grader Celsius, og overfør deretter de innsamlede inkubasjonsløsningene til mikrosenterfilterrør for sentrifugering og legg filtratet på is til HPLC-analyse. Sett potensialet til ECD og strømningshastigheten til produsentens anbefaling for å oppdage monoaminer. Last og passende aliquot av hver prøve, inkludert nevrosenderstandarder i HPLC for automatisk injeksjon og deteksjon og la instrumentet fullføre analysen.Bruk deretter HPLC-analyseprogramvaren til å anskaffe og analysere kromatografidataene ved hjelp av en standardkurve som består av hvert monoamin for å oppnå området under kurven basert på produsentens retningslinjer. Etter seks timer med funksjonell analyse forblir vevsprøver levedyktige, mens prøver inkubert med 1% Triton X-100 viser en betydelig reduksjon i MTT-transformasjon. Akutt 20 minutters behandling av hippocampal og prefrontal cortex hjerne seksjoner med amfetamin induserer en betydelig økning i ekstracellulært nivå av hver monoamin.Når prøvene er forbehandlet med fluoksetin, en selektiv serotoninreopptakshemmer, induserte amfetamin økningen i ekstracellulær serotonin i hippocampus og prefrontal cortex forekommer ikke, mens økningen i ekstracellulær dopamin- og noradrenalinproduksjon ikke påvirkes. I tillegg induserer akutt 20 minutters behandling av dorsale striatum slag med amfetamin en 35 ganger økning i ekstracellulær dopaminnivåuttrykk, mens dorsal striatum punch behandling med kokain, en monoamin transporter blokkering, resulterer i en betydelig hemming av amfetamin indusert ekstracellulær dopamin. Å øke konsentrasjonen av ekstracellulær kaliumklorid for å fremkalle membrandepolarisering er tilstrekkelig til å indusere eksocytotisk frigjøring av monoaminer sammenlignet med ubehandlede kontrollforhold, og verken fluoksetin eller kokainbehandling blokkerer denne dype polariseringen indusert økning.Det er viktig å ha rene kuttseksjoner, en presis lokalisering av slag, og for å opprettholde konsistent oksygenering gjennom hele eksperimentet. Hjerneseksjonene kan brukes etter eksperimentering for videre biokjemisk prosessering og analyse, som vestlig blotting og histologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Utarbeidelse av Akutt subventricular sone Slices for kalsium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro og Morfologisk Karakterisering av Nevronale kretser i Akutt Brain Slices hjelp Grupperte patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Utarbeidelse av akutt hjernen skiver med en optimalisert N-Methyl-D-glucamine beskyttende gjenopprettingsmetode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dyptgående Fysiologisk Analyse av Definerte cellepopulasjoner i Akutt vevssnitt av musen Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Anvendelse av automatisert bildestyrt patchklemme for studiet av nevroner i hjernesnitt

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...