Name: sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins. at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio en la División de Medicina Regenerativa de la Universidad médica de Jichi por la útil discusión y asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por las subvenciones de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (AMED; JP18bm0704012 y JP20bm0804018), la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS; JP19KK0219), y la Sociedad Japonesa de Circulación (la Subvención para la Investigación Básica) a H.U.

1. Diferenciación de células madre pluripotentes de ratón
<ol><li>Mantenimiento de células ES de ratón<ol>
<li>Medio de mantenimiento: Mezclar 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 5 mL de L-alanina-L-glutamina, 5 mL de aminoácido no esencial (NEAA), 5 mL de Piruvato de Sodio de 100 mM, y 909 μl de 55 mM 2-Mercaptoetanol con 450 mL de Medio Esencial Mínimo de Glasgow (GMEM). Factor inhibitorio de la leucemia del suplemento (LIF), CHIR-99021, y PD0325901 en una concentración final de 1000 U/mL, 1 μM, y 3 μM, res...

<ol>
	<li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors.">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li><li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy:+an+overview.">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li><li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes:+Progress,+Promises+and+Challenges.">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense-mediated+exon+skipping:+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy.">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies.">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation.">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li><li>Cho, G. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy.">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes.">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li><li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li><li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs.">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li><li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511/521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation.">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).</li><li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cardiomyocyte+show+of+force:+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness.">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li><li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+(ES)+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma.">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).</li><li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).</li><li>Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV:+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution.">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li><li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40.">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).</li><li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB.">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).</li><li>Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Efficient+Knock-in+Mouse+and+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+CRISPR-Cas9.">Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9.</a> Methods of Molecular Biology. , (2020).</li><li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes.">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization,+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour.">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).</li><li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations.">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li></ol>

Psc-CMs tienen gran potencial para ser utilizado como una plataforma in vitro para modelar la enfermedad cardíaca y para probar los efectos de los fármacos. No obstante, primero debe establecerse un método preciso y unificado para evaluar las funciones de PSC-CMs. La mayoría de las pruebas funcionales funcionan con PSC-CMs, por ejemplo, electrofisiología, calcio transitorio y metabolismo26,y uno de los primeros estudios psc-cm derivados de pacientes fue sobre el síndrome de QT largo...

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de mortalidad a nivel mundial1 y la miocardiopatía representa la tercera causa de muertes relacionadas con el cardíaco2. La cardiomiopatía es un grupo colectivo de enfermedades que afectan a los músculos cardíacos. Los recientes desarrollos de células madre pluripotentes inducidas (iPS) y la diferenciación dirigida de las células iPS hacia cardiomiocitos (PSC-CMs) han abierto la puerta para el estudio de cardiomiocitos con genoma de pacientes como modelo in vitro de cardiomiopatía. Estas células pueden ser utilizadas para comprender la fisiopatología de las enfermedades cardíacas, para dilucidar sus mecanismos moleculares y para probar diferentes candidatos terapéuticos3. Existe una enorme cantidad de interés, por lo tanto, se han generado células iPS derivadas del paciente (por ejemplo, miocardiopatía hipertrófica [HCM]4,5,miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho [ARVC]6,miocardiopatía dilatada [DCM]7y miocardiopatías relacionadas con las mitocondrias8,9). Debido a que una de las características de la cardiomiopatía es la disfunción y la interrupción de los sarcómeros, se necesita una herramienta válida que mida uniformemente la función del sarcómero.
El acortamiento de sarcómero es la técnica más utilizada para evaluar la función del sarcómero y la contractilidad de los cardiomiocitos adultos derivados de modelos animales y humanos. Para realizar el acortamiento del sarcómero, se requieren sarcómeros bien desarrollados que sean visibles bajo contraste de fase. Sin embargo, psc-CMs cultivados in vitro muestran sarcómeros subdesarrollados y desorganizados y, por lo tanto, no pueden ser utilizados para medir correctamente el acortamiento de sarcómero10. Esta dificultad para evaluar adecuadamente la contractilidad de PSC-CMs dificulta su uso como plataforma para evaluar las funciones cardíacas in vitro. Para evaluar indirectamente la contractilidad psc-cms, se han utilizado microscopía de fuerza atómica, matrices de micro-postes, microscopía de fuerza de tracción y mediciones de impedancia para medir los efectos del movimiento ejercido por estas células en sus alrededores11,12,13. Grabaciones de video microscopía más sofisticadas y menos invasivas del movimiento celular real (por ejemplo, SI8000 de SONY) se pueden utilizar para evaluar alternativamente su contractilidad, sin embargo, este método no mide directamente el movimiento del sarcómero o la cinética de generación de fuerza14.
Para medir directamente el movimiento del sarcómero en PSC-CMs, están surgiendo nuevos enfoques, como el etiquetado fluorescente de la proteína sarcómero. Por ejemplo, Lifeact se utiliza para etiquetar actina filamentosa (F-actina) para medir el movimiento del sarcómero15,16. Las células iPS modificadas genéticamente son otra opción para etiquetar proteínas de sarcómero (por ejemplo, α-actinina [ACTN2] y miomesina-2 [MYOM2]) por la proteína fluorescente17,18,19.
En este papel, describimos cómo realizar la proyección de imagen del lapso de tiempo para medir el acortamiento del sarcómero usando Myom2-TagRFP (células madre embrionarias del ratón [ES]) y ACTN2-mCherry (células humanas del iPS). También mostramos que un cultivo modelado facilita la alineación de sarcómeros. Además, describimos un método alternativo de etiquetado del sarcómero, usando los virus adeno-asociados (AAVs), que se pueden aplicar extensamente a las células paciente-derivadas del iPS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,</td>
			<td>NOF Corp.</td>
			<td>LIPIDURE-CM5206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm imaging dish with a polymer coverslip (&#181;-Dish 35 mm, high)</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVproR Helper Free System (AAV6) 
			(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3&#39; UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50X), minus Vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase (25 U/&#181;L)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>70746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>029-18701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab142216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD drawing software,</td>
			<td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td>
			<td>Rhinoceros 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium etchant</td>
			<td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium mask coated with AZP1350</td>
			<td>Clean Surface Technology Co., Japan</td>
			<td>CBL2506Bu-AZP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Moregate</td>
			<td>59301104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10, Human, Recombinant,</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>060-04543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS BOTTOM culture plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G-1.5-13-F/H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)</td>
			<td>Nippi</td>
			<td>892012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>Union Optical Co., Ltd., Japan</td>
			<td>PEM-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maskless lithography tool</td>
			<td>NanoSystem Solutions, Inc., Japan</td>
			<td>D-Light DL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF (0.45-&#181;m filter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myom2-RFP (SMM18)</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
			<td>Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sansei medical co. Ltd</td>
			<td>01-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer</td>
			<td>Dow Corning Corp., MI, USA</td>
			<td>SILPOT 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine MAX (MW. 40,000)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive photoresist developer</td>
			<td>Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>NMD-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Takara</td>
			<td>9034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>166-23153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.</td>
			<td>338-AC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Mikasa Co., Ltd., Japan</td>
			<td>MS-A100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spininng confocal microscopy</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>195-16053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>314-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant</td>
			<td>Fujifilm wako</td>
			<td>226-01781</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sarcomere shortening of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using fluorescent-tagged sarcomere proteins.

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes (PSC-CMs) se pueden producir a partir de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (ES/iPS). Estas células proporcionan fuentes prometedoras para el modelado de enfermedades cardíacas. Para las cardiomiopatías, el acortamiento del sarcómero es una de las evaluaciones fisiológicas estándar que se utilizan con los cardiomiocitos adultos para examinar sus fenotipos de enfermedad. Sin embargo, los métodos disponibles no son apropiados para evaluar la contractilidad de PSC-CMs, ya que estas células tienen sarcómeros subdesarrollados que son invisibles bajo microscopía de contraste de fase. Para dirigir este problema y para realizar el acortamiento del sarcómero con PSC-CMs, las proteínas fluorescente-marcadas con etiqueta y la vivo-proyección de imagen fluorescente fueron utilizadas. Las líneas Z delgadas y una línea M residen en ambos extremos y en el centro de un sarcómero, respectivamente. Las proteínas de la línea Z — α-Actinina (ACTN2), Telethonin (TCAP), y proteína LIM asociada a la actina (PDLIM3) — y una proteína de la M-línea — Myomesin-2 (Myom2) — fueron etiquetadas con las proteínas fluorescentes. Estas proteínas etiquetadas se pueden expresar a partir de alelos endógenos como knock-ins o de virus adenoasociados (AAVs). Aquí, presentamos los métodos para diferenciar las células madre pluripotentes de ratón y humanas a los cardiomiocitos, para producir AAVs, y para realizar y analizar imágenes en vivo. También se describen los métodos para la producción de polidimetilsiloxano (PDMS) sellos para un cultivo modelado de PSC-CMs, que facilita el análisis de acortamiento de sarcómero con proteínas marcadas con fluorescentes. Para evaluar el acortamiento del sarcómero, las imágenes del lapso de tiempo de las células que golpeaban fueron registradas en un alto framerate (50-100 cuadros por segundo) bajo estímulo eléctrico (0.5-1 hertzios). Para analizar la longitud del sarcómero en el curso de la contracción celular, las imágenes de lapso de tiempo grabadas se sometieron a SarcOptiM, un plug-in para ImageJ / Fiji. Nuestra estrategia proporciona una plataforma simple para investigar fenotipos de enfermedades cardíacas en PSC-CMs.

Medición del acortamiento del sarcómero utilizando líneas de reportero de PSC-CMs knock-in. PSC-CMs Sarcomere-etiquetado fue utilizado para medir el acortamiento del sarcómero. Las líneas expresan Myom2-RFP y ACTN2-mCherry de loci endógenos. TagRFP se insertó en Myom2,codificando proteínas M que se localizan en la línea M, mientras que mCherry se llamó a ACTN2,codificando α-Actinina, que se localiza en la línea Z18,<su...

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Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Este método se puede utilizar para examinar el acortamiento del sarcómero usando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.

Sarcómero acortamiento De Cardiomiocitos Derivados De Células Madre Pluripotentes Usando Proteínas De Sarcómero Marcado Con Fluorescentes.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Es difícil evaluar la función del sarcómero en los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes debido a su sarcómero subdesarrollado y desorganizado. Usando proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes, ahora podemos acceder al acortamiento de sarcómero. Podemos visualizar sarcómeros y evaluar su función in vitro utilizando cardiomiocitos derivados de células madre y proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.Utilizando la transducción basada en AAV, podemos ampliar el método a cualquier célula madre pluripotente inducida derivada del paciente. Este método se puede ampliar al desarrollo de la terapia de la cardiomiopatía, pues se puede utilizar para evaluar directamente la disfunción enfermedad-relacionada del sarcómero in vitro. Este método es útil en el campo de la cardiología, incluyendo el estudio de cardiología pediátrica.Sin embargo, también se puede aplicar al estudio de la disfunción del músculo esquelético, como la miopatía. En el día menos cuatro de inducción de diferenciación, cubra una placa de seis pozos con 0,5 microgramos por centímetro cuadrado de laminina-511 E8 diluida en PBS para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados y dióxido de carbono al 5%. Acercándose al final de la incubación, trate las células madre pluripotentes inducidas por el hombre con tripsina recombinante durante tres minutos a 37 grados Centígrados.Cuando las células se han separado, cosechar las células al medio suplementado con 10% FBS para el conteo, y resuspend las células en un 1,25 veces 10 a las quintas células por dos mililitros de ak02n medio complementado con laminin-511 E8 y el inhibidor de rock después de la centrifugación. A continuación, aspire la solución de recubrimiento de cada pozo de la placa de seis pozos y sembra dos mililitros de células en cada pozo. Devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares.Después de cuatro días, las células alcanzan el 80% de confluencia. Substituya el sobrenadante en cada pozo con dos mililitros de RPMI más B27 sin medio de insulina suplementado con el inhibidor de GSK-3 por pozo para inducir la diferenciación. Después de dos días de diferenciación, reemplace suavemente el medio con dos mililitros de RPMI más B27 sin medio de insulina complementado con inhibidor de puercoespín por pozo.Las células deberían haber alcanzado el 100% de confluencia. En el cuarto día de diferenciación, reemplace suavemente los sobrenadantes con dos mililitros de RPMI más B27 sin insulina por pozo. Las células deben permanecer en una alta densidad, y algunas pueden haber comenzado a flotar.En el día siete y nueve de diferenciación, reemplace el sobrenadante en cada pozo con dos mililitros de RPMI más B27 con insulina suplementada con puromicina para el cultivo selectivo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes. En este punto, las células batientes deben observarse dentro de los cultivos. Para establecer un cultivo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes estampadas, primero use cinta de rematada para eliminar cualquier polvo de la superficie de un sello PDMS hecho a medida, y sumerja brevemente el sello en etanol al 70%.Use un plumero de aire para eliminar el etanol de la superficie del sello y trate la superficie con cinco a 10 microlitros de polímero y etanol al 0,5% MPC. Cuando el polímero se haya secado por completo, coloque el sello en una cubierta de polímero en un plato de imágenes de 35 milímetros y coloque un peso en el sello. Después de 10 minutos, use un microscopio de luz para confirmar que el patrón se ha transferido al cubrebocas, y lave el plato y el cubrebocas dos veces con PBS.Después del segundo lavado, cubra el cubrebocas con 0,5 a un microgramo por centímetro cuadrado de laminina-511 E8 diluido en gelatina al 0,1% para una incubación de dos a cuatro horas a temperatura ambiente. En el día 10 de diferenciación, lave las células dos veces con PBS, seguido de un tratamiento con un mililitro de tripsina recombinante por pocillo durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de contar, resuspend las células en un 2,5 a cinco veces 10 a las quintas células por mililitro de RPMI más B27 con insulina complementada con la concentración de puromycin, y la semilla de un mililitro de células en la placa para una incubación de noche en 37 grados centígrados.A la mañana siguiente, reemplace el sobrenadante con RPMI fresco más B27 con insulina suplementada con puromicina, y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular, refrescando el medio dos o tres veces por semana hasta los días 21 a 28 para obtener imágenes. Para obtener imágenes de lapso de tiempo del acortamiento de sarcómeros en los cultivos de PCCSM, aplique aceite a la lente objetivo de 100 veces de un microscopio confocal fluorescente y seleccione las condiciones de imagen en vivo en el software asociado. Para obtener buenos datos representativos, seleccione la velocidad de fotogramas más alta, ajuste el obturador para que se abra y aplique una agrupación de cuatro por cuatro en un recorte del área de adquisición para lograr los intervalos más cortos entre las imágenes durante la proyección de imagen de lapso de tiempo.Si la tasa de batimiento de las células es baja, evocar las células mediante estimulación de campo eléctrico, y comenzar la grabación de lapso de tiempo, teniendo cuidado de que el campo de la imagen permanece en foco durante la proyección de imagen. Al final del período de creación de imágenes, guarde las imágenes de lapso de tiempo en una carpeta adecuada. Para analizar las imágenes de lapso de tiempo, abra una serie de imágenes de lapso de tiempo en ImageJ y ajuste el brillo y el contraste de las imágenes hasta que se pueda observar claramente el patrón de sarcómero.En el menú Más herramientas, seleccione SarcOptiM y pulse Control Shift P y el botón de una micras de la barra de herramientas para utilizar las instrucciones para calibrar el programa. A continuación, dibuje una línea a través de la región del sarcómero que se utilizará para medir el acortamiento del sarcómero y haga clic en AVI de una sola celda para comenzar el análisis de acortamiento del sarcómero. Las imágenes de lapso de tiempo de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes etiquetadas con sarcómero y con patrón se pueden utilizar para medir el acortamiento del sarcómero en diferentes puntos de tiempo.Para superar la desorganización del sarcómero típicamente observada en cultivos de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con patrones, se pueden usar sellos pdms específicos para cultivar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con patrones en un patrón de rayas, que promueve una forma de célula alargada y un patrón de sarcómero más organizado en comparación con las células cultivadas en un área no patrón. Los cultivos modelados también promueven una mejor contracción celular y proporcionan un perfil de longitud de sarcómero suave en comparación con las células cultivadas sin patrón. AAV-transduced patrón pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes express sarcomeric GFP signals along the patterned pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as early as three days post-transduction and can also be used to measure sarcomere contraction profiles.Además, la adición de un gen resistente a la blasticidina durante la transducción también se puede utilizar para facilitar la selección de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con una pureza de más del 90% Para facilitar un análisis de imágenes más fácil y de mayor calidad, es esencial identificar un área con sarcómeros que se muevan linealmente y obtener imágenes a la velocidad de fotogramas más alta. Usando este método, podemos evaluar el papel de la maduración en proteínas del sarcoma para estudiar la disfunción del sarcómero en el cardiomyocyte del laboratorio derivado de las células enfermedad-específicas, paciente-derivadas del iPS.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Investigación

Medicina

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Generación rápida y eficiente de las células madre pluripotentes recombinante humana mediada por la recombinasa Cambio en el cassette<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Tratamiento específicos y selectivo de los Teratomas derivados de células madre pluripotentes utilizando radiación de haz externo en un modelo animal de pequeño

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Modelo de cardiopatía isquémica y comparación basada en vídeo de la contracción de cardiomiocitos utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSC

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...