Name: sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins. at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende alle laboratoriemedlemmer i Afdelingen for Regenerativ Medicin ved Jichi Medical University for den nyttige diskussion og teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 og JP20bm0804018), Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), og den japanske Circulation Society (Grant for Basic Research) til H.U.

1. Differentiering af pluripotente stamceller fra mus
<ol><li>Vedligeholdelse af ES-museceller<ol>
<li>Vedligeholdelsesmedium: Bland 50 mL føtalt kvægserum (FBS), 5 mL L-alanin-L-glutamin, 5 mL ikke-essentiel aminosyre (NEAA), 5 mL 100 mM natriumpyrililat og 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol med 450 mL Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Suppl leukæmihæmmende faktor (LIF), CHIR-99021 og PD0325901 ved en endelig koncentration på henholdsvis 1000 U/mL, 1 μM og 3 μM. Steriliser mediet gennem et 0,22 μm filter.<...

<ol>
	<li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors.">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li><li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy:+an+overview.">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li><li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Progress,+Promises+and+Challenges.">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense-mediated+exon+skipping:+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy.">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation.">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li><li>Cho, G. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy.">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes.">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li><li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li><li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs.">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li><li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511/521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation.">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+(ES)+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma.">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).</li><li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).</li><li>Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV:+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution.">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li><li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40.">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).</li><li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB.">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).</li><li>Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Efficient+Knock-in+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+CRISPR-Cas9.">Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9.</a> Methods of Molecular Biology. , (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes.">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization,+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour.">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).</li><li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations.">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li></ol>

PSC-CMs har et stort potentiale til at blive brugt som en in vitro platform til model hjertesygdom og til at teste virkningerne af narkotika. Ikke desto mindre skal der først etableres en nøjagtig og ensartet metode til vurdering af PSC-CMs-funktioner. De fleste af funktionelle tests arbejder med PSC-CMs, f.eks elektrofysiologi, calcium forbigående, og stofskifte26, og en af de første patient-afledte PSC-CM undersøgelser handlede om lang-QT syndrom27. Men kont...

Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til dødelighed på verdensplan1 og kardiomyopati udgør den tredje årsag til hjerte-relaterede dødsfald2. Kardiomyopati er en kollektiv gruppe af sygdomme, der påvirker hjertemusklerne. Den seneste udvikling af inducerede pluripotente stamceller (iPS) og den rettet differentiering af iPS-celler mod kardiomyocytter (PSC-CMs) har åbnet døren for at studere kardiomyocytter med patientgenom som en in vitro-model af kardiomyopati. Disse celler kan bruges til at forstå patofysiologien af hjertesygdomme, til at belyse deres molekylære mekanismer og til at teste forskellige terapeutiske kandidater3. Der er en enorm interesse, således patient-afledte iPS celler er blevet genereret (f.eks hypertrofisk kardiomyopati [HCM]4,5, arytmogenic højre ventrikulær kardiomyopati [ARVC]6, udvidede kardiomyopati [DCM]7, og mitokondrie-relaterede kardiomyopatier8,9). Fordi et af kendetegnene ved kardiomyopati er dysfunktion og forstyrrelse af sarkomenter, er der brug for et gyldigt værktøj, der ensartet måler sarkomfunktion.
Sarkomere afkortning er den mest anvendte teknik til at vurdere sarkomfunktion og kontraktiliteten af voksne kardiomyocytter afledt af dyremodeller og mennesker. For at udføre sarkomforkortende, er veludviklede sarkomere, der er synlige under fasekontrast, påkrævet. PSC-CMs dyrkede imidlertid in vitro-display underudviklede og uorganiserede sarkomenter og kan derfor ikke bruges til korrekt at måle sarkomforkortelser10. Denne vanskelighed ved at foretage en korrekt vurdering af PSC-CMs ' kontraktilitet hindrer deres brug som platform til vurdering af hjertefunktioner in vitro. For indirekte at vurdere PSC-CMs-kontraktilitet er der anvendt mikroskopi af atomkraft, mikro-post-arrays, mikroskopi og impedansmålinger til måling af virkningerne af den bevægelse, som disse celler udøver på deres omgivelser11,12,13. Mere sofistikerede og mindre invasive videomikroskopioptagelser af faktisk cellulær bevægelse (f.eks. SI8000 fra SONY) kan bruges til alternativt at vurdere deres kontraktilitet, men denne metode måler ikke direkte sarkomere bevægelse eller kraftgenerering kinetik14.
For direkte at måle sarkom bevægelse i PSC-CMs, nye tilgange, såsom fluorescerende-tagging til sarkomere protein, er ved at opstå. For eksempel bruges Lifeact til at mærke filamentous actin (F-actin) til at måle sarkom bevægelse15,16. Genetisk modificerede iPS-celler er en anden mulighed for tagging af sarkomproteiner (f.eks. α-actinin [ACTN2] og Myomesin-2 [MYOM2]) med fluorescerende protein17,18,19.
I dette papir beskriver vi, hvordan man udfører time-lapse imaging til måling af sarkomforkortelser ved hjælp af Myom2-TagRFP (musefosterstamceller [ES] og ACTN2-mCherry (humane iPS-celler). Vi viser også, at en mønstret kultur letter sarkomere tilpasning. Derudover beskriver vi en alternativ metode til sarkommærkning ved hjælp af adeno-associerede vira (AAV'er), som i vid udstrækning kan anvendes på patientafledte iPS-celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,</td>
			<td>NOF Corp.</td>
			<td>LIPIDURE-CM5206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm imaging dish with a polymer coverslip (&#181;-Dish 35 mm, high)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVproR Helper Free System (AAV6) 
			(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3&#39; UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X), minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (25 U/&#181;L)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>029-18701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab142216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD drawing software,</td>
			<td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td>
			<td>Rhinoceros 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium etchant</td>
			<td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium mask coated with AZP1350</td>
			<td>Clean Surface Technology Co., Japan</td>
			<td>CBL2506Bu-AZP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Moregate</td>
			<td>59301104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>060-04543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS BOTTOM culture plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G-1.5-13-F/H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi</td>
			<td>892012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>Union Optical Co., Ltd., Japan</td>
			<td>PEM-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maskless lithography tool</td>
			<td>NanoSystem Solutions, Inc., Japan</td>
			<td>D-Light DL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF (0.45-&#181;m filter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myom2-RFP (SMM18)</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sansei medical co. Ltd</td>
			<td>01-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer</td>
			<td>Dow Corning Corp., MI, USA</td>
			<td>SILPOT 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine MAX (MW. 40,000)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive photoresist developer</td>
			<td>Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>NMD-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-23153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Mikasa Co., Ltd., Japan</td>
			<td>MS-A100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spininng confocal microscopy</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>195-16053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>314-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>226-01781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.

Pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (PSC-CMs) kan fremstilles af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller (ES/iPS). Disse celler giver lovende kilder til hjertesygdom modellering. For kardiomyopatier er sarkomere afkortning en af de standard fysiologiske vurderinger, der bruges sammen med voksne kardiomyocytter til at undersøge deres sygdomsphoenotyper. De tilgængelige metoder er imidlertid ikke egnede til at vurdere PSC-CMs' kontraktilitet, da disse celler har underudviklede sarkomenter, der er usynlige under fasekontrastmikroskopi. For at løse dette problem og udføre sarkomforkortelse med PSC-CMs blev der anvendt fluorescerende tagged sarkomproteiner og fluorescerende live-imaging. Tynde Z-linjer og en M-line opholde sig i begge ender og i midten af en sarkom, henholdsvis. Z-line proteiner — α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) og actin-associeret LIM-protein (PDLIM3) — og et M-line protein — Myomesin-2 (Myom2) — blev mærket med fluorescerende proteiner. Disse mærkede proteiner kan udtrykkes fra endogene alleler som knock-ins eller fra adeno-associerede vira (AAV'er). Her introducerer vi metoderne til at differentiere mus og menneskelige pluripotente stamceller til kardiomyocytter, til at producere AAV'er og til at udføre og analysere live-imaging. Vi beskriver også metoderne til fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) frimærker til en mønstret kultur af PSC-CMs, som letter analysen af sarkomere afkortning med fluorescerende-mærkede proteiner. For at vurdere sarkomforkortelse blev time-lapse-billeder af de bankende celler optaget med en høj framerate (50-100 billeder i sekundet) under elektrisk stimulering (0,5-1 Hz). For at analysere sarkomlængden i løbet af cellesammentrækning blev de optagede time-lapse-billeder udsat for SarcOptiM, en plug-in til ImageJ / Fiji. Vores strategi giver en enkel platform til undersøgelse af hjertesygdomme fænotyper i PSC-CMs.

Måling af sarkomforkortelse ved hjælp af knock-in PSC-CMs reporter linjer. Sarcomere-mærket PSC-CMs blev brugt til at måle sarkomere afkortning. Linjerne udtrykker Myom2-RFP og ACTN2-mCherry fra endogene loci. TagRFP blev indsat i Myom2, kodning M-proteiner, der lokaliserer til M-line, mens mCherry blev slået-in til ACTN2, kodning α-Actinin, som lokaliserer til Z-linje18,25. Time-lapse bil...

Watch this Scientific Journal Video about Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins. at JoVE.com

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Denne metode kan bruges til at undersøge sarkomforkortelser ved hjælp af pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter med fluorescerende-mærkede sarkomproteiner.

Sarcomere Afkortning af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter ved hjælp af fluorescerende-tagged Sarcomere proteiner.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Det er vanskeligt at vurdere sarkomfunktionen i de pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter på grund af deres underudviklede og uorganiserede sarkom. Ved hjælp af fluorescerende-mærkede sarkom proteiner, kan vi nu få adgang til sarkom afkortning. Vi kan visualisere sarkomenter og vurdere deres funktion in vitro ved hjælp af stamcelle-afledte kardiomyocytter og fluorescerende-tagged sarkom proteiner.Ved hjælp af AAV-baseret transduktion kan vi udvide metoden til alle patient-afledte inducerede pluripotente stamceller. Denne metode kan udvides til udvikling af kardiomyopatibehandling, da den kan bruges til direkte at vurdere sygdomsrelateret sarkom dysfunktion in vitro. Denne metode er nyttig inden for kardiologiområdet, herunder pædiatrisk kardiologiundersøgelse.Det kan dog også anvendes til studiet af skeletmuskulatur dysfunktion, såsom myopati. På dag minus fire af differentiering induktion, pels en seks-godt plade med 0,5 mikrogram per kvadratcentimeter laminin-511 E8 fortyndet i PBS for en 30-minutters inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Nærmer sig slutningen af inkubationen, behandle de menneskeskabte pluripotente stamceller med rekombinant trypsin i tre minutter ved 37 grader Celsius.Når cellerne er løsrevet, høst celler til medium suppleret med 10% FBS til optælling, og genbruge cellerne på en 1,25 gange 10 til den femte celler pr to milliliter AK02N medium suppleret med laminin-511 E8 og ROCK hæmmer efter centrifugering. Derefter indsug belægningsopløsningen fra hver brønd af den seks-brønds plade, og frø to milliliter celler ind i hver brønd. Sæt pladen tilbage i cellekulturinkubatoren.Efter fire dage når cellerne op på 80%sammenløb. Supernatanten udskiftes i hver brønd med to milliliter RPMI plus B27 uden insulinmedium suppleret med GSK-3-hæmmer pr. brønd for at fremkalde differentieringen. Efter to dages differentiering skal mediet forsigtigt udskiftes med to milliliter RPMI plus B27 uden insulinmedium suppleret med pindsvinhæmmer pr. brønd.Cellerne skulle have nået 100% sammenløb. På dag fire af differentiering, forsigtigt erstatte supernatants med to milliliter RPMI plus B27 uden insulin per brønd. Cellerne skal forblive i en høj densitet, og nogle kan være begyndt at flyde.På dag syv og ni af differentiering, erstatte supernatant i hver brønd med to milliliter RPMI plus B27 med insulin suppleret med puromycin for selektiv pluripotente stamcelle-afledt kardiomyocyt kultur. På dette tidspunkt skal slå celler observeres inden for kulturerne. For at oprette en mønstret pluripotent stamcelle-afledt cardiomyocyte kultur, første brug reparere tape til at fjerne støv fra overfladen af en skræddersyet PDMS stempel, og kort nedsænke stempel i 70% ethanol.Brug en luftduster til at fjerne ethanolen fra frimærkeoverfladen, og behandl overfladen med fem til 10 mikroliter på 0,5% MPC polymer og ethanol. Når polymeren er helt tørret, skal du placere stemplet på en polymer coverlip i en 35-millimeter billedskål, og læg en vægt på stemplet. Efter 10 minutter skal du bruge et let mikroskop til at bekræfte, at mønsteret er blevet overført til coverlipet, og vask skålen og coverlip to gange med PBS.Efter den anden vask, pels coverlip med 0,5 til et mikrogram per kvadratcentimeter laminin-511 E8 fortyndet i 0,1%gelatine for en to-til fire-timers inkubation ved stuetemperatur. På dag 10 af differentiering, vask cellerne to gange med PBS, efterfulgt af behandling med en milliliter rekombinant trypsin per brønd i tre til fem minutter ved 37 grader Celsius. Efter optælling, genbruges cellerne på en 2,5 til fem gange 10 til den femte celler per milliliter RPMI plus B27 med insulin suppleret med puromycin koncentration, og frø en milliliter af celler på pladen for en overnatning inkubation ved 37 grader Celsius.Den næste morgen, erstatte supernatant med friske RPMI plus B27 med insulin suppleret med puromycin, og returnere cellerne til cellen kultur inkubator, forfriskende medium to til tre gange om ugen indtil dag 21 til 28 for billeddannelse. For time-lapse billeddannelse af sarkom afkortning i PCCSM kulturer, anvende olie til 100 gange objektiv linse af en fluorescerende konfokal mikroskop, og vælg levende billedbehandling betingelser i den tilhørende software. For at få gode repræsentative data skal du vælge den højeste billedhastighed, indstille lukkeren til at åbne og anvende en fire gange fire-placering i en afgrøde af anskaffelsesområdet for at opnå de korteste intervaller mellem billeder under time-lapse-billeddannelsen.Hvis cellernes slaghastighed er lav, fremkalder cellerne ved elektrisk feltstimulation og starter time-lapse-optagelsen, idet du sørger for, at det afbildede felt forbliver i fokus under afbildningen. I slutningen af billedperioden skal du gemme time-lapse-billederne i en passende mappe. Hvis du vil analysere time-lapse-billederne, skal du åbne en række time-lapse-billeder i ImageJ og justere billedernes lysstyrke og kontrast, indtil sarkommønsteret tydeligt kan observeres.Vælg SarcOptiM i menuen Flere værktøjer, og tryk på Ctrl Skift P og den ene mikronknap på værktøjslinjen for at bruge instruktionerne til at kalibrere programmet. Tegn derefter en linje på tværs af sarkomensområdet, der skal bruges til at måle sarkomforkorteligheden, og klik på Enkeltcelle AVI for at starte sarkomforkorte analysen. Time-lapse billeddannelse af sarkom-mærket, mønstret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter kan bruges til at måle sarkomforkortelse på forskellige tidspunkter.For at overvinde den sarkomiske uorganisering, der typisk observeres i mønstrede pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytkulturer, kan specifikke PDMS-frimærker bruges til at dyrke mønstrede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter i et stribemønster, som fremmer en langstrakt celleform og et mere organiseret sarkommønster sammenlignet med celler dyrket i et ikke-mønsterområde. Mønstrede kulturer også fremme en bedre celle sammentrækning og give en glat sarkom længde profil i forhold til ikke-mønster dyrkede celler. AAV-transducerede mønster pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter udtrykke sarkomeriske GFP signaler langs mønstrede pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter så tidligt som tre dage efter transduktion og kan også bruges til at måle sarkomere sammentrækning profiler.Desuden kan tilsætningen af blasticidinresistent gen under transduktion også bruges til at lette mønstret pluripotente stamcelleafledt kardiomyocytvalg til en renhed på over 90% For at lette en lettere og højere kvalitets billedanalyse er det vigtigt at identificere et område med sarkomere, der bevæger sig lineært og for at opnå billeder med den højeste billedhastighed. Ved hjælp af denne metode kan vi vurdere modningens rolle i sarkomproteiner for at studere sarkom dysfunktion i lab cardiomyocyte afledt af sygdomsspecifikke, patient-afledte iPS-celler.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering og funktionel karakterisering af human Ventrikulær kardiomyocytter fra Fresh Kirurgiske Prøver

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generation af induceret pluripotente stamceller fra Muskelsvindfonden Patienter: Effektiv Integration-fri Omprogrammering af urin afledte celler

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Hurtig og effektiv Generation af rekombinant human pluripotente stamceller ved rekombinase-medieret Cassette Exchange i<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af voksen rotte Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Målrettet og selektiv behandling af pluripotente stamceller-afledt Teratomer ved hjælp af ekstern strålebehandling i et lille dyr Model

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analysere ilt forbrugssats i primære kulturperler mus Neonatal Cardiomyocytes ved hjælp af en ekstracellulære Flux Analyzer

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Model af iskæmisk hjertesygdom og video-baseret sammenligning af Cardiomyocyte sammentrækning ved hjælp af hiPSC-afledte kardiomyocytter

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet induktion af retinale organoider fra humane pluripotente stamceller

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...