Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Fondecyt Initiation Fund N 11191049 для J.A.P. и грантом NIH DA038598 для G.E.T.

Все эксперименты, включая обращение с животными и сбор тканей, проводились в соответствии с Университетом Флориды и Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Городского колледжа Нью-Йорка (IACUC) в соответствии с утвержденными протоколами 201508873 (UF) и 1071 (CCNY). Для реаге...

Измерения высвобождения моноаминов проводились в течение многих лет в ряде систем, таких как гетерологичные клетки, нейронные культуры, синаптосомы мозга, острые срезы мозга ex vivo и целые животные13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 </...

Множество неврологических и психиатрических заболеваний связано с дисрегуляцией или недостаточным поддержанием моноаминового нейромедиатора (дофамин [DA], серотонин [5-HT], норадреналин [NE]) гомеостаза1,2,3. Эти состояния включают, но не ограничиваются ими, депрессию1,2, шизофрению2, беспокойство2, зависимость4, менопаузу5,6,7, боль8 и болезнь Паркинсона3. Например, несколько крысиных моделей менопаузы показали, что дисрегуляция или уменьшение моноаминов в гиппокампе, префронтальной коре и полосатом теле может быть связана как с депрессией, так и с когнитивным снижением, что наблюдается у женщин, испытывающих менопаузу. Дисрегуляция моноаминов в этих моделях была широко изучена с использованием ВЭЖХ-ECD, хотя в исследованиях не проводилось различия между измеренным содержанием нейротрансмиттеров и высвобождением нейротрансмиттеров5,6,7. Моноамины классически высвобождаются во внеклеточное пространство через Ca2+-зависимое везикулярное высвобождение9 и рециркулируются обратно через соответствующую систему обратного захвата плазматической мембраны (транспортер дофамина, DAT; транспортер серотонина, SERT; транспортер норадреналина, NET)10,11. И наоборот, данные свидетельствуют о том, что эти транспортеры способны высвобождать или выбрасывать моноамины, поскольку наркотики злоупотребления, такие как амфетамин (AMPH) и 3,4-метилендиоксиметамфетамин (MDMA), как известно, высвобождают DA и 5-HT, соответственно, через их транспортные системы12,13,14,15,16,17 . Таким образом, правильное механистическое понимание динамики высвобождения моноаминов имеет решающее значение для разработки конкретных и целевых фармакотерапий.
Для изучения высвобождения моноаминов был использован широкий спектр методов, таких как циклическая вольтамперметрия с быстрым сканированием (FSCV)18, микродиализ in vivo13, визуализация19, преинкубация с радиомаркированными моноаминами20, оптогенетика и, в последнее время, генетически закодированные флуоресцентные датчики и фотометрия21,22 . FSCV и микродиализ in vivo являются основными методами, используемыми для изучения высвобождения моноаминов. FSCV используется для изучения стимулированного экзоцитотического высвобождения, в первую очередь, DA в острых срезах мозга и in vivo23. Поскольку FSCV использует электроды для стимуляции или вызова высвобождения, основным источником высвобождения нейротрансмиттера является Ca2+-зависимое везикулярное высвобождение18,24,25,26,27,28,29,30,31 . Микродиализ in vivo в сочетании с ВЭЖХ измеряет изменения уровней внеклеточных нейротрансмиттеров с помощью зонда, помещенного в интересующую область мозга13,32. Подобно FSCV, основным ограничением микродиализа in vivo является трудность определения источника высвобождения нейротрансмиттера: Ca2+ зависимое везикулярное высвобождение или транспортер-зависимый. Примечательно, что оба метода позволяют проводить прямое измерение высвобождения моноаминов. Благодаря недавнему прогрессу оптогенетики исследования демонстрируют обнаружение высвобождения 5-HT и DA за короткий промежуток времени с изысканной специфичностью клеточного типа21,22. Однако эти стратегии требуют сложных и дорогостоящих методов и оборудования и косвенно измеряют высвобождение моноаминов, в частности, через связывание моноаминов с рецепторами. Кроме того, радиомаркированные моноамины также используются для изучения динамики моноаминов. Радиомаркированные моноамины могут быть предварительно загружены в различные модельные системы, такие как гетерологичные клетки, сверхэкспрессирующие каждый транспортер моноаминов20,33,34,35,36,37,38,39,40, первичные нейроны20, синаптосомы33,39,41, 42, и острые мозговые срезы43,44. Однако радиоактивность представляет потенциальный вред для экспериментатора, и меченые тритием аналиты могут не точно повторять эндогенную динамику моноаминов45,46. Суперфузионные системы в сочетании с автономными методами обнаружения, такими как ВЭЖХ-ECD, позволили обнаруживать моноамины из нескольких тканевых источников. Здесь этот протокол обеспечивает как оптимизированный и недорогой, простой и точный метод с использованием острых срезов мозга для непосредственного измерения эндогенного базального и стимулированного высвобождения моноаминов.
Острые срезы мозга позволяют проверять механистические гипотезы, прежде всего потому, что они сохраняют in vivo анатомическую микросреду и поддерживают неповрежденные синапсы47,48,49,50,51,52. В нескольких исследованиях острые срезы мозга или измельченная мозговая ткань использовались в сочетании с техникой суперфузии с использованием KCl для стимуляции опосредованного высвобождения Ca2+53,54,55,56. Суперфузионные системы имеют решающее значение для продвижения понимания в этой области механизмов высвобождения нейротрансмиттеров, включая моноамины. Однако эти системы относительно дороги, а количество камер, доступных для анализа тканей, колеблется в пределах 4-12. Для сравнения, метод, представленный здесь, является недорогим, позволяет измерять 48 образцов тканей и может быть усовершенствован для использования до 96 образцов тканей. Каждая скважина в 48-луночной пластине содержит тканевые держатели, которые используют фильтры для отделения высвобождаемого продукта от ткани, а высвобождаемые моноамины затем собираются и анализируются с помощью ВЭЖХ-ECD. Важно отметить, что этот метод позволяет одновременно измерять высвобождение 5-HT, DA и NE из различных областей мозга, таких как префронтальная кора, гиппокамп и дорсальное полосатое тело после лечения фармакологическими агентами, которые модулируют высвобождение моноаминов. Таким образом, экспериментатор может ответить на несколько вопросов, используя недорогую многолуночную систему, которая увеличивает количество тестируемых образцов и тем самым уменьшает количество используемых животных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

Моноаминовые нейротрансмиттеры связаны с многочисленными неврологическими и психическими заболеваниями. Животные модели таких состояний показали изменения в динамике высвобождения и поглощения моноаминных нейротрансмиттеров. Технически сложные методы, такие как электрофизиология, циклическая вольтаметрия быстрого сканирования (FSCV), визуализация, микродиализ in vivo, оптогенетика или использование радиоактивности, необходимы для изучения функции моноаминов. Метод, представленный здесь, представляет собой оптимизированный двухэтапный подход к обнаружению высвобождения моноаминов в острых срезах мозга с использованием 48-луночной пластины, содержащей тканевые держатели для изучения высвобождения моноаминов, и высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с электрохимическим обнаружением (ВЭЖХ-ECD) для измерения высвобождения моноамина. Вкратце, участки мозга крыс, содержащие области, представляющие интерес, включая префронтальную кору, гиппокамп и дорсальный стриатум, были получены с использованием тканевого слайсера или вибратома. Эти области, представляющие интерес, были рассечены из всего мозга и инкубированы в насыщенном кислородом физиологическом буфере. Жизнеспособность исследовали на протяжении всего экспериментального временного хода с помощью анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Остро рассеченные области мозга инкубировали в различных условиях наркотиков, которые, как известно, индуцируют высвобождение моноамина через транспортер (амфетамин) или через активацию экзоцитотического везикулярного высвобождения (KCl). После инкубации высвобождаемые продукты в супернатанте собирали и анализировали через систему ВЭЖХ-ЭТП. Здесь базальное высвобождение моноамина обнаруживается методом ВЭЖХ из острых срезов мозга. Эти данные подтверждают предыдущие результаты in vivo и in vitro, показывающие, что AMPH и KCl индуцируют высвобождение моноаминов. Этот метод особенно полезен для изучения механизмов, связанных с моноаминным транспортер-зависимым высвобождением, и дает возможность быстро и недорого экранировать соединения, влияющие на высвобождение моноаминов.

Этот метод описывает использование срезов мозга для измерения высвобождения эндогенных моноаминов с использованием ВЭЖХ с электрохимическим обнаружением на основе 48-луночной пластины с внутренним тканевым держателем. Экспериментальная установка показана на <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Этот метод вводит простую технику обнаружения эндогенного высвобождения моноаминов с использованием острых срезов мозга. Установка использует 48-луночную пластину, содержащую держатель ткани для высвобождения моноамина. Высвобождаемый моноамин анализируется методом ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим обнаружением. Кроме того, этот метод обеспечивает метод скрининга для обнаружения лекарств.

Пластинчатый анализ для измерения эндогенного высвобождения моноаминов в острых срезах мозга

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Этот метод представляет собой адаптацию широко используемых методов для изучения высвобождения моноаминов, позволяющих измерять эндогенное высвобождение, а не предварительно загруженные радиомаркированные моноамины в нескольких фармакологических условиях одновременно. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она достаточно экономически эффективна, можно исследовать сразу несколько фармакологических состояний, и мы можем изучать эндогенное высвобождение моноаминов со способностью различать везикулярное и транспортное опосредованное высвобождение. Чтобы приготовить срезы мозга от взрослых самцов крыс весом от 250 до 350 граммов после сбора урожая, сразу же поместили в мозг и ледяной холод насыщен кислородом рассеченный буфер и приобрели 300 микронных корональных участков мозга из каждой интересующей области.Для дальнейшего рассечения срезов мозга осторожно переместите ткани на стеклянные слайды и используйте атлас мозга крысы, чтобы идентифицировать дорсальный стриатум на основе его темной полосатой структуры и идентифицировать гиппокамп на основе его близости к коре и его уникальной спиральной структуре. Разделите правое и левое полушария для их использования в качестве контрольных и экспериментальных срезов. Дорсальное полосатое тело может быть дополнительно рассечено на два миллиметровых удара.Затем используйте пластиковую передаточную пипетку с модифицированным наконечником для переноса образцов в небольшие контейнеры, погруженные в насыщенный кислородом ледяной буфер рассечения с пузырьками кислорода. Чтобы индуцировать высвобождение моноамина, перенесите образцы тканей в каждую скважину изготовленной на заказ камеры оттока из 48 скважин, содержащей от 0,5 до одного миллилитра буфера эффлюкса на скважину с постоянным мягким бурлением, и позвольте образцам восстанавливаться в течение 30-50 минут при температуре 37 градусов Цельсия. В конце периода уравновешивания переместите тканевый держатель с мозговой тканью в скважины, содержащие 500 микролитров кислородного буфера эффлюкса с фармакологическим агентом или без него, постукивая держателем по краю скважины, чтобы предотвратить минимальный перенос буфера между лунками для 20-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия.В конце инкубации переместите держатель в новый набор лунок, содержащих 500 микролитров буфера эффлюкса с интересующим препаратом или без него и верните пластину в инкубатор клеточной культуры еще на 20 минут. Во время второй инкубации перенесите раствор из скважин из первой инкубации в микроцентрифужные трубки, содержащие 50 микролитров одной нормальной хлорной или фосфорной кислоты на льду, и маркируйте трубки номер один"В конце второй инкубации переместите держатель ткани в пустые колодцы с пластиной на льду и перенесите супернатанты из второй инкубации в новые микроцентрифужные трубки, содержащие 50 микролитров одной нормальной хлорной или фосфорной кислота на льду. Когда все супернатанты будут перенесены, добавьте один миллилитр буфера для расслоения ледяного холода в каждый колодец ткани и используйте небольшие пинцеты для переноса каждого образца ткани в новую микроцентрифужную трубку.Извлеките буфер из пробирок и храните ткани при минус 80 градусах Цельсия, затем перенесите собранные инкубационные растворы в микроцентрифужные фильтрующие трубки для центрифугирования и поместите фильтрат на лед до анализа ВЭЖХ. Установите потенциал ECD и скорость потока в соответствии с рекомендацией производителя для обнаружения моноаминов. Нагрузка и соответствующая аликвота каждого образца, включая стандарты нейротрансмиттеров в ВЭЖХ для автоматической инъекции и обнаружения и позволяют прибору завершить анализ.Затем используйте программное обеспечение для анализа ВЭЖХ для получения и анализа данных хроматографа с использованием стандартной кривой, состоящей из каждого моноамина, чтобы получить площадь под кривой на основе рекомендаций производителя. После шести часов функционального анализа образцы тканей остаются жизнеспособными, в то время как образцы, инкубированные с 1% Triton X-100, демонстрируют значительное снижение трансформации MTT. Острая 20-минутная обработка отделов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга амфетамином вызывает значительное повышение внеклеточного уровня каждого моноамина.Когда образцы предварительно обрабатывают флуоксетином, селективным ингибитором обратного захвата серотонина, вызванное амфетамином увеличение внеклеточного серотонина в гиппокампе и префронтальной коре не происходит, в то время как увеличение внеклеточной выработки дофамина и норадреналина не затрагивается. Кроме того, острая 20-минутная обработка дорсальных ударов стриатума амфетамином вызывает 35-кратное увеличение экспрессии внеклеточного уровня дофамина, в то время как лечение дорсальным полосатым стриатумом кокаином, блокатором моноаминового транспортера, приводит к значительному ингибированию внеклеточного дофамина, вызванного амфетамином. Увеличение концентрации внеклеточного хлорида калия для вызова деполяризации мембраны достаточно, чтобы индуцировать экзоцитотическое высвобождение моноаминов по сравнению с необработанными контрольными условиями, и ни флуоксетин, ни лечение кокаином не блокируют это глубокое поляризационное увеличение.Крайне важно иметь чистые секции, точную локализацию ударов и поддерживать постоянную оксигенацию на протяжении всего эксперимента. Участки мозга могут быть использованы после экспериментов для дальнейшей биохимической обработки и анализа, таких как вестерн-блоттинг и гистология.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Подготовка Острый субвентрикулярной фрагменты зона для кальция изображений

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Подготовка фрагментов острого мозга, с помощью оптимизированного N-метил-D-glucamine защитные восстановления метод

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Углубленный Физиологический анализ клеточных популяций Defined при остром Tissue Ломтики Мыши вомероназальные органа

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Применение автоматизированного патч-зажима для изображений для изучения нейронов в средах мозга

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Оценка долгосрочной депрессии индукции в взрослых церебеллярной ломтики

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...