Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones Fondecyt Initiation Fund N 11191049 a J.A.P. y la subvención DE NIH DA038598 a G.E.T.

Todos los experimentos, incluido el manejo de animales y la recolección de tejidos, se llevaron a cabo de acuerdo con la Universidad de Florida y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del City College of New York, siguiendo el protocolo aprobado 201508873 (UF) y 1071 (CCNY). Para reactivos y tampón, consulte el Archivo complementario.
1. Prepara rebanadas agudas de cerebro de rata
NOTA: En este experimento se utilizaron ratas...

Las mediciones de liberación de monoamina se han realizado durante años en varios sistemas como células heterólogas, cultivos neuronales, sinaptosomas cerebrales, cortes cerebrales agudos ex vivo y animales enteros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 </s...

Una gran cantidad de enfermedades neurológicas y psiquiátricas se asocian con la desregulación o el mantenimiento insuficiente de la homeostasis del neurotransmisor monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norepinefrina [NE])1,2,3. Estas afecciones incluyen, entre otras, depresión1,2, esquizofrenia2, ansiedad2, adicción4, menopausia5,6,7, dolor8 y enfermedad de Parkinson3. Por ejemplo, varios modelos de menopausia en ratas han demostrado que la desregulación o reducción de las monoaminas dentro del hipocampo, la corteza prefrontal y el cuerpo estriado puede estar asociada tanto con la depresión como con el deterioro cognitivo, que se observa en mujeres que experimentan la menopausia. La desregulación de las monoaminas en estos modelos ha sido ampliamente examinada utilizando HPLC-ECD, aunque los estudios no discriminaron entre el contenido medido de neurotransmisores versus la liberación de neurotransmisores5,6,7. Las monoaminas se liberan clásicamente en el espacio extracelular a través de la liberación vesicular dependiente de Ca2+9, y se reciclan de nuevo a través de su respectivo sistema de recaptación de la membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)10,11. Por el contrario, los datos sugieren que estos transportadores son capaces de liberar o efluir monoaminas, ya que se sabe que las drogas de abuso como la anfetamina (AMPH) y la 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) liberan DA y 5-HT, respectivamente, a través de sus sistemas de transporte12,13,14,15,16,17 . Por lo tanto, una comprensión mecanicista adecuada de la dinámica de liberación de monoamina es crucial para desarrollar farmacoterapias específicas y específicas.
Se ha empleado una amplia gama de técnicas para estudiar la liberación de monoaminas, como la voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV)18, la microdiálisis in vivo13, la imagen19, la preincubación con monoaminas radiomarcadas20, la optogenética y, más recientemente, los sensores fluorescentes y la fotometría codificados genéticamente21,22 . FSCV y la microdiálisis in vivo son las principales técnicas utilizadas para estudiar la liberación de monoamina. FSCV se utiliza para estudiar la liberación exocitótica estimulada de, principalmente, DA en cortes cerebrales agudos e in vivo23. Debido a que FSCV utiliza electrodos para estimular o evocar la liberación, la fuente principal de liberación de neurotransmisores es la liberación vesicular dependiente de Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdiálisis in vivo junto con la HPLC mide los cambios en los niveles de neurotransmisores extracelulares utilizando una sonda colocada en un área cerebral de interés13,32. Al igual que el FSCV, una limitación importante de la microdiálisis in vivo es la dificultad para determinar la fuente de liberación de neurotransmisores: liberación vesicular dependiente de Ca2+ o dependiente del transportador. Cabe destacar que ambos métodos permiten la medición directa de la liberación de monoamina. A través del reciente avance de la optogenética, la investigación demuestra la detección de la liberación de 5-HT y DA en un corto período de tiempo con una exquisita especificidad de tipo celular21,22. Sin embargo, estas estrategias requieren técnicas y equipos complejos y costosos, e indirectamente miden la liberación de monoamina, específicamente a través de la unión de monoamina a los receptores. Además, las monoaminas radiomarcadas también se utilizan para estudiar la dinámica de la monoamina. Las monoaminas radiomarcadas pueden estar precargadas en varios sistemas modelo, como células heterólogas que sobreexpresan cada transportador de monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neuronas primarias20, sinaptosomas33,39,41, 42, y cortes cerebrales agudos43,44. Sin embargo, la radiactividad supone un daño potencial para el experimentador, y los analitos marcados con tritio pueden no recapitular fielmente la dinámica endógena de la monoamina45,46. Los sistemas de superfusión combinados con métodos de detección fuera de línea como HPLC-ECD han permitido la detección de monoaminas de múltiples fuentes tisulares. Aquí, este protocolo proporciona como un método optimizado y de bajo costo, simple y preciso que utiliza cortes cerebrales agudos para medir directamente la liberación de monoamina basal endógena y estimulada.
Las rebanadas cerebrales agudas permiten probar hipótesis mecanicistas, principalmente porque preservan el microambiente anatómico in vivo y mantienen intactas las sinapsis47,48,49,50,51,52. En algunos estudios, se han utilizado cortes cerebrales agudos o tejido cerebral picado junto con una técnica de superfusión utilizando KCl para estimular la liberación mediada por Ca2+53,54,55,56. Los sistemas de superfusión han sido fundamentales para avanzar en la comprensión del campo de los mecanismos de liberación de neurotransmisores, incluidas las monoaminas. Sin embargo, estos sistemas son relativamente caros, y el número de cámaras disponibles para el análisis de tejidos oscila entre 4 y 12. En comparación, el método presentado aquí es económico, permite la medición de 48 muestras de tejido y puede refinarse para usar hasta 96 muestras de tejido. Cada pozo dentro de la placa de 48 pocillos contiene soportes de tejido que utilizan filtros para separar el producto liberado del tejido, y las monoaminas liberadas son recolectadas y analizadas por HPLC-ECD. Es importante destacar que este método permite la medición simultánea de la liberación de 5-HT, DA y NE de diferentes áreas del cerebro, como la corteza prefrontal, el hipocampo y el estriado dorsal después del tratamiento con agentes farmacológicos que modulan la liberación de monoamina. Por lo tanto, el experimentador puede responder a múltiples preguntas utilizando un sistema económico de múltiples pocillos que aumenta el número de muestras analizadas y, por lo tanto, reduce el número de animales utilizados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

Los neurotransmisores monoamina están asociados con numerosas dolencias neurológicas y psiquiátricas. Los modelos animales de tales condiciones han mostrado alteraciones en la dinámica de liberación y absorción de neurotransmisores monoamina. Se requieren métodos técnicamente complejos como la electrofisiología, la voltamperometría cíclica de escaneo rápido (FSCV), la obtención de imágenes, la microdiálisis in vivo, la optogenética o el uso de radiactividad para estudiar la función de la monoamina. El método presentado aquí es un enfoque optimizado de dos pasos para detectar la liberación de monoamina en cortes cerebrales agudos utilizando una placa de 48 pocillos que contiene soportes de tejido para examinar la liberación de monoamina, y cromatografía líquida de alto rendimiento junto con detección electroquímica (HPLC-ECD) para la medición de la liberación de monoamina. Brevemente, las secciones cerebrales de rata que contienen regiones de interés, incluida la corteza prefrontal, el hipocampo y el estriado dorsal, se obtuvieron utilizando una cortadora de tejido o vibrátomo. Estas regiones de interés fueron diseccionadas de todo el cerebro e incubadas en un tampón fisiológico oxigenado. La viabilidad se examinó a lo largo del curso de tiempo experimental, mediante un ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Las regiones cerebrales agudamente diseccionadas se incubaron en diferentes condiciones de drogas que se sabe que inducen la liberación de monoamina a través del transportador (anfetamina) o a través de la activación de la liberación vesicular exocitótica (KCl). Después de la incubación, los productos liberados en el sobrenadante se recolectaron y analizaron a través de un sistema HPLC-ECD. Aquí, la liberación basal de monoamina es detectada por HPLC a partir de cortes cerebrales agudos. Estos datos respaldan los resultados previos in vivo e in vitro que muestran que AMPH y KCl inducen la liberación de monoamina. Este método es particularmente útil para estudiar los mecanismos asociados con la liberación dependiente del transportador de monoamina y brinda la oportunidad de detectar compuestos que afectan la liberación de monoamina de una manera rápida y de bajo costo.

Esta técnica describe el uso de rodajas cerebrales para medir la liberación de monoaminas endógenas utilizando HPLC con detección electroquímica basada en una placa de 48 pocillos con un soporte de tejido interno. La configuración experimental se representa en la Figura 1 y la Figura 2. Inicialmente, para asegurar la viabilidad tisular al final de la experimentación, se realizó un ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiaz...

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A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Este método introduce una técnica simple para la detección de la liberación endógena de monoamina utilizando cortes cerebrales agudos. La configuración utiliza una placa de 48 pocillos que contiene un soporte de tejido para la liberación de monoamina. La monoamina liberada se analiza mediante HPLC junto con la detección electroquímica. Además, esta técnica proporciona un método de detección para el descubrimiento de fármacos.

Un ensayo basado en placas para la medición de la liberación endógena de monoamina en cortes cerebrales agudos

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Esta técnica es una adaptación de los métodos comúnmente utilizados para examinar la liberación de monoamina, lo que permite la medición de la liberación endógena en lugar de monoaminas radiomarcadas precargadas bajo múltiples condiciones farmacológicas a la vez. Las principales ventajas de esta técnica son que es bastante rentable, se pueden examinar múltiples condiciones farmacológicas a la vez, y podemos estudiar la liberación endógena de monoamina con la capacidad de distinguir entre liberación mediada por vesiculares y transportadores. Para preparar rebanadas cerebrales de ratas macho adultas de 250 a 350 gramos después de la cosecha, inmediatamente colocó el cerebro y el tampón de disección oxigenada helada, y adquirió secciones cerebrales coronales de 300 micras de cada región de interés.Para una mayor disección de las rebanadas cerebrales, mueva cuidadosamente los tejidos a portaobjetos de vidrio y use un atlas cerebral de rata para identificar el estriado dorsal en función de su estructura estriada oscura, y para identificar el hipocampo en función de su proximidad a la corteza y su estructura espiral única. Separar los hemisferios derecho e izquierdo para su uso como cortes de control y experimentales. El estriado dorsal se puede diseccionar aún más en punzones de dos milímetros.Luego use una pipeta de transferencia de plástico con una punta modificada para transferir las muestras a pequeños recipientes sumergidos en tampón de disección helado oxigenado con burbujeo de oxígeno. Para inducir la liberación de monoamina, transfiera las muestras de tejido a cada pozo de una cámara de eflujo de 48 pocillos hecha a medida que contenga de 0.5 a un mililitro de tampón de eflujo por pozo con burbujeo suave constante y permita que las muestras se recuperen durante 30 a 50 minutos a 37 grados Centígrados. Al final del período de equilibrio, mueva el soporte de tejido con tejido cerebral a pozos que contengan 500 microlitros de tampón de eflujo oxigenado con o sin agente farmacológico, golpeando el soporte en el borde del pozo para evitar la transferencia mínima de tampón entre pozos durante una incubación de 20 minutos a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, mueva el soporte a un nuevo conjunto de pocillos que contengan 500 microlitros de tampón de eflujo con o sin el medicamento de interés y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 20 minutos adicionales. Durante la segunda incubación, transfiera la solución de los pocillos de la primera incubación a tubos de microcentrífuga que contengan 50 microlitros de un ácido perclórico o fosfórico normal en hielo, y etiquete los tubos número uno"Al final de la segunda incubación, mueva el soporte de tejido a pozos vacíos con la placa sobre hielo y transfiera los sobrenadantes de la segunda incubación a nuevos tubos de microcentrífugos que contengan 50 microlitros de un perclórico o fosfórico normal ácido sobre hielo. Etiquete estos tubos como número dos"Cuando todos los sobrenadantes hayan sido transferidos, agregue un mililitro de tampón de disección helada a cada pocillo de tejido y use pinzas pequeñas para transferir cada muestra de tejido a un nuevo tubo de microcentrífuga.Retire el tampón de los tubos de muestra y almacene los tejidos a menos 80 grados centígrados, luego transfiera las soluciones de incubación recolectadas a los tubos de filtro de microcentrífugas para centrifugación y coloque el filtrado en hielo hasta el análisis de HPLC. Establezca el potencial del ECD y el caudal según la recomendación del fabricante para detectar monoaminas. Carga y alícuota apropiada de cada muestra, incluidos los estándares de neurotransmisores en el HPLC para autoinyección y detección, y permiten que el instrumento complete el análisis.Luego use el software de análisis HPLC para adquirir y analizar los datos del cromatógrafo utilizando una curva estándar compuesta por cada monoamina para obtener el área bajo la curva según las pautas del fabricante. Después de seis horas de análisis funcional, las muestras de tejido siguen siendo viables, mientras que las muestras incubadas con 1%Triton X-100 demuestran una reducción significativa en la transformación de MTT. El tratamiento agudo de 20 minutos de las secciones cerebrales del hipocampo y la corteza prefrontal con anfetamina induce un aumento significativo en el nivel extracelular de cada monoamina.Cuando las muestras se tratan previamente con fluoxetina, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina, el aumento inducido por la anfetamina en la serotonina extracelular dentro del hipocampo y la corteza prefrontal no ocurre, mientras que el aumento en la producción extracelular de dopamina y norepinefrina no se ve afectado. Además, el tratamiento agudo de 20 minutos de los punzones de estriado dorsal con anfetamina induce un aumento de 35 veces en la expresión del nivel de dopamina extracelular, mientras que el tratamiento con punzón estriado dorsal con cocaína, un bloqueador transportador de monoamina, da como resultado una inhibición significativa de la dopamina extracelular inducida por anfetamina. El aumento de la concentración de cloruro de potasio extracelular para evocar la despolarización de la membrana es suficiente para inducir la liberación exocitótica de monoaminas en comparación con las condiciones de control no tratadas, y ni la fluoxetina ni el tratamiento con cocaína bloquean este aumento inducido por la polarización profunda.Es imperativo tener secciones de corte limpias, una localización precisa de los punzones y mantener una oxigenación constante durante todo el experimento. Las secciones cerebrales se pueden utilizar después de la experimentación para un mayor procesamiento y análisis bioquímico, como western blotting e histología.

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