Name: sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins. at JoVE.com

हम जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी में रिजेनरेटिव मेडिसिन के डिवीजन में सभी लैब सदस्यों को सहायक चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । इस अध्ययन को जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (एएमईडी) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; JP18bm0704012 और JP20bm0804018), विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS; JP19KK0219), और जापानी परिसंचरण सोसायटी (बेसिक रिसर्च के लिए अनुदान) एचयू के लिए

1. माउस pluripotent स्टेम सेल का भेदभाव
<ol><li>माउस ईएस कोशिकाओं का रखरखाव<ol>
<li>रखरखाव माध्यम: भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 मिलीएल मिश्रण, एल-एलेनिन-एल-ग्लूटामाइन के 5 मिलीएल, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए) के 5 मिलीए?...

<ol>
	<li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors.">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li><li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy:+an+overview.">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li><li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Progress,+Promises+and+Challenges.">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense-mediated+exon+skipping:+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy.">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation.">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li><li>Cho, G. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy.">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes.">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li><li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li><li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs.">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li><li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511/521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation.">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+(ES)+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma.">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).</li><li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).</li><li>Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV:+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution.">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li><li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40.">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).</li><li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB.">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).</li><li>Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Efficient+Knock-in+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+CRISPR-Cas9.">Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9.</a> Methods of Molecular Biology. , (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes.">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization,+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour.">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).</li><li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations.">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li></ol>

पीएससी-सीएम में हृदय रोग को मॉडल करने और दवाओं के प्रभावों को परखने के लिए इन विट्रो प्लेटफॉर्म के रूप में उपयोग करने की अपार संभावनाएं हैं । फिर भी, पीएससी-सीएम कार्यों का आकलन करने के लिए एक सटीक, एक...

हृदय रोग दुनिया भर में मृत्यु का प्रमुख कारण हैं1 और कार्डियोमायोपैथी हृदय से संबंधित मौतों के तीसरे कारण का प्रतिनिधित्व करता है2। कार्डियोमायोपैथी रोगों का एक सामूहिक समूह है जो हृदय की मांसपेशियों को प्रभावित करता है। प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं और कार्डियोमायोसाइट्स (पीएससी-सीएम) की ओर आईपीएस कोशिकाओं के निर्देशित-भेदभाव के हाल के घटनाक्रम कार्डियोमायोपैथी के एक इन विट्रो मॉडल के रूप में रोगी जीनोम के साथ कार्डियोमायोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए दरवाजा खोला है । इन कोशिकाओं का उपयोग हृदय रोगों के रोगविज्ञान को समझने, उनके आणविक तंत्र को स्पष्ट करने और विभिन्न चिकित्सीयउम्मीदवारोंका परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। ब्याज की एक जबरदस्त राशि है, इस प्रकार, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाएं उत्पन्न की गई हैं (उदाहरण के लिए, हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी [एचसीएम]4,5,अतालताजनक सही वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोपैथी [एआरवीसी]6,डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी [डीसीएम]7,और माइटोकॉन्ड्रियल-कार्डियो से संबंधित क्योंकि कार्डियोमायोपैथी की विशेषताओं में से एक सारकोमर की शिथिलता और व्यवधान है, एक वैध उपकरण जो समान रूप से सारकोमेरे कार्य को मापता है।
सारकोमेरे छोटा सारकोमेरे फ़ंक्शन और पशु मॉडल और मनुष्यों से प्राप्त वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स की संकुचन का आकलन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। सरकोमरे को छोटा करने के लिए, चरण-विपरीत के तहत दिखाई देने वाले अच्छी तरह से विकसित सारकोमों की आवश्यकता होती है। हालांकि, पीएससी-सीएम ने विट्रो डिस्प्ले में सुसंस्कृत अविकसित और अव्यवस्थित सारकोमर और इसलिए,10को छोटा करने के लिए सारकोमर को ठीक से मापने के लिए उपयोग करने में असमर्थ हैं। पीएससी-सीएम की संकुचनता का ठीक से आकलन करने में यह कठिनाई विट्रो मेंहृदय कार्यों का आकलन करने के लिए एक मंच के रूप में उनके उपयोग में बाधा डालती है । पीएससी-सीएम की अनुबंध अप्रत्यक्ष रूप से आकलन करने के लिए, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी, माइक्रो-पोस्ट सरणी, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी, और बाधा माप का उपयोग इन कोशिकाओंद्वारा अपने परिवेश11, 12,13पर किए गए गति के प्रभाव को मापने के लिए किया गया है। वास्तविक सेलुलर मोशन (जैसे, सोनी से SI8000) की अधिक परिष्कृत और कम आक्रामक वीडियो-माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग का उपयोग वैकल्पिक रूप से उनकी संकुचन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि, यह विधि सीधे सारकोमेरे गति या बल पीढ़ी की गति14को मापने के लिए नहीं है।
पीएससी-सीएम में सारकोमेरे मोशन को सीधे तौर पर मापने के लिए, फ्लोरोसेंट-टैगिंग से लेकर सरकोमेरे प्रोटीन जैसे नए दृष्टिकोण उभर रहे हैं । उदाहरण के लिए, लाइफएक्ट का उपयोग सारकोमेरे मोशन15, 16को मापने के लिए फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) को लेबल करने के लिए कियाजाताहै। आनुवांशिक रूप से संशोधित आईपीएस कोशिकाएं फ्लोरोसेंट प्रोटीन17, 18, 19द्वारा सारकोमेरे प्रोटीन (जैसे, α-ऐक्टिनिन [ACTN2] और मायोमसिन-2 [MYOM2]) को टैग करने के लिए एक और विकल्प हैं ।
इस पेपर में, हम वर्णन करते हैं कि Myom2-TagRFP (माउस भ्रूणीय स्टेम [ईएस] कोशिकाओं) और ACTN2-mCherry (मानव आईपीएस कोशिकाओं) का उपयोग करके सारकोमरे को छोटा करने के लिए समय-चूक इमेजिंग कैसे करें। हम यह भी बताते हैं कि एक नमूनों वाली संस्कृति सारकोमेरे संरेखण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, हम एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) का उपयोग करके सारकोमेरे लेबलिंग की एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करते हैं, जिसे रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाओं पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,</td>
			<td>NOF Corp.</td>
			<td>LIPIDURE-CM5206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm imaging dish with a polymer coverslip (&#181;-Dish 35 mm, high)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVproR Helper Free System (AAV6) 
			(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3&#39; UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X), minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (25 U/&#181;L)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>029-18701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab142216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD drawing software,</td>
			<td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td>
			<td>Rhinoceros 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium etchant</td>
			<td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium mask coated with AZP1350</td>
			<td>Clean Surface Technology Co., Japan</td>
			<td>CBL2506Bu-AZP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Moregate</td>
			<td>59301104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>060-04543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS BOTTOM culture plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G-1.5-13-F/H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi</td>
			<td>892012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>Union Optical Co., Ltd., Japan</td>
			<td>PEM-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maskless lithography tool</td>
			<td>NanoSystem Solutions, Inc., Japan</td>
			<td>D-Light DL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF (0.45-&#181;m filter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myom2-RFP (SMM18)</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sansei medical co. Ltd</td>
			<td>01-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer</td>
			<td>Dow Corning Corp., MI, USA</td>
			<td>SILPOT 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine MAX (MW. 40,000)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive photoresist developer</td>
			<td>Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>NMD-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-23153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Mikasa Co., Ltd., Japan</td>
			<td>MS-A100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spininng confocal microscopy</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>195-16053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>314-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>226-01781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.

Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (पीएससी-सीएम) दोनों भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम (ES/iPS) कोशिकाओं से उत्पादित किया जा सकता है । ये कोशिकाएं हृदय रोग मॉडलिंग के लिए आशाजनक स्रोत प्रदान करती हैं। कार्डियोमायोपैथी के लिए, सारकोमेरे छोटा करना मानक शारीरिक आकलन में से एक है जिसका उपयोग वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स के साथ उनकी बीमारी फेनोटाइप की जांच करने के लिए किया जाता है। हालांकि, उपलब्ध तरीके पीएससी-सीएम की संकुचन का आकलन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि इन कोशिकाओं ने अविकसित साकोमर हैं जो चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत अदृश्य हैं । इस मुद्दे को हल करने और पीएससी-सीएम के साथ सारकोमेरे छोटा करने के लिए, फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन और फ्लोरोसेंट लाइव-इमेजिंग का उपयोग किया गया था। पतली जेड-लाइन और एक एम-लाइन क्रमशः दोनों सिरों और एक सारकोमेरे के केंद्र में रहते हैं। जेड-लाइन प्रोटीन-α-ऐक्टिनिन (ACTN2), Telethonin (TCAP), और ऐक्टिन से जुड़े लिम प्रोटीन (PDLIM3)-और एक एम लाइन प्रोटीन-Myomesin-2 (Myom2)-फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया गया । इन टैग किए गए प्रोटीन को एंडोजेनस एलील्स से नॉक-इन या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) से व्यक्त किया जा सकता है। यहां, हम कार्डियोमायोसाइट्स के लिए माउस और मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, AAVs का उत्पादन करने के लिए, और प्रदर्शन और लाइव इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए तरीकों का परिचय । हम पीएससी-सीएम की एक पैटर्न वाली संस्कृति के लिए पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) टिकटों के उत्पादन के तरीकों का भी वर्णन करते हैं, जो फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन के साथ सारकोमेरे छोटा करने के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। सारकोमेरे छोटा का आकलन करने के लिए, बीटिंग कोशिकाओं की समय-चूक छवियों को विद्युत उत्तेजना (0.5-1 हर्ट्ज) के तहत एक उच्च फ्रेमरेट (50-100 फ्रेम प्रति सेकंड) पर दर्ज किया गया था। सेल संकुचन के दौरान सारकोमेरे लंबाई का विश्लेषण करने के लिए, रिकॉर्ड किए गए समय-चूक छवियों को सारकोप्टिम के अधीन किया गया था, जो इमेजजे/फिजी के लिए प्लग-इन था। हमारी रणनीति पीएससी-सीएम में हृदय रोग फेनोटाइप की जांच के लिए एक सरल मंच प्रदान करती है।

पीएससी-सीएम रिपोर्टर लाइनों में दस्तक का उपयोग कर sarcomere छोटा मापने । सारकोमेरे-लेबल पीएससी-सीएम का उपयोग सारकोमेरे छोटा करने के लिए किया जाता था । लाइनें अंतर्जात लोकी से Myom2-RFP और ACTN2-mCherry ?...

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Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

इस विधि का उपयोग फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन के साथ प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके सारकोमेरे छोटा करने के लिए किया जा सकता है।

सारकोमेरे फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का उपयोग करके प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का छोटा होना।

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

उनके अविकसित और अव्यवस्थित सारकोमेरे के कारण प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में सारकोमेरे कार्य का आकलन करना मुश्किल है। फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का उपयोग करके, अब हम सारकोमेरे छोटा कर सकते हैं। हम सरकोमर की कल्पना कर सकते हैं और स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सारकोमेरे प्रोटीन का उपयोग करके विट्रो में उनके कार्य का आकलन कर सकते हैं।एएवी-आधारित ट्रांसडक्शन का उपयोग करके, हम किसी भी रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के लिए विधि का विस्तार कर सकते हैं । इस विधि को कार्डियोमायोपैथी थेरेपी के विकास में विस्तारित किया जा सकता है, क्योंकि इसका उपयोग सीधे रोग से संबंधित सारकोमेरे डिसफंक्शन इन विट्रो का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि कार्डियोलॉजी क्षेत्र में उपयोगी है, जिसमें बाल चिकित्सा कार्डियोलॉजी अध्ययन भी शामिल है।हालांकि, इसे कंकाल मांसपेशियों की शिथिलता, जैसे मायोपैथी के अध्ययन में भी लागू किया जा सकता है। विभेदन प्रेरण के शून्य से चार दिन, लेमिनिन के ०.५ माइक्रोग्राम प्रति वर्ग सेंटीमीटर के साथ एक छह अच्छी तरह की थाली कोट-५११ E8 PBS में ३७ मिनट के इनक्यूबेशन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर पतला । इनक्यूबेशन के अंत के करीब, ३७ डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए recombinant ट्रिपसिन के साथ मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का इलाज ।जब कोशिकाओं को अलग किया है, मध्यम करने के लिए फसल कोशिकाओं की गिनती के लिए 10% FBS के साथ पूरक है, और एक १.२५ बार 10 पर कोशिकाओं को फिर से खर्च AK02N मध्यम के दो मिलीलीटर प्रति पांचवीं कोशिकाओं को टुकड़े टुकड़े-५११ E8 और अपकेंद्री के बाद रॉक अवरोधक के साथ पूरक । इसके बाद, छह-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं से कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें, और प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं के दो मिलीलीटर बीज करें। प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में लौटाएं।चार दिनों के बाद, कोशिकाएं 80% तक पहुंचती हैं। प्रत्येक कुएं में सुपरनेट को इंसुलिन माध्यम के बिना आरपीएमआई प्लस बी 27 के दो मिलीलीटर के साथ बदलें, जो भेदभाव को प्रेरित करने के लिए जीएसके-3 अवरोधक के साथ पूरक है। भेदभाव के दो दिनों के बाद, धीरे से इंसुलिन माध्यम के बिना RPMI प्लस B27 के दो मिलीलीटर के साथ माध्यम की जगह अच्छी तरह से साही अवरोधक के साथ पूरक ।कोशिकाओं को १००% की नरमी तक पहुंच जाना चाहिए था । भेदभाव के दिन चार पर, धीरे से अच्छी तरह से प्रति इंसुलिन के बिना RPMI प्लस B27 के दो मिलीलीटर के साथ supernatants की जगह । कोशिकाओं को एक उच्च घनत्व पर रहना चाहिए, और कुछ तैरने के लिए शुरू हो सकता है ।भेदभाव के सात और नौ दिन पर, प्रत्येक अच्छी तरह से आरपीएमआई प्लस B27 के दो मिलीलीटर के साथ चयनात्मक pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट संस्कृति के लिए puromycin के साथ पूरक के साथ सुपरनैट की जगह । इस बिंदु पर, संस्कृतियों के भीतर कोशिकाओं को पीटना मनाया जाना चाहिए। एक नमूनों pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट संस्कृति स्थापित करने के लिए, पहले एक कस्टम निर्मित PDMS स्टांप की सतह से किसी भी धूल को दूर करने के लिए टेप mending का उपयोग करें, और संक्षेप में ७०% इथेनॉल में स्टांप जलमग्न ।स्टांप सतह से इथेनॉल को हटाने के लिए एक एयर डस्टर का उपयोग करें, और सतह को 0.5% एमपीसी बहुलक और इथेनॉल के पांच से 10 माइक्रोलीटर के साथ इलाज करें। जब बहुलक पूरी तरह से सूख गया है, एक ३५ मिलीमीटर इमेजिंग डिश में एक बहुलक कवरलिप पर स्टांप जगह है, और स्टांप पर एक वजन जगह है । 10 मिनट के बाद, इस बात की पुष्टि करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि पैटर्न को कवरस्लिप पर स्थानांतरित कर दिया गया है, और डिश को धोएं और पीबीएस के साथ दो बार कवरलिप करें।दूसरे धोने के बाद, कमरे के तापमान पर दो से चार घंटे की इनक्यूबेशन के लिए ०.१% जिलेटिन में पतला लेमिनिन-५११ E8 के ०.५ से एक माइक्रोग्राम प्रति वर्ग सेंटीमीटर के साथ कवरस्लिप कोट । भेदभाव के दिन 10 पर, पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन से पांच मिनट के लिए एक मिलीलीटर रिकॉम्बिनेंट ट्राइप्सिन के साथ उपचार करें। गिनती के बाद, एक २.५ से पांच बार 10 पर कोशिकाओं को फिर से खर्च RPMI प्लस B27 के मिलीलीटर प्रति पांचवीं कोशिकाओं को इंसुलिन के साथ puromycin एकाग्रता के साथ पूरक है, और एक रात के लिए थाली पर कोशिकाओं के एक मिलीलीटर बीज ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन ।अगली सुबह, प्यूरोमाइसिन के साथ पूरक इंसुलिन के साथ ताजा RPMI प्लस B27 के साथ सुपरनैंट की जगह लें, और कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर को कोशिकाओं को वापस करें, इमेजिंग के लिए 21 से 28 दिनों तक प्रति सप्ताह दो से तीन बार मध्यम ताज़ा करें। पीसीसीएसएम संस्कृतियों में सारकोमरे छोटा होने की समय-चूक इमेजिंग के लिए, फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के 100 गुना ऑब्जेक्टिव लेंस पर तेल लागू करें, और संबंधित सॉफ्टवेयर में लाइव इमेजिंग स्थितियों का चयन करें। अच्छे प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए, उच्चतम फ्रेम दर का चयन करें, शटर को खोलने के लिए सेट करें, और समय-चूक इमेजिंग के दौरान छवियों के बीच सबसे कम अंतराल प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण क्षेत्र की फसल में चार-बाय-चार बिनिंग लागू करें।यदि कोशिकाओं की धड़कन दर कम है, तो विद्युत क्षेत्र उत्तेजना द्वारा कोशिकाओं को पैदा करें, और समय-चूक रिकॉर्डिंग शुरू करें, इस बात का ध्यान रखें कि इमेजिंग क्षेत्र इमेजिंग के दौरान ध्यान में रहता है। इमेजिंग अवधि के अंत में, समय-चूक छवियों को एक उपयुक्त फ़ोल्डर में सहेजें। समय-चूक छवियों का विश्लेषण करने के लिए, इमेजजे में समय-चूक छवियों की एक श्रृंखला खोलें, और छवियों की चमक और विपरीत को समायोजित करें जब तक कि सारकोमेरे पैटर्न स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता है।अधिक उपकरण मेनू में, कार्यक्रम को जांचने के निर्देशों का उपयोग करने के लिए सरकॉप्टिम का चयन करें, और कंट्रोल शिफ्ट पी और टूलबार पर एक माइक्रोन बटन दबाएं। फिर सारकोमेरे छोटा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सारकोमेरे के क्षेत्र में एक लाइन खींचें, और सारकोमेरे छोटा विश्लेषण शुरू करने के लिए एकल सेल AVI पर क्लिक करें। सारकोमेरे-लेबल, पैटर्न वाले प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की समय-चूक इमेजिंग का उपयोग विभिन्न समय बिंदुओं पर सारकोमेरे छोटा करने के लिए किया जा सकता है।आमतौर पर पैटर्न वाले प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट संस्कृतियों में देखे जाने वाले सारकोमेरे विघटन को दूर करने के लिए, विशिष्ट पीडीएमएस टिकटों का उपयोग एक धारी पैटर्न में पैटर्न वाले प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स को संस्कृति के लिए किया जा सकता है, जो एक विस्तारित कोशिका आकार को बढ़ावा देता है और गैर-पैटर्न क्षेत्र में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में अधिक संगठित सारकोयर पैटर्न। पैटर्न वाली संस्कृतियां भी एक बेहतर सेल संकुचन को बढ़ावा देती हैं और गैर-पैटर्न सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में एक चिकनी सारकोमेरे लंबाई प्रोफ़ाइल प्रदान करती हैं। एएवी-ट्रांसड्यूड पैटर्न प्लेरिपेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स तीन दिनों के बाद ट्रांसडक्शन के रूप में पैटर्न वाले प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के साथ सारकोमरिक जीएफपी संकेतों को व्यक्त करते हैं और इसका उपयोग सारकोमरे संकुचन प्रोफाइल को मापने के लिए भी किया जा सकता है।इसके अलावा, ट्रांसडक्शन के दौरान ब्लास्टिसिडिन प्रतिरोधी जीन के अलावा पैटर्न वाले प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट चयन को 90% से अधिक की शुद्धता में सुविधाजनक बनाने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है ताकि एक आसान और उच्च गुणवत्ता वाले छवि विश्लेषण को सुविधाजनक बनाया जा सके, एक आसान और उच्च गुणवत्ता वाले छवि विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए, यह आवश्यक है कि एक ऐसे क्षेत्र की पहचान की जाए जो रैकरल रूप से आगे बढ़ता है और उच्चतम फ्रेम दर पर छवियों को प्राप्त करता है। इस विधि का उपयोग करके, हम रोग-विशिष्ट, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएस कोशिकाओं से प्राप्त प्रयोगशाला कार्डियोमायोसाइट में सारकोमेरे डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए सारकोमा प्रोटीन में परिपक्वता की भूमिका का आकलन कर सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

मानव दंत लुगदी स्टेम सेल के अलगाव विशेषता, और तुलनात्मक भेदभाव दो अलग अलग तरीकों का उपयोग करके स्थायी दांत से व्युत्पन्न

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Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

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Pluripotent स्टेम सेल के लक्षित और चयनात्मक उपचार एक छोटे जानवर मॉडल में बाहरी बीम विकिरण का उपयोग कर Teratomas व्युत्पंन

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

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प्राथमिक संस्कृतिक माउस में ऑक्सीजन की खपत दर का विश्लेषण एक Extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर नवजात Cardiomyocytes

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चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग कर कार्डियक फंक्शन का विट्रो मूल्यांकन

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

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Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

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