Name: sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins. at JoVE.com

Jichi医科大学再生医療部門のラボメンバーの皆さん、有益な議論と技術支援を受けたい。本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)の助成金により支援されました。日本学術振興会(JSPS;日本循環学会(基礎研究助成)をH.U.に

1. マウス多能性幹細胞の分化
<ol><li>マウスES細胞のメンテナンス<ol>
<li>メンテナンス培地:50mLのウシ胎児血清(FBS)、L-アラニン-L-グルタミン5mL、非必須アミノ酸5mL(NEAA)、100mMナトリウムピルビン酸ナトリウム、55mM 2-メルカプトエタノールの909 μlを450 mLの最小必須培地(GMEM)に混合します。補充白血病阻害因子(LIF)、CHIR-99021、PD0325901を最終濃度1000 U/mL、1μM、3μMでそれぞれ補充します。0.22 μmフィ?...

<ol>
	<li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors.">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li><li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy:+an+overview.">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li><li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Progress,+Promises+and+Challenges.">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense-mediated+exon+skipping:+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy.">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation.">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li><li>Cho, G. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy.">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes.">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li><li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li><li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs.">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li><li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511/521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation.">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+(ES)+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma.">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).</li><li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).</li><li>Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV:+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution.">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li><li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40.">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).</li><li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB.">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).</li><li>Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Efficient+Knock-in+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+CRISPR-Cas9.">Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9.</a> Methods of Molecular Biology. , (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes.">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization,+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour.">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).</li><li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations.">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li></ol>

PSC-CMは、心臓病をモデル化し、薬物の効果をテストするためのインビトロプラットフォームとして利用される大きな可能性を秘めています。ただし、PSC-CM 関数を評価する正確で統一された方法を最初に確立する必要があります。機能検査の大部分はPSC-CMで働き、例えば、電気生理学、カルシウム過渡性、および代謝26、および最初の患者由来のPSC-CM試験の1つは、長い...

心血管疾患は、世界的に死亡率の主な原因である1と心筋症は、心臓関連死の第三の原因を表す2.心筋症は、心臓の筋肉に影響を与える疾患の集合群です。近年のiPS細胞の誘導多能性幹細胞の開発と、iPS細胞の心筋細胞(PSC-CM)に向けた指向分化が開かれて、心筋症のインビトロモデルとして患者ゲノムを用いた心筋細胞を研究する扉が開かれています。これらの細胞は、心疾患の病態生理を理解し、その分子機構を解明し、異なる治療候補3を試験するために使用することができる。多大な関心があり、したがって、患者由来のiPS細胞が生成されている(例えば、肥大性心筋症[HCM]4、5、不整脈性右心室心筋症[ARVC]6、拡張型心筋症[DCM]7、およびミトコンドリア関連心筋症8、9)。心筋症の特徴の1つはサルコメアの機能不全と破壊であるため、サルコメア機能を均一に測定する有効なツールが必要です。
サルコメア短縮は、サルコメア機能および動物モデルおよびヒトに由来する成体心筋細胞の収縮性を評価するために最も広く使用されている技術である。サルコメア短縮を行うためには、位相コントラスト下で見えるよく発達したサルコメアが必要である。しかしながら、インビトロディスプレイ培養されたPSC-CMは、未発達で組織化されていないサルコメアを培養し、したがって、サルコメア短縮10を適切に測定するために使用することができない。PSC-CMの収縮性を適切に評価するこの難しさは、インビトロで心臓機能を評価するためのプラットフォームとしての使用を妨げる。PSC-CMの収縮性を間接的に評価するために、原子間力顕微鏡、マイクロポストアレイ、トラクションフォース顕微鏡、およびインピーダンス測定が、これらの細胞がそれらの周囲に及ぼす運動の影響を測定するために使用されてきた。実際の細胞運動のより洗練された、より侵襲性の低いビデオ顕微鏡記録(例えば、SONYからのSI8000)は、それらの収縮性を評価するために使用することができるが、しかし、この方法はサルコメア運動または力発生動態14を直接測定しない。
PSC-CMのサルコメア運動を直接測定するために、サルコメアタンパク質への蛍光タグ付けなどの新しいアプローチが出現しています。例えば、Lifeactは、サルコメア運動15,16を測定するために糸状アクチン(F-actin)にラベルを付けるために使用される。遺伝子組み換えiPS細胞は、サルコメアタンパク質(例えば、αアクチニン[ACTN2]およびミオメシン-2[MYOM2])を蛍光タンパク質17、18、19によってタグ付けするためのもう一つの選択肢である。
本論文では、Myom2-TagRFP(マウス胚性幹細胞[ES]細胞)およびACTN2-mCherry(ヒトiPS細胞)を用いてサルコメア短縮を測定するためのタイムラプスイメージングを行う方法について述べた。我々はまた、パターン化された文化がサルコメアのアライメントを促進することを示す。さらに、患者由来のiPS細胞に広く応用できるアデノ関連ウイルス(AAV)を用いたサルコメア標識の代替方法について述べています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,</td>
			<td>NOF Corp.</td>
			<td>LIPIDURE-CM5206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm imaging dish with a polymer coverslip (&#181;-Dish 35 mm, high)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVproR Helper Free System (AAV6) 
			(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3&#39; UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X), minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (25 U/&#181;L)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>029-18701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab142216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD drawing software,</td>
			<td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td>
			<td>Rhinoceros 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium etchant</td>
			<td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium mask coated with AZP1350</td>
			<td>Clean Surface Technology Co., Japan</td>
			<td>CBL2506Bu-AZP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Moregate</td>
			<td>59301104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>060-04543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS BOTTOM culture plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G-1.5-13-F/H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi</td>
			<td>892012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>Union Optical Co., Ltd., Japan</td>
			<td>PEM-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maskless lithography tool</td>
			<td>NanoSystem Solutions, Inc., Japan</td>
			<td>D-Light DL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF (0.45-&#181;m filter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myom2-RFP (SMM18)</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sansei medical co. Ltd</td>
			<td>01-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer</td>
			<td>Dow Corning Corp., MI, USA</td>
			<td>SILPOT 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine MAX (MW. 40,000)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive photoresist developer</td>
			<td>Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>NMD-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-23153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Mikasa Co., Ltd., Japan</td>
			<td>MS-A100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spininng confocal microscopy</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>195-16053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>314-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>226-01781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.

多能性幹細胞由来心筋細胞(PSC-CM)は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞(ES/iPS)細胞の両方から生成することができる。これらの細胞は、心疾患のモデリングのための有望な情報源を提供する。心筋症のサルコメア短縮は、成人型心筋細胞と共に疾患の型を調べるために使用される標準的な生理学的評価の1つである。しかし、これらの細胞は位相対比顕微鏡では見えないサルコメアを未発達にしているので、利用可能な方法はPSC-CMの収縮性を評価するのに適切ではない。この問題に対処し、PSC-CMでサルコメア短縮を行うために、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質および蛍光ライブイメージングを使用した。細いZ線とM線は、それぞれ両端とサルコメアの中心に存在する。z-ラインタンパク質は、αアクチニン(ACTN2)、テレトニン(TCAP)、アクチン関連LIMタンパク質(PDLIM3)、および1つのM線タンパク質であるミオメシン-2(Myom2))を蛍光タンパク質でタグ付けしました。これらのタグ付きタンパク質は、内因性対立アレスからノックインまたはアデノ関連ウイルス(AAV)から発現することができる。ここでは、マウスとヒト多能性幹細胞を心筋細胞に分化し、AAVを産生し、ライブイメージングを行い、分析する方法を紹介します。また、PSC-CMのパターン培養用ポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプの製造方法についても説明し、蛍光タグ付きタンパク質によるサルコメア短縮の解析を容易にします。サルコメアの短縮を評価するために、拍動細胞のタイムラプス画像を電気刺激(0.5〜1Hz)下で高フレームレート(毎秒50〜100フレーム)で記録した。細胞収縮の過程でサルコメアの長さを分析するために、記録されたタイムラプス画像はImageJ / FijiのプラグインであるSarcOptiMに施されました。我々の戦略は、PSC-CMにおける心疾患のフェノタイプを調査するための簡単なプラットフォームを提供する。

ノックインPSC-CMレポーターラインを使用したサルコメア短縮測定。サルコメアラベルPSC-CMはサルコメア短縮を測定するために使用されました。ラインは内在性の場所からMyom2-RFPとACTN2-mCherryを表現します。TagRFPはMyom2に挿入され、M線に局地化するMタンパク質をコーディングし、mCherryはACTN2にノックインされ、αアクチニンをコーディングし、Z...

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Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。

蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

未発達で組織化されていないサルコメアによる多能性幹細胞由来心筋細胞におけるサルコメア機能の評価は困難である。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を使用して、サルコメアの短縮にアクセスできるようになりました。サルコメアを可視化し、幹細胞由来の心筋細胞と蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を使用してインビトロで機能を評価することができます。AAVベースの伝達を用いて、患者由来の人工多能性幹細胞にこの方法を拡大することができます。この方法は、体外症療法の開発に拡大することができ、それは直接にインビトロで疾患関連サルコメア機能不全を評価するために使用することができる。この方法は、小児心臓病学研究を含む心臓病学分野で有用である。しかし、筋症などの骨格筋機能障害の研究にも応用できる。分化誘導の日から4つを引いた日に、PBSで希釈したラミニン-511 E8の平方センチメートルあたり0.5マイクログラムの6ウェルプレートをコーティングし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに近づいて、人間が誘発する多能性幹細胞を摂氏37度で3分間組み換えトリプシンで治療する。細胞が剥離したら、細胞を10%FBSで補って計数し、遠心分離後にラミニン-511 E8とROCK阻害剤を添加したAK02N培地の2ミリリットル当たり1.25倍から5番目の細胞に細胞を再懸濁する。次に、6ウェルプレートの各ウェルからコーティング溶液を吸引し、各ウェルに2ミリリットルの細胞を播種する。プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。4日後、細胞は80%の合流に達する。分化を誘導するためにGSK-3阻害剤を添加したインスリン培地なしで、各ウェルの上清を2ミリリットルのRPMIプラスB27に置き換えます。分化の2日後、 穏やかに 1 ウェルあたりヤマアラシ阻害剤を補充するインスリン培地なしで RPMI プラス B27 の 2 ミリリットルで培地を交換します。.細胞は100%の合流に達しているはずです。分化の4日目に、上清を2ミリリットルのRPMIとB27に優しく交換します。細胞は高密度のままで、一部は浮き始めている可能性があります。分化の7日目と9日目に、各ウェルの上清を、選択的多能性幹細胞由来心筋細胞培養のためにプロマイシンを補充したインスリンで、RPMIとB27の2ミリリットルに置き換えます。この時点で、細胞を叩く細胞は培養内で観察されるべきである。パターン化された多能性幹細胞由来の心筋細胞培養を行う場合は、まず、修理テープを使用して、カスタムメイドのPDMSスタンプの表面からほこりを取り除き、スタンプを70%エタノールに簡単に沈めます。エアーダスターを使用して、スタンプ表面からエタノールを取り除き、0.5%MPCポリマーとエタノールの5〜10マイクロリットルで表面を処理します。ポリマーが完全に乾燥したら、35ミリメートルのイメージング皿の中のポリマーカバースリップにスタンプを置き、スタンプに重みを置きます。10分後、軽い顕微鏡を使用してパターンがカバースリップに移されたことを確認し、PBSで皿とカバースリップを2回洗います。2回目の洗浄後、カバースリップにラミニン-511 E8の1平方センチメートルあたり0.5〜1マイクログラムをコーティングし、0.1%ゼラチンで希釈し、室温で2〜4時間のインキュベーションを行います。分化の10日目に、PBSで細胞を2回洗浄し、続いて摂氏37度で3〜5分間、1回の組換えトリプシンを1回ずつ処理する。カウント後、RPMIとB27のミリリットル当たり5番目の細胞に2.5〜5倍の細胞をピューロマイシン濃度で補充し、1ミリリットルの細胞をプレートに播種して摂氏37度で一晩培養します。翌朝、上清を新鮮なRPMIプラスB27にピューロマイシンを添加したインスリンで置き換え、細胞を培養インキュベーターに戻し、イメージングのために週21〜28日まで培地を2〜3回リフレッシュする。PCCSM培養におけるサルコメア短縮のタイムラプスイメージングのために、蛍光共焦点顕微鏡の100倍の対物レンズに油を塗布し、関連ソフトウェアでライブイメージング条件を選択します。良好な代表データを得るためには、最も高いフレームレートを選択し、シャッターを開くように設定し、取得領域の作物に4対4のビニングを適用して、タイムラプスイメージング中の画像間の最短間隔を達成します。細胞の拍動率が低い場合は、電界刺激によって細胞を呼び起こし、タイムラプス記録を開始し、画像化中に画像フィールドが焦点を当てたままであることを注意してください。イメージング期間の終了時に、タイムラプス画像を適切なフォルダに保存します。タイムラプス画像を解析するには、一連のタイムラプス画像をImageJに開き、サルコメアパターンが明確に観察されるまで画像の明るさとコントラストを調整します。[その他のツール] メニューで SarcOptiM を選択し、コントロール Shift P キーとツールバーの 1 ミクロン ボタンを押して、プログラムの調整手順を使用します。次に、サルコメアの領域を横切ってサルコメアの短縮を測定し、単一セルAVIをクリックしてサルコメア短縮解析を開始します。サルコメア標識されたパターン多能性幹細胞由来心筋細胞のタイムラプスイメージングは、異なる時点でのサルコメア短縮を測定するために使用することができる。パターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞培養で典型的に認められるサルコメアの解体を克服するために、特定のPDMSスタンプは、ストライプパターンでパターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞を培養するために使用することができ、これは、非パターン領域で培養された細胞と比較して、細長い細胞形状およびより組織化されたサルコメアパターンを促進する。パターン化培養はまた、より良い細胞収縮を促進し、非パターン培養細胞と比較して滑らかなサルコメア長さのプロファイルを提供する。AAVトランスデューセドパターン多能性幹細胞由来の心筋細胞は、パターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞に沿って肉体GFPシグナルを早くも3日後に発現させ、サルコメア収縮プロファイルの測定にも使用できる。また、トランスダクション時にブラストシジン耐性遺伝子を添加することで、90%以上の純度にパターン化された多能性幹細胞由来の心筋細胞選択を容易にして、より容易かつ高品質な画像解析を容易にするために、直線的に移動するサルコメアを有する領域を同定し、最高フレームレートで画像を得ることが不可欠である。この方法を用いて、肉腫タンパク質における成熟の役割を評価し、疾患特異的な患者由来のiPS細胞に由来するラボ心筋細胞におけるサルコメア機能障害を研究することができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成<em&gt; AAVS1</em&gt;軌跡

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

ラット心筋細胞の分離と培養

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

小動物モデルにおける外部ビーム放射線を用いた多能性幹細胞由来の奇形の対象となる、選択的な治療

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

細胞外フラックス アナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

hiPSC由来心筋細胞を用いた虚血性心疾患のモデルと心筋細胞収縮の映像的比較

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...