Name: a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag Fondecyt Initiation Fund N 11191049 till J.A.P. och NIH-bidrag DA038598 till G.E.T.

Alla experiment, inklusive djurhantering och vävnadsinsamling, utfördes i enlighet med University of Florida och City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), enligt det godkända protokollet 201508873 (UF) och 1071 (CCNY). För reagenser och buffert, se tilläggsfilen.
1. Förbered akuta råtthjärnskivor
OBS: I detta experiment användes vuxna hanråttor (250-350 g). Denna uppsättning är dock funktionell för olik...

Monoaminfrisättningsmätningar har utförts i flera år i ett antal system som heterologa celler, neuronala kulturer, hjärnsynaptosomer, ex vivo akuta hjärnskivor och hela djur13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<su...

En mängd neurologiska och psykiatriska sjukdomar är associerade med dysregulation eller otillräckligt underhåll av monoamin signalsubstansen (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homeostas1,2,3. Dessa tillstånd inkluderar, men är inte begränsade till, depression1,2, schizofreni2, ångest2, missbruk4, klimakteriet5,6,7, smärta8 och Parkinsons sjukdom3. Till exempel har flera råttmodeller av klimakteriet visat att dysregulation eller minskning av monoaminer inom hippocampus, prefrontal cortex och striatum kan vara förknippade med både depression och kognitiv nedgång, vilket ses hos kvinnor som upplever klimakteriet. Dysregulation av monoaminer i dessa modeller har undersökts utförligt med hplc-ECD, även om studierna inte diskriminerade mellan uppmätt signalsubstansinnehåll jämfört med neurotransmittor release5,6,7. Monoaminer frigörs klassiskt i det extracellulära utrymmet genom Ca2 +-beroende vesikulär frisättning9, och återvinns tillbaka genom deras respektive plasmamembranåterupptagssystem (dopamintransportör, DAT; serotonintransportör, SERT; noradrenalintransportör, NET)10,11. Omvänt tyder data på att dessa transportörer kan frigöra eller effluxmonaminer, eftersom droger av missbruk som amf och 3,4-Metylendioximetamfetamin (MDMA) är kända för att släppa DA respektive 5-HT, genom sina transportsystem12,13,14,15,16,17 . Således är en korrekt mekanistisk förståelse av monoamin release dynamik avgörande för att utveckla specifika och riktade farmakoterapier.
Ett brett spektrum av tekniker har använts för att studera monoaminfrisättning som Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo microdialys13, imaging19, preincubation med radiomärkta monoaminer20, optogenetik och mer nyligen genetiskt kodade fluorescerande sensorer och fotometri21,22 . FSCV och in vivo mikrodialys är de primära teknikerna som används för att studera monoaminfrisättning. FSCV används för att studera stimulerad exocytotisk frisättning av, främst, DA i akuta hjärnskivor och in vivo23. Eftersom FSCV använder elektroder för att stimulera eller framkalla frisättning är den primära källan till frisättning av signalsubstansen Ca2+-beroende vesikulär frisättning18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialys i kombination med HPLC mäter förändringar i extracellulära signalsubstansnivåer med hjälp av en sond placerad i ett hjärnområde av intresse13,32. I likhet med FSCV är en stor begränsning av in vivo mikrodialys svårigheten att bestämma källan till neurotransmittor release: Ca2 + beroende vesikulär frisättning eller transportör beroende. Anmärkningsvärt, båda metoderna möjliggör direkt mätning av monoaminfrisättning. Genom den senaste utvecklingen av optogenetik visar forskning upptäckt av 5-HT och DA-frisättning på kort tid med utsökt celltyps specificitet21,22. Dessa strategier kräver dock komplexa och kostsamma tekniker och utrustning, och indirekt mäta monoaminfrisättning, särskilt genom monoaminbindning till receptorer. Vidare används radiomärkta monoaminer också för att studera monoamindynamik. Radiomärkta monoaminer kan förinstalleras i olika modellsystem såsom heterologa celler som överuttrycker varje monoamintransportör20,33,34,35,36,37,38,39,40, primära nervceller20, synaptosomer33,39,41, 42, och akut hjärnskivor43,44. Radioaktivitet utgör dock potentiell skada för experimenteraren, och de tritiummärkta analyterna får inte troget rekapitulera endogen monoamindynamik45,46. Superfusionssystem i kombination med off-line detektionsmetoder såsom HPLC-ECD har gjort det möjligt att detektion av monoaminer från flera vävnadskällor. Här ger detta protokoll som en optimerad och billig, enkel och exakt metod med hjälp av akuta hjärnskivor för att direkt mäta endogen basal och stimulerad monoaminfrisättning.
Akuta hjärnskivor gör det möjligt att testa mekanistiska hypoteser, främst eftersom de bevarar in vivo anatomisk mikromiljö och upprätthåller intakt synapser47,48,49,50,51,52. I några studier har akuta hjärnskivor eller hackad hjärnvävnad använts tillsammans med en superfusionsteknik med KCl för att stimulera Ca2 + medierad frisättning53,54,55,56. Superfusionssystem har varit avgörande för att främja fältets förståelse av signalsubstansens frisättningsmekanismer, inklusive monoaminer. Dessa system är dock relativt dyra, och antalet kammare som är tillgängliga för vävnadsanalys varierar från 4-12. I jämförelse är metoden som presenteras här billig, tillåter mätning av 48 vävnadsprover och kan förfinas för att använda upp till 96 vävnadsprover. Varje brunn inom 48-brunnsplattan innehåller vävnadshållare som använder filter för att separera den frigjorda produkten från vävnaden, och frigjorda monoaminer samlas sedan in och analyseras av HPLC-ECD. Viktigt är att denna metod möjliggör samtidig mätning av 5-HT, DA och NE frisättning från olika hjärnområden såsom prefrontal cortex, hippocampus och dorsala striatum efter behandling med farmakologiska medel som modulerar monoamin release. Således kan experimenteraren svara på flera frågor med hjälp av ett billigt flerbrunnssystem som ökar antalet testade prover och därmed minskar antalet djur som används.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 Well plate</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A998-1</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Ahydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Software</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1002608421</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC, Decade Amperometric</td>
			<td>Anetc</td>
			<td></td>
			<td>HPLC, LC-EC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Amuza</td>
			<td></td>
			<td>HPLC HTEC-510.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asrobic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C7554</td>
			<td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M6494</td>
			<td>MTT Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29300-606</td>
			<td>Assay; protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V800010</td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pargyline Clorohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8013</td>
			<td>Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Mobile Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12636</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1001655559</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precisonary VF-21-0Z</td>
			<td>Precissonary</td>
			<td></td>
			<td>Compresstome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2714</td>
			<td>Lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>KH Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>MTT Assay / Lysis buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plate-based assay for the measurement of endogenous monoamine release in acute brain slices

Monoamin signalsubstanser är associerade med många neurologiska och psykiatriska sjukdomar. Djurmodeller av sådana tillstånd har visat förändringar i monoamin neurotransmittor release och upptag dynamik. Tekniskt komplexa metoder som elektrofysiologi, snabbskanning cyklisk voltammetri (FSCV), avbildning, in vivo mikrodialys, optogenetik eller användning av radioaktivitet krävs för att studera monoaminfunktion. Metoden som presenteras här är en optimerad tvåstegsmetod för att upptäcka monoaminfrisättning i akuta hjärnskivor med hjälp av en 48-välplatta som innehåller vävnadshållare för att undersöka monoaminfrisättning och högpresterande vätskekromatografi i kombination med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) för monoaminfrisättningsmätning. Kortfattat erhölls rått hjärnavsnitt som innehåller regioner av intresse, inklusive prefrontal cortex, hippocampus och dorsal striatum med hjälp av en vävnadsdelare eller vibratom. Dessa regioner av intresse dissekerades från hela hjärnan och inkuberades i en syresatt fysiologisk buffert. Livskraften undersöktes under hela den experimentella tidskursen, med 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analys. De akut dissekerade hjärnregionerna inkuberades i olika läkemedelsförhållanden som är kända för att inducera monoaminfrisättning genom transportören (amfetamin) eller genom aktivering av exocytotisk vesikulär frisättning (KCl). Efter inkubation samlades de frigjorda produkterna i supernatanten in och analyserades genom ett HPLC-ECD-system. Här detekteras basal monoaminfrisättning av HPLC från akuta hjärnskivor. Dessa data stöder tidigare in vivo- och in vitro-resultat som visar att AMPH och KCl inducerar monoaminfrisättning. Denna metod är särskilt användbar för att studera mekanismer i samband med monoamin transportörberoende frisättning och ger en möjlighet att screena föreningar som påverkar monoamin release på ett snabbt och billigt sätt.

Denna teknik beskriver användningen av hjärnan skivor för att mäta frisättningen av endogena monoaminer med HPLC med elektrokemisk detektion baserad i en 48-väl platta med en inre vävnad hållare. Experimentell uppsättning visas i figur 1 och figur 2. Inledningsvis, för att säkerställa vävnad livskraft i slutet av experimentet, utfördes en MTT (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, en tetrazol) ...

Watch this Scientific Journal Video about A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices at JoVE.com

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Denna metod introducerar en enkel teknik för detektion av endogen monoaminfrisättning med hjälp av akuta hjärnskivor. Inställningarna använder en 48-brunnsplatta som innehåller en vävnadshållare för monoaminfrisättning. Frisläppt monoamin analyseras av HPLC i kombination med elektrokemisk detektion. Dessutom ger denna teknik en screeningmetod för läkemedelsupptäckt.

En plattbaserad analys för mätning av endogen monoaminfrisättning i akuta hjärnskivor

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Denna teknik är en anpassning av vanliga metoder för att undersöka monoamin release, vilket möjliggör mätning av endogen frisättning snarare än förinstallerade radiomärkta monoaminer under flera farmakologiska förhållanden samtidigt. De främsta fördelarna med denna teknik är att det är ganska kostnadseffektivt, flera farmakologiska tillstånd kan undersökas samtidigt, och vi kan studera endogen monoaminfrisättning med förmågan att skilja mellan vesikulär och transportörmedierad frisättning. För att förbereda hjärnskivor från vuxna 250 till 350 gram hanråttor efter skörden, placerade omedelbart hjärnan och iskall syresatt dissekeringsbuffert och förvärva 300 mikron koronala hjärnsektioner från varje region av intresse.För ytterligare dissekering av hjärnskivorna, flytta försiktigt vävnaderna till glasglas och använd en råtta hjärnatlas för att identifiera dorsala striatum baserat på dess mörka strimmig struktur och för att identifiera hippocampus baserat på dess närhet till cortex och dess unika spiralstruktur. Separera höger och vänster halvklot för deras användning som kontroll och experimentella skivor. Dorsal striatum kan dissekeras ytterligare i två millimeter slag.Använd sedan en plastöverföringspipetter med en modifierad spets för att överföra proverna till små behållare nedsänkta i syresatt iskall dissekeringsbuffert med syre bubblande. För att inducera monoaminfrisättning, överför vävnadsproverna till varje brunn i en specialtillverkad 48 brunnsutflödeskammare som innehåller 0,5 till en milliliter utflödesbuffert per brunn med konstant skonsam bubblande och låt proverna återhämta sig i 30 till 50 minuter vid 37 grader Celsius. I slutet av jämviktsperioden, flytta vävnadshållaren med hjärnvävnad till brunnar som innehåller 500 mikroliter syresatt utflödesbuffert med eller utan farmakologiskt medel, knacka på innehavaren på kanten av brunnen för att förhindra minimal överföring av buffert mellan brunnar under en 20 minuters inkubation vid 37 grader Celsius.I slutet av inkubationen, flytta hållaren till en ny uppsättning brunnar som innehåller 500 mikroliter utflödesbuffert med eller utan det läkemedel som är av intresse och returnera plattan till cellodlingsinkubatorn i ytterligare 20 minuter. Under den andra inkubationen överför du lösningen från brunnarna från den första inkubationen till mikrocentrifugerör som innehåller 50 mikroliter av en normal perklorsyra eller fosforsyra på is och märker rören nummer ett"I slutet av den andra inkubationen flyttar du vävnadshållaren till tomma brunnar med plattan på is och överför supernatanterna från den andra inkubationen till nya mikrocentrifugerör som innehåller 50 mikroliter av en normal perklor eller fosfor syra på is. Märk dessa rör nummer två "När alla supernatanter har överförts, tillsätt en milliliter iskall dissekeringsbuffert till varje brunn av vävnad och använd små pincett för att överföra varje vävnadsprov till ett nytt mikrocentrifugerör.Ta bort bufferten från provrören och förvara vävnaderna vid minus 80 grader Celsius, överför sedan de insamlade inkubationslösningarna till mikrocentrifugefilterrör för centrifugering och placera filtratet på is tills HPLC-analysen. Ställ in ECD:s och flödeshastighetens potential på tillverkarens rekommendation för att upptäcka monoaminer. Belastning och lämplig alikvot för varje prov, inklusive neurotransmitterstandarder i HPLC för automatisk insprutning och detektering och gör det möjligt för instrumentet att slutföra analysen.Använd sedan HPLC-analysprogramvaran för att hämta och analysera kromatografdata med hjälp av en standardkurva som består av varje monoamin för att erhålla området under kurvan baserat på tillverkarens riktlinjer. Efter sex timmars funktionell analys förblir vävnadsprover livskraftiga, medan prover inkuberade med 1% Triton X-100 visar en signifikant minskning av MTT-omvandlingen. Akut 20 minuters behandling av hippocampal och prefrontal cortex hjärnsektioner med amfetamin inducerar en betydande ökning av den extracellulära nivån av varje monoamin.När proverna är förbehandlade med fluoxetin, en selektiv serotoninåterupptagshämmare, den amfetamininducerade ökningen av extracellulär serotonin inom hippocampus och den prefrontala cortex uppstår inte, medan ökningen av extracellulär dopamin och noradrenalinproduktion inte påverkas. Dessutom inducerar akut 20 minuters behandling av dorsala striatumslag med amfetamin en 35 gånger ökning av extracellulär dopamin nivå uttryck, medan dorsala striatum stansbehandling med kokain, en monoamin transportör blockerare, resulterar i en betydande hämning av amfetamin inducerad extracellulär dopamin. Öka koncentrationen av extracellulär kaliumklorid för att framkalla membran depolarization är tillräckligt för att inducera exocytotic frisättning av monoaminer jämfört med obehandlade kontroll villkor, och varken fluoxetin eller kokain behandling blockerar denna djupa polarisering inducerad ökning.Det är absolut nödvändigt att ha rena snittsektioner, en exakt lokalisering av stansar och att upprätthålla konsekvent syresättning under hela experimentet. Hjärnsektionerna kan användas efter experiment för ytterligare biokemisk bearbetning och analys, såsom västerländsk blotting och histologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Beredning av akut subventrikulära zonen Skivor för kalcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro och morfologisk karakterisering av neurala Microcircuits i akut hjärnan skivor Använda Kopplade Patch-Clamp Inspelningar

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Beredning av akut hjärnskada skivor använder en optimerad N-metyl-D-glucamine skyddande återställningsmetod

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Djupgående fysiologisk analys av Bestämda cellpopulationer i akut vävnadssnitt av Mouse Vomeronasalorganet

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Tillämpning av automatiserad bildstyrd patchklem för studie av neuroner i hjärnskivor

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Bedömning av långvarig depression induktion hos vuxna cerebellär skivor

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...