Name: sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins. at JoVE.com

Wir möchten allen Labormitgliedern in der Abteilung für Regenerative Medizin an der Jichi Medical University für die hilfreiche Diskussion und technische Unterstützung danken. Diese Studie wurde durch die Zuschüsse der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 und JP20bm0804018), die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219) und der Japanese Circulation Society (der Zuschuss für Grundlagenforschung) an H.U.

1. Differenzierung pluripotenter Stammzellen der Maus
<ol><li>Pflege von MAUS-ES-Zellen<ol>
<li>Erhaltungsmedium: Mischen Sie 50 ml fetales Rinderserum (FBS), 5 ml L-Alanin-L-Glutamin, 5 ml nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 5 ml 100 mM Natriumpyruvat und 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol mit 450 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Ergänzung Leukämie-Inhibitor-Faktor (LIF), CHIR-99021 und PD0325901 bei einer Endkonzentration von 1000 U / ml, 1 μM bzw. 3 μM. Sterilisieren Sie das Medium durch einen 0,22 μm...

<ol>
	<li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors.">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li><li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy:+an+overview.">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li><li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Progress,+Promises+and+Challenges.">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense-mediated+exon+skipping:+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy.">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation.">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li><li>Cho, G. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy.">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes.">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li><li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li><li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs.">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li><li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511/521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation.">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+(ES)+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma.">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).</li><li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).</li><li>Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV:+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution.">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li><li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40.">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).</li><li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB.">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).</li><li>Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Efficient+Knock-in+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+CRISPR-Cas9.">Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9.</a> Methods of Molecular Biology. , (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes.">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization,+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour.">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).</li><li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations.">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li></ol>

PSC-CMs haben ein großes Potenzial, als In-vitro-Plattform zur Modellierung von Herzerkrankungen und zur Prüfung der Wirkung von Medikamenten genutzt zu werden. Dennoch muss zunächst eine genaue, einheitliche Methode zur Bewertung der Funktionen von PSC-CMs etabliert werden. Die meisten Funktionstests arbeiten mit PSC-CMs, z. B. Elektrophysiologie, Calciumtransient und Stoffwechsel26,und eine der ersten patientenbasierten PSC-CM-Studien war über das Long-QT-Syndrom27...

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache1 und Kardiomyopathie stellt die dritte Ursache für kardiale Todesfälledar 2. Kardiomyopathie ist eine kollektive Gruppe von Krankheiten, die die Herzmuskulatur betreffen. Die jüngsten Entwicklungen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) und die gerichtete Differenzierung von iPS-Zellen in Richtung Kardiomyozyten (PSC-CMs) haben die Tür für die Untersuchung von Kardiomyozyten mit Patientengenom als In-vitro-Modell der Kardiomyopathie geöffnet. Diese Zellen können verwendet werden, um die Pathophysiologie von Herzerkrankungen zu verstehen, ihre molekularen Mechanismen aufzuklären und verschiedene therapeutische Kandidaten zu testen3. Es gibt ein enormes Interesse, so dass patientenabgeleitete iPS-Zellen erzeugt wurden (z. B. hypertrophe Kardiomyopathie [HCM]4,5, arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie [ARVC]6, dilatative Kardiomyopathie [DCM]7und mitochondriale Kardiomyopathien8,9). Da eines der Merkmale der Kardiomyopathie die Dysfunktion und Störung von Sarkomeren ist, wird ein gültiges Werkzeug benötigt, das die Sarkomerfunktion einheitlich misst.
Die Sarkomer-Verkürzung ist die am weitesten verbreitete Technik zur Beurteilung der Sarkomerfunktion und der Kontraktilität von erwachsenen Kardiomyozyten aus Tiermodellen und Menschen. Um eine Sarkomerverkürzung durchzuführen, sind gut entwickelte Sarkomere erforderlich, die unter Phasenkontrast sichtbar sind. PSC-CMs, die in vitro kultiviert wurden, zeigen jedoch unterentwickelte und unorganisierte Sarkomere und können daher nicht verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung richtig zu messen10. Diese Schwierigkeit, die Kontraktilität von PSC-CMs richtig einzuschätzen, behindert ihre Nutzung als Plattform zur Beurteilung der Herzfunktionen in vitro. Um die Kontraktilität von PSC-CMs indirekt zu beurteilen, wurden Rasterkraftmikroskopie, Mikropfostenarrays, Zugkraftmikroskopie und Impedanzmessungen verwendet, um die Auswirkungen der von diesen Zellen ausgeübten Bewegung auf ihre Umgebung zu messen11,12,13. Ausgefeiltere und weniger invasive Videomikroskopie-Aufnahmen tatsächlicher zellulärer Bewegungen (z. B. SI8000 von SONY) können alternativ zur Beurteilung ihrer Kontraktilität verwendet werden, diese Methode misst jedoch nicht direkt die Sarkomerbewegung oder die Krafterzeugungskinetik14.
Um die Sarkomerbewegung in PSC-CMs direkt zu messen, entstehen neue Ansätze, wie das Fluoreszenz-Tagging zu Sarkomerprotein. Zum Beispiel wird Lifeact verwendet, um filamentöses Aktin (F-Aktin) zu kennzeichnen, um die Sarkomerbewegung15,16zu messen. Gentechnisch veränderte iPS-Zellen sind eine weitere Möglichkeit, Sarkomerproteine (z.B. α-Actinin [ACTN2] und Myomesin-2 [MYOM2]) durch fluoreszierendes Protein17,18,19zu markieren.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie zeitrafferbildende Bildgebung zur Messung der Sarkomerverkürzung mit Myom2-TagRFP (mausembryonale Stammzellen [ES]) und ACTN2-mCherry (menschliche iPS-Zellen) durchgeführt werden kann. Wir zeigen auch, dass eine gemusterte Kultur die Ausrichtung von Sarkomern erleichtert. Darüber hinaus beschreiben wir eine alternative Methode der Sarkomer-Markierung unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs), die weit verbreitet auf patientenbasierte iPS-Zellen angewendet werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,</td>
			<td>NOF Corp.</td>
			<td>LIPIDURE-CM5206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm imaging dish with a polymer coverslip (&#181;-Dish 35 mm, high)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVproR Helper Free System (AAV6) 
			(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3&#39; UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X), minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (25 U/&#181;L)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>029-18701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab142216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD drawing software,</td>
			<td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td>
			<td>Rhinoceros 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium etchant</td>
			<td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium mask coated with AZP1350</td>
			<td>Clean Surface Technology Co., Japan</td>
			<td>CBL2506Bu-AZP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Moregate</td>
			<td>59301104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>060-04543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS BOTTOM culture plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G-1.5-13-F/H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi</td>
			<td>892012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>Union Optical Co., Ltd., Japan</td>
			<td>PEM-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maskless lithography tool</td>
			<td>NanoSystem Solutions, Inc., Japan</td>
			<td>D-Light DL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF (0.45-&#181;m filter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myom2-RFP (SMM18)</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sansei medical co. Ltd</td>
			<td>01-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer</td>
			<td>Dow Corning Corp., MI, USA</td>
			<td>SILPOT 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine MAX (MW. 40,000)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive photoresist developer</td>
			<td>Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>NMD-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-23153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Mikasa Co., Ltd., Japan</td>
			<td>MS-A100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spininng confocal microscopy</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>195-16053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>314-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>226-01781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.

Pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (PSC-CMs) können sowohl aus embryonalen als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen (ES/iPS) hergestellt werden. Diese Zellen bieten vielversprechende Quellen für die Modellierung von Herzerkrankungen. Bei Kardiomyopathien ist die Sarkomer-Verkürzung eine der physiologischen Standardbewertungen, die bei erwachsenen Kardiomyozyten zur Untersuchung ihrer Krankheitsphänotypen verwendet werden. Die verfügbaren Methoden sind jedoch nicht geeignet, die Kontraktilität von PSC-CMs zu beurteilen, da diese Zellen unterentwickelte Sarkomere aufweisen, die unter Phasenkontrastmikroskopie unsichtbar sind. Um dieses Problem anzugehen und eine Sarkomerverkürzung mit PSC-CMs durchzuführen, wurden fluoreszierend markierte Sarkomerproteine und fluoreszierende Live-Bildgebung verwendet. Dünne Z-Linien und eine M-Linie befinden sich an beiden Enden bzw. in der Mitte eines Sarkomers. Z-Linienproteine - α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) und Aktin-assoziiertes LIM-Protein (PDLIM3) - und ein M-Linienprotein - Myomesin-2 (Myom2) - wurden mit fluoreszierenden Proteinen markiert. Diese markierten Proteine können aus endogenen Allelen als Knock-Ins oder aus Adeno-assoziierten Viren (AAVs) exprimiert werden. Hier stellen wir die Methoden vor, um maus- und humane pluripotente Stammzellen zu Kardiomyozyten zu differenzieren, AAVs herzustellen und Live-Imaging durchzuführen und zu analysieren. Wir beschreiben auch die Methoden zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempeln für eine gemusterte Kultur von PSC-CMs, die die Analyse der Sarkomerverkürzung mit fluoreszierend markierten Proteinen erleichtert. Zur Beurteilung der Sarkomerverkürzung wurden Zeitrafferbilder der schlagenden Zellen mit einer hohen Bildrate (50-100 Bilder pro Sekunde) unter elektrischer Stimulation (0,5-1 Hz) aufgenommen. Um die Sarkomerlänge im Verlauf der Zellkontraktion zu analysieren, wurden die aufgenommenen Zeitrafferbilder SarcOptiM, einem Plug-in für ImageJ/Fiji, unterzogen. Unsere Strategie bietet eine einfache Plattform für die Untersuchung von Phänotypen von Herzerkrankungen in PSC-CMs.

Messung der Sarkomerverkürzung mit Knock-in-PSC-CMs-Reporterlinien. Sarcomere-markierte PSC-CMs wurden verwendet, um die Sarkomerverkürzung zu messen. Die Linien exprimieren Myom2-RFP und ACTN2-mCherry aus endogenen Loci. TagRFP wurde in Myom2eingefügt und kodierte M-Proteine, die sich in der M-Linie lokalisieren, während mCherry in ACTN2eingelegt wurde, das α-Actinin kodiert, das auf die Z-Linie18,<sup class="xre...

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Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Diese Methode kann verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung mit pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit fluoreszierend markierten Sarkomerproteinen zu untersuchen.

Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Es ist schwierig, die Sarkomerfunktion in den pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten aufgrund ihres unterentwickelten und unorganisierten Sarkomes zu beurteilen. Mit fluoreszierenden Sarkomerproteinen können wir jetzt auf die Sarkomerverkürzung zugreifen. Wir können Sarkomere visualisieren und ihre Funktion in vitro mit Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten und fluoreszierenden Sarkomerproteinen beurteilen.Mit Hilfe der AAV-basierten Transduktion können wir die Methode auf alle vom Patienten abgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzellen ausweiten. Diese Methode kann auf die Entwicklung der Kardiomyopathie-Therapie ausgeweitet werden, da sie zur direkten Beurteilung der krankheitsbedingten Sarkomer-Dysfunktion in vitro verwendet werden kann. Diese Methode ist nützlich im Bereich der Kardiologie, einschließlich der pädiatrischen Kardiologiestudie.Es kann jedoch auch auf die Untersuchung von Skelettmuskelfunktionsstörungen wie Myopathie angewendet werden. Am vierten Tag der Differenzierungsinduktion beschichten Sie eine Sechs-Well-Platte mit 0,5 Mikrogramm pro Quadratzentimeter Laminin-511 E8, verdünnt in PBS für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Gegen Ende der Inkubation behandeln Sie die vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit rekombinantem Trypsin.Wenn sich die Zellen gelöst haben, ernten Sie Zellen zu Medium, ergänzt mit 10% FBS zum Zählen, und resuspendieren Sie die Zellen bei einem 1,25 mal 10 bis den fünften Zellen pro zwei Milliliter AK02N Medium, ergänzt mit Laminin-511 E8 und ROCK-Inhibitor nach der Zentrifugation. Als nächstes saugen Sie die Beschichtungslösung aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte an und säen Zwei Milliliter Zellen in jede Vertiefung. Bringen Sie die Platte in den Zellkulturinkubator zurück.Nach vier Tagen erreichen die Zellen eine Konfluenz von 80%. Ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter RPMI plus B27 ohne Insulinmedium, das mit GSK-3-Inhibitor pro Vertiefung ergänzt wird, um die Differenzierung zu induzieren. Ersetzen Sie das Medium nach zwei Tagen der Differenzierung vorsichtig durch zwei Milliliter RPMI plus B27 ohne Insulinmedium, das mit Stachelschweinhemmer pro Vertiefung ergänzt wird.Die Zellen sollten eine 100%ige Konfluenz erreicht haben. Ersetzen Sie am vierten Tag der Differenzierung die Überstände vorsichtig durch zwei Milliliter RPMI plus B27 ohne Insulin pro Vertiefung. Die Zellen sollten in einer hohen Dichte bleiben, und einige könnten begonnen haben zu schweben.Ersetzen Sie am siebten und neunten Tag der Differenzierung den Überstand in jedem Bohrplatz durch zwei Milliliter RPMI plus B27 durch Insulin, das mit Puromycin für eine selektive pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozytenkultur ergänzt wird. An diesem Punkt sollten schlagende Zellen in den Kulturen beobachtet werden. Um eine gemusterte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozytenkultur einzurichten, verwenden Sie zunächst Einwegband, um Staub von der Oberfläche eines maßgeschneiderten PDMS-Stempels zu entfernen, und tauchen Sie den Stempel kurz in 70% Ethanol.Verwenden Sie einen Luftstaubsauger, um das Ethanol von der Stempeloberfläche zu entfernen, und behandeln Sie die Oberfläche mit fünf bis 10 Mikrolitern 0,5% MPC-Polymer und Ethanol. Wenn das Polymer vollständig getrocknet ist, legen Sie den Stempel auf einen Polymerdeckel in einer 35-Millimeter-Bildschale und legen Sie ein Gewicht auf den Stempel. Verwenden Sie nach 10 Minuten ein Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass das Muster auf den Abdecklappen übertragen wurde, und waschen Sie die Schüssel und den Abdecklappen zweimal mit PBS.Nach der zweiten Wäsche den Deckmantel mit 0,5 bis einem Mikrogramm pro Quadratzentimeter Laminin-511 E8 verdünnt in 0,1% Gelatine für eine zwei- bis vierstündige Inkubation bei Raumtemperatur beschichten. Am Tag 10 der Differenzierung waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, gefolgt von einer Behandlung mit einem Milliliter rekombinantem Trypsin pro Vertiefung für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dem Zählen die Zellen mit 2,5 bis fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter RPMI plus B27 mit Insulin, das mit Puromycinkonzentration ergänzt wird, resuspendieren und einen Milliliter Zellen auf die Platte säen, um sie über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren.Ersetzen Sie am nächsten Morgen den Überstand durch frisches RPMI plus B27 durch Insulin, das mit Puromycin ergänzt wird, und bringen Sie die Zellen in den Zellkulturinkubator zurück, wobei das Medium zwei- bis dreimal pro Woche bis zum 21. bis 28. Tag für die Bildgebung aufgefrischt wird. Für die Zeitraffer-Bildgebung der Sarkomerverkürzung in den PCCSM-Kulturen tragen Sie Öl auf die 100-fach objektive Linse eines fluoreszierenden konfokalen Mikroskops auf und wählen Sie Live-Bildgebungsbedingungen in der zugehörigen Software aus. Um gute repräsentative Daten zu erhalten, wählen Sie die höchste Bildrate, stellen Sie den Verschluss auf Öffnen ein und wenden Sie ein Vier-mal-Vier-Binning in einem Zuschnitt des Erfassungsbereichs an, um die kürzesten Intervalle zwischen den Bildern während der Zeitrafferaufnahme zu erreichen.Wenn die Schlagrate der Zellen niedrig ist, rufen Sie die Zellen durch elektrische Feldstimulation hervor und starten Sie die Zeitrafferaufnahme, wobei Sie darauf achten, dass das abgebildete Feld während der Bildgebung im Fokus bleibt. Speichern Sie am Ende des Imaging-Zeitraums die Zeitrafferbilder in einem entsprechenden Ordner. Um die Zeitrafferbilder zu analysieren, öffnen Sie eine Reihe von Zeitrafferbildern in ImageJ und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der Bilder an, bis das Sarkomermuster deutlich beobachtet werden kann.Wählen Sie im Menü Weitere Extras die Option SarcOptiM aus, und drücken Sie die Umschalttaste P und die Ein-Mikrometer-Taste auf der Symbolleiste, um die Anweisungen zum Kalibrieren des Programms zu verwenden. Zeichnen Sie dann eine Linie über den Bereich des Sarkomers, der zur Messung der Sarkomer-Verkürzung verwendet werden soll, und klicken Sie auf Einzelzell-AVI, um die Sarkomer-Verkürzungsanalyse zu starten. Die Zeitraffer-Bildgebung von Sarkomer-markierten, gemusterten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten kann verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen.Um die Sarkomerdesorganisation zu überwinden, die typischerweise in gemusterten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozytenkulturen beobachtet wird, können spezifische PDMS-Stempel verwendet werden, um gemusterte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten in einem Streifenmuster zu kultivieren, das eine längliche Zellform und ein organisierteres Sarkomermuster im Vergleich zu Zellen fördert, die in einem Nicht-Musterbereich kultiviert wurden. Gemusterte Kulturen fördern auch eine bessere Zellkontraktion und bieten ein glattes Sarkomerlängenprofil im Vergleich zu nicht musterkulierten Zellen. AAV-transduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten exprimieren sarkomerische GFP-Signale entlang der gemusterten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten bereits drei Tage nach der Transduktion und können auch zur Messung von Sarkomerkontraktionsprofilen verwendet werden.Darüber hinaus kann die Zugabe eines Blasticidin-resistenten Gens während der Transduktion auch verwendet werden, um die Selektion von gemusterten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten auf eine Reinheit von über 90% zu erleichtern Um eine einfachere und qualitativ hochwertigere Bildanalyse zu ermöglichen, ist es wichtig, einen Bereich mit Sarkomeren zu identifizieren, die sich linear bewegen, und Bilder mit der höchsten Bildrate zu erhalten. Mit dieser Methode können wir die Rolle der Reifung in Sarkomproteinen beurteilen, um Sarkomerdysfunktion in Laborkardiomyozyten zu untersuchen, die aus krankheitsspezifischen, patientenbezogenen iPS-Zellen gewonnen werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Forschung

Medizin

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Eine schnelle und effiziente Erzeugung von rekombinanten humanen pluripotenten Stammzellen durch Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch in der<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Gezielte und selektive Behandlung von pluripotenten Stammzellen abgeleitet darum mit externen Strahl Strahlung in einem kleinen Tier-Modell

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Modell der ischämischen Herzkrankheit und videobasierter Vergleich der Kardiomyozytenkontraktion mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...