Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Fondecyt Initiation Fund N 11191049 a J.A.P. e NIH grant DA038598 à G.E.T.

Todos os experimentos, incluindo manejo de animais e coleta de tecidos, foram realizados de acordo com a Universidade da Flórida e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), seguindo o protocolo aprovado 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Para reagentes e tampão, consulte o Arquivo Suplementar.
1. Prepare fatias agudas do cérebro de ratos
NOTA: Neste experimento foram utilizados ratos machos adultos (250-350 g). No entanto, essa confi...

As medidas de liberação de monoaminas têm sido realizadas durante anos em vários sistemas como células heterólogas, culturas neuronais, sinapstosas cerebrais, fatias cerebrais agudas ex vivo e animais inteiros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<s...

Uma infinidade de doenças neurológicas e psiquiátricas estão associadas à desregulação ou à manutenção insuficiente do neurotransmissor de monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norrepinefrina [NE]) homeostasis1,2,3. Essas condições incluem, mas não se limitam a, depressão1,2, esquizofrenia2, ansiedade2, vício4, menopausa5,6,7, dor8 e doença de Parkinson3. Por exemplo, vários modelos de ratos da menopausa mostraram que a desregulação ou redução de monoaminas dentro do hipocampo, córtex pré-frontal e estriato podem estar associados tanto à depressão quanto ao declínio cognitivo, que é visto em mulheres que experimentam a menopausa. A desregulação das monoaminas nesses modelos tem sido extensivamente examinada por meio do HPLC-ECD, embora os estudos não discriminaram o conteúdo medido do neurotransmissor versus a liberação de neurotransmissores5,6,7. As monoaminas são liberadas clássicamente no espaço extracelular através da liberação vesicular dependente de Ca2+, e são recicladas de volta através de seu respectivo sistema de recaptação de membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)10,11. Por outro lado, os dados sugerem que esses transportadores são capazes de liberar ou monoaminas efflux, uma vez que drogas de abuso como anfetamina (ANFE) e 3,4-Methylenedioximethamfetamina (MDMA) são conhecidas por liberar DA e 5-HT, respectivamente através de seus sistemas de transporte12,13, 14,15,16,17 . Assim, uma compreensão mecanicista adequada da dinâmica de liberação de monoaminas é crucial para o desenvolvimento de farmacoterapeias específicas e direcionadas.
Uma ampla gama de técnicas foram empregadas para estudar a liberação de monoaminas como a Voltammetry Ciálica de Varredura Rápida (FSCV)18, in vivo microdiálise13, imagem19, pré-inincubtação com monoaminas radiolabeled20, optogenética e, mais recentemente, sensores fluorescentes geneticamente codificados e fotometria21,22 . A microdiálise FSCV e in vivo são as principais técnicas utilizadas para o estudo da liberação de monoaminas. O FSCV é usado para estudar a liberação exocitomática estimulada de, principalmente, DA em fatias cerebrais agudas e in vivo23. Como o FSCV usa eletrodos para estimular ou evocar a liberação, a principal fonte de liberação de neurotransmissores é a liberação vesicular dependente de Ca218,24,25,26,27,28,29,30,31 . A microdiálise in vivo juntamente com o HPLC mede mudanças nos níveis de neurotransmissor extracelular usando uma sonda colocada em uma área cerebral de interesse13,32. Semelhante ao FSCV, uma grande limitação à microdiálise in vivo é a dificuldade em determinar a fonte de liberação de neurotransmissores: liberação vesicular dependente de Ca2+ ou dependente de transporte. Vale ressaltar que ambos os métodos permitem a medição direta da liberação de monoamina. Através do recente avanço da optogenética, pesquisas demonstram a detecção da liberação de 5-HT e DA em um curto espaço de tempo com especificidade requintada do tipo celular21,22. No entanto, essas estratégias requerem técnicas e equipamentos complexos e caros, e medem indiretamente a liberação de monoamina, especificamente através da monoamina que liga aos receptores. Além disso, as monoaminas radiolabeladas também são usadas para estudar a dinâmica da monoamina. As monoaminas radiolabeladas podem ser pré-carregadas em vários sistemas de modelo, como células heterólogas que superexpressam cada transporte monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neurônios primários20, sinapstos33,39,41, 42, e cortes cerebrais agudas43,44. No entanto, a radioatividade representa danos potenciais ao experimentador, e os analitos rotulados com trítio podem não recapitular fielmente a dinâmica endógena da monoamina45,46. Sistemas de superfusão combinados com métodos de detecção off-line, como o HPLC-ECD, permitiram a detecção de monoaminas de múltiplas fontes de tecido. Aqui, este protocolo fornece como um método otimizado e de baixo custo, simples e preciso usando fatias cerebrais agudas para medir diretamente a liberação de basal endógeno e estimulada.
As fatias cerebrais agudas permitem testar hipóteses mecanicistas, principalmente porque preservam o microambiente anatômico in vivo, e mantêm sinapses intactas47,48,49,50,51,52. Em alguns estudos, fatias cerebrais agudas ou tecido cerebral picado têm sido usados em conjunto com uma técnica de superfusão usando KCl para estimular a liberação mediada ca2+53,54,55,56. Os sistemas de superfusão têm sido fundamentais para avançar a compreensão do campo sobre os mecanismos de liberação de neurotransmissores, incluindo as monoaminas. No entanto, esses sistemas são relativamente caros, e o número de câmaras disponíveis para análise de tecidos varia de 4 a 12. Em comparação, o método aqui apresentado é barato, permite a medição de 48 amostras de tecido, podendo ser refinado para usar até 96 amostras de tecido. Cada poço dentro da placa de 48 poços contém suportes de tecido que usam filtros para separar o produto liberado do tecido, e as monoaminas liberadas são então coletadas e analisadas pelo HPLC-ECD. É importante ressaltar que este método permite a medição simultânea de 5-HT, DA e NE de diferentes áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal, o hipocampo e o estriado dorsal após o tratamento com agentes farmacológicos que modulam a liberação de monoamina. Assim, o experimentador pode responder a várias perguntas usando um sistema multi-poço barato que aumenta o número de amostras testadas e, assim, reduzindo o número de animais utilizados.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

Neurotransmissores de monoamina estão associados a inúmeras doenças neurológicas e psiquiátricas. Modelos animais de tais condições têm mostrado alterações na liberação e dinâmica de absorção de neurotransmissores de monoamina. Métodos tecnicamente complexos como eletrofisiologia, Voltammetry Ciclílica de Varredura Rápida (FSCV), imagem, microdiálise in vivo, optogenética ou uso de radioatividade são necessários para estudar a função monoamina. O método aqui apresentado é uma abordagem otimizada em duas etapas para detectar a liberação de monoamina em fatias cerebrais agudas usando uma placa de 48 poços contendo suportes teciduais para examinar a liberação de monoamina, e cromatografia líquida de alto desempenho, juntamente com a detecção eletroquímica (HPLC-ECD) para medição de liberação de monoamina. Resumidamente, seções cerebrais de ratos contendo regiões de interesse, incluindo córtex pré-frontal, hipocampo e estriado dorsal foram obtidas usando um cortador de tecido ou vibratome. Essas regiões de interesse foram dissecadas de todo o cérebro e incubadas em um tampão fisiológico oxigenado. A viabilidade foi examinada ao longo do curso de tempo experimental, por 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium brometo (MTT). As regiões cerebrais dissecadas agudamente foram incubadas em diferentes condições de drogas que são conhecidas por induzir a liberação de monoamina através do transportador (anfetamina) ou através da ativação da liberação vesicular exociótica (KCl). Após a incubação, os produtos liberados no supernasciente foram coletados e analisados por meio de um sistema HPLC-ECD. Aqui, a liberação de monoamina basal é detectada pelo HPLC a partir de fatias cerebrais agudas. Esses dados suportam resultados in vivo e in vitro anteriores mostrando que a versão de amph e kcl induzem a liberação de monoamina. Este método é particularmente útil para estudar mecanismos associados à liberação dependente de transporte de monoamina e oferece uma oportunidade de triagem de compostos que afetam a liberação de monoamina de forma rápida e de baixo custo.

Esta técnica descreve o uso de fatias cerebrais para medir a liberação de monoaminas endógenas usando HPLC com detecção eletroquímica baseada em uma placa de 48 poços com um suporte interno de tecido. A configuração experimental é retratada na Figura 1 e Figura 2. Inicialmente, para garantir a viabilidade tecidual até o final da experimentação, foi realizado um ensaio de MTT (4-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenilt...

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A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Esta técnica é uma adaptação de métodos comumente utilizados para examinar a liberação de monoamina, permitindo a medição da liberação endógena em vez de monoaminas radiolabeled pré-carregadas em múltiplas condições farmacológicas ao mesmo tempo. As principais vantagens dessa técnica são que ela é bastante econômica, múltiplas condições farmacológicas podem ser examinadas de uma só vez, e podemos estudar a liberação endógena da monoamina com a capacidade de distinguir entre a liberação mediada vesicular e transportadora. Para preparar fatias cerebrais de ratos machos adultos de 250 a 350 gramas após a colheita, imediatamente coloquei o tampão de dissecção oxigenada do cérebro e do gelo, e adquiriu 300 seções cerebrais coronais de 300 mícrons de cada região de interesse.Para maior dissecção das fatias cerebrais, mova cuidadosamente os tecidos para lâminas de vidro e use um atlas cerebral de rato para identificar o estriado dorsal baseado em sua estrutura estriada escura, e identificar o hipocampo com base em sua proximidade com o córtex e sua estrutura espiral única. Separe os hemisférios direito e esquerdo para seu uso como controle e fatias experimentais. O estriado dorsal pode ser ainda dissecado em socos de dois milímetros.Em seguida, use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta modificada para transferir as amostras para pequenos recipientes imersos em tampão de dissecção gelada oxigenado com borbulhante de oxigênio. Para induzir a liberação de monoamina, transfira as amostras de tecido para cada poço de uma câmara efflux feita sob medida contendo 0,5 a um mililitro de tampão efflux por poço com borbulhamento suave constante e permita que as amostras se recuperem por 30 a 50 minutos a 37 graus Celsius. Ao final do período de equilíbrio, mova o suporte tecidual com tecido cerebral para poços contendo 500 microliters de tampão efflux oxigenado com ou sem agente farmacológico, tocando o suporte na borda do poço para evitar a transferência mínima de tampão entre poços para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, mova o suporte para um novo conjunto de poços contendo 500 microliters de tampão efflux com ou sem a droga de interesse e devolva a placa à incubadora de cultura celular por mais 20 minutos. Durante a segunda incubação, transfira a solução dos poços da primeira incubação para tubos de microcentrifuge contendo 50 microliters de um polclorórico normal ou ácido fosfórico no gelo, e rotular os tubos número um"No final da segunda incubação, mova o suporte de tecido para poços vazios com a placa no gelo e transfira os supernaentes da segunda incubação para novos tubos de microcentrifuuge contendo 50 microlitradores de um polemizador normal ou fosfórico ácido no gelo. Rotule esses tubos número dois"Quando todos os supernantes forem transferidos, adicione um mililitro de tampão de dissecção gelada a cada poço de tecido e use pinças pequenas para transferir cada amostra de tecido para um novo tubo de microcentrifusagem.Remova o tampão dos tubos de amostra e armazene os tecidos a menos 80 graus Celsius, depois transfira as soluções de incubação coletadas em tubos de filtro de microcentrifusagem para centrifugação e coloque o filtrado no gelo até a análise do HPLC. Defina o potencial da ECD e a taxa de fluxo à recomendação do fabricante para detectar monoaminas. Carregar e alíquota apropriada de cada amostra, incluindo padrões neurotransmissores no HPLC para injeção e detecção automática e permitir que o instrumento complete a análise.Em seguida, use o software de análise HPLC para adquirir e analisar os dados do cromatógrafo usando uma curva padrão composta por cada monoamina para obter a área sob a curva com base nas diretrizes do fabricante. Após seis horas de análise funcional, as amostras de tecido permanecem viáveis, enquanto amostras incubadas com 1%Triton X-100 demonstram uma redução significativa na transformação de MTT. Tratamento agudo de 20 minutos de seções cerebrais hipocampais e pré-frontais com anfetamina induz um aumento significativo no nível extracelular de cada monoamina.Quando as amostras são pré-tratadas com fluoxetina, um inibidor seletivo de recaptação de serotonina, o aumento induzido pela anfetamina na serotonina extracelular dentro do hipocampo e no córtex pré-frontal não ocorre, enquanto o aumento da produção extracelular de dopamina e norepinefrina não é afetado. Além disso, o tratamento agudo de 20 minutos de socos dorsais com anfetamina induz um aumento de 35 vezes na expressão de nível de dopamina extracelular, enquanto o tratamento de perfuração de estriatum dorsal com cocaína, um bloqueador de transporte de monoamina, resulta em uma inibição significativa da dopamina extracelular induzida por anfetamina. Aumentar a concentração de cloreto de potássio extracelular para evocar a despolarização da membrana é suficiente para induzir a liberação exototótica de monoaminas em comparação com condições de controle não tratadas, e nem fluoxetina nem tratamento de cocaína bloqueiam esse aumento induzido por polarização profunda.É imperativo ter seções de corte limpo, uma localização precisa de socos, e manter a oxigenação consistente durante todo o experimento. As seções cerebrais podem ser usadas pós-experimentação para posterior processamento e análise bioquímica, como mancha ocidental e histologia.

Research

JoVE Journal

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