Name: patient-derived tumor explants as a "live" preclinical platform for predicting drug resistance in patients
Uploaded: 2021-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients at JoVE.com

Wir danken den Chirurgen und Pathologen des University Hospitals of Leicester NHS Trust für die Bereitstellung von chirurgisch reseziertem Tumorgewebe. Wir danken auch der Histology-Einrichtung innerhalb von Core Biotechnology Services für die Hilfe bei der Gewebeverarbeitung und dem Schneiden von FFPE-Gewebeblöcken und Kees Straatman für die Unterstützung bei der Verwendung des Vectra Polaris. Diese Forschung wurde vom Explant Consortium unterstützt und finanziert, das aus vier Partnern besteht: der University of Leicester, der MRC Toxicology Unit, den Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories und LifeArc. Zusätzliche Unterstützung kam vom CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Die Finanzierung für GM, CD und NA wurde durch das Catalyst-Programm von Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066) bereitgestellt, das durch Eine Finanzierung von Pfizer unterstützt wird.

1. Gewebeentnahme
<ol><li>Nach der Operation frisch resezierte menschliche Tumorproben in ein Röhrchen mit 25 ml Frischekulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin + 1% (v/v) fetalem Kälberserum + 1% Penicillin-Streptomycin) und auf Eis gelagert. Verarbeiten Sie die Explantation innerhalb von 2 h nach der Operation in einer sterilen Haube der Klasse II.</li>
</ol>2. Explant Vorbereitung
<ol...

Dieser Beitrag beschreibt die Methoden zur Erzeugung, medikamentösen Behandlung und Analyse von PDEs und beleuchtet die Vorteile der Plattform als präklinisches Modellsystem. Die Ex-vivo-Kultivierung eines frisch resezierten Tumors, die keine Dekonstruktion beinhaltet, ermöglicht die Beibehaltung der Tumorarchitektur13,24 und damit der räumlichen Wechselwirkungen zellulärer Komponenten in der TME sowie der intratumoralen Heterogenität. Diese Methode zeigt, ...

Die Entwicklung wirksamer und sicherer Krebsmedikamente erfordert geeignete präklinische Modelle, die auch Einblicke in Wirkmechanismen geben können, die die Identifizierung prädiktiver und pharmakodynamischer Biomarker erleichtern können. Es istbekannt,dass die inter- und intratumorische Heterogenität1,2,3,4,5 und die TME6,7,8,9,10,11 ,12 die Reaktionen auf Krebsmedikamente beeinflussen, und viele bestehende präklinische Krebsmodelle wie Zelllinien, Organoide und Mausmodelle sind nicht in der Lage, diese entscheidenden Funktionen. Ein "ideales" Modell ist eines, das die komplexen räumlichen Interaktionen von malignen mit nicht-malignen Zellen innerhalb von Tumoren rekapitulieren und die regionalen Unterschiede innerhalb von Tumoren widerspiegeln kann. Dieser Artikel konzentriert sich auf PDEs als eine aufstrebende Plattform, die viele dieser Anforderungen erfüllen kann13.
Das erste Beispiel für die Verwendung menschlicher PDEs, auch histokulturen genannt, stammt aus den späten 1980er Jahren, als Hoffman et al. Scheiben von frisch resezierten menschlichen Tumoren erzeugten und in einer Kollagenmatrixkultivierten 14,15. Dies beinhaltete die Etablierung eines 3D-Kultursystems, das die Gewebearchitektur bewahrte und die Aufrechterhaltung der Stromakomponenten und Zellinteraktionen innerhalb der TME sicherstellte. Ohne den ursprünglichen Tumor zu dekonstruieren, läuteten Hoffman et al.16 einen neuen Ansatz der translationalen Forschung ein, und seit dieser Zeit haben viele Gruppen verschiedene Explantatmethoden optimiert, mit dem Ziel, die Gewebeintegrität zu erhalten und genaue Arzneimittelreaktionsdaten zu generieren17,18,19,20,21,22,23,24 , obwohl einige Unterschiede zwischen den Protokollen offensichtlich sind. Butler et al. kultivierten Expflanzen in Gelatineschwämmen, um die Diffusion von Nährstoffen und Medikamenten durch die Probe20,21,25zu unterstützen, während Majumder et al. ein Tumorökosystem schufen, indem sie Explantaten auf einer Matrix kultivierten, die aus Tumor- und Stromalproteinen in Gegenwart von autologem Serum bestand, das vom selben Patienten stammt22, 23.
In jüngerer Zeit hat unsere Gruppe ein Protokoll aufgestellt, bei dem Explantaten durch Fragmentierung von Tumoren in 2 - 3 mm3-großeStücke erzeugt werden, die dann ohne zusätzliche Komponenten auf durchlässigen Membranen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche eines Kultursystems platziert werden24. Zusammengenommen haben diese zahlreichen Studien gezeigt, dass PDEs die Kultur intakter, lebender Fragmente menschlicher Tumoren ermöglichen, die die räumliche Architektur und regionale Heterogenität der ursprünglichen Tumoren beibehalten. In ursprünglichen Experimenten wurden Explantaten oder Histokulturen in der Regel nach einer medikamentösen Behandlung einer Homogenisierung unterzogen, wonach verschiedene Lebensfähigkeitstests auf die homogenisierten Proben angewendet wurden, wie der Histokultur-Wirkstoff-Response-Assay20,21, der MTT-Assay (3-(6)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid), der Lactatdehydrogenase-Assay oder der Resazurin-basierte Assay26,27,28 . Jüngste Fortschritte bei den Techniken der Endpunktanalyse, insbesondere der digitalen Pathologie, haben nun das Repertoire an Endpunkttests und Assays erweitert, die an Explantaten durchgeführt werden können29,30. Um diese neuen Technologien anzuwenden, werden Explantate anstelle der Homogenisierung in Formalin fixiert, in Paraffin (FFPE) eingebettet und dann mit Immunfärbungstechniken analysiert, was eine räumliche Profilierung ermöglicht. Beispiele für diesen Ansatz wurden für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC), Brustkrebs, Darmkrebs und Mesotheliom-Explantaten dokumentiert, wobei die immunhistochemische Färbung für den Proliferationsmarker Ki67 und den apoptotischen Marker, die gespaltene Poly-ADP-Ribose-Polymerase (cPARP), verwendet wurde, um Veränderungen in der Zellproliferation und im Zelltod zu überwachen24,31,32,33,34.
Die multiplexierte Immunfluoreszenz ist besonders geeignet für die räumliche Profilierung von Arzneimittelreaktionen in Explantaten am Endpunkt35. Beispielsweise ist es möglich, die Relokalisierung und räumliche Verteilung bestimmter Klassen von Immunzellen, wie Makrophagen oder T-Zellen, innerhalb der TME bei medikamentöser Behandlung13 , 36,37,38zumessen und zu untersuchen, ob einTherapeutikumden Übergang vom "kalten Tumor" zum "heißen Tumor" begünstigen kann39 . In den letzten Jahren hat sich diese Gruppe auf die Ableitung von PDEs aus verschiedenen Tumorarten (NSCLC, Nierenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Melanom) und die Erprobung einer Reihe von Krebsmedikamenten konzentriert, darunter Chemotherapien, niedermolekulare Inhibitoren und Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs). Endpunktanalysemethoden wurden optimiert, um die multiplexierte Immunfluoreszenz einzubeziehen, um eine räumliche Profilierung von Biomarkern für die Lebensfähigkeit sowie von Biomarkern für verschiedene Bestandteile der TME zu ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099</td>
			<td>Staining reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent / Block, 1x</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Antibody diluent/blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead NANOpure Diamond</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td></td>
			<td>Ultra Pure (UP) H2O machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid Monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7129</td>
			<td>Reagent for citrate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Multiple Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td>6 multiwell plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Dilactate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>100 mm diameter dish for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) Dubelcco&#39;s Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco (Life Technologies)</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Tissue culture medium (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mountant</td>
			<td>VWR</td>
			<td>360294H</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mountant</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6522</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td>Reagent for TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>CellPath</td>
			<td>RBC-0100-00A</td>
			<td>Staining reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td>For use in tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Fisher (Acros)</td>
			<td>119690010</td>
			<td>10% Formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iGenix, microwave oven IG2095</td>
			<td>iGenix</td>
			<td>IG2095</td>
			<td>Microwave used for antigen retreival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Industrial methylated spirit (IMS)</td>
			<td>Genta Medical</td>
			<td>199050</td>
			<td>99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>InForm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ASP3000 Tissue Processor</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Automated Vacuum Tissue Processor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Arcadia H and C</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Embedding wax bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica RM2125RT</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica ST4040 Linear Stainer</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>H&#38;E stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Haematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GHS132-1L</td>
			<td>Staining reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m</td>
			<td>Merck Milipore</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td>Organotypic culture insert disc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novolink Polymer Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RE7150-K</td>
			<td>DAB staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 480</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1500001KT</td>
			<td>Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 520</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1487001KT</td>
			<td>Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 570</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 620</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1495001KT</td>
			<td>Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 650</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1496001KT</td>
			<td>Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 690</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1497001KT</td>
			<td>Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1501001KT</td>
			<td>Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>HRP polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11548876</td>
			<td>For use in tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>PhenoChart</td>
			<td>Viewer software for scanned images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td>Thermo Scientific Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Plus Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36961</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Carrier</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/3160/63</td>
			<td>10% Formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4920/53</td>
			<td>Reagent for citrate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)</td>
			<td>KEMDENT</td>
			<td>1-601</td>
			<td>Dental wax surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10098889</td>
			<td>Holder for slides and slide clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11927774</td>
			<td>Slide clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Reagent for TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vecta Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Polaris Slide Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Vectra Polaris</td>
			<td>Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Genta Medical</td>
			<td>XYL050</td>
			<td>De-waxing agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived tumor explants as a "live" preclinical platform for predicting drug resistance in patients

Das Verständnis der Arzneimittelresistenz und die Entwicklung neuartiger Strategien zur Sensibilisierung hochresistenter Krebsarten beruhen auf der Verfügbarkeit geeigneter präklinischer Modelle, die das Ansprechen der Patienten genau vorhersagen können. Einer der Nachteile bestehender präklinischer Modelle ist die Unfähigkeit, die menschliche Tumormikroumgebung (TME) kontextuell zu erhalten und die intratumorale Heterogenität genau darzustellen, wodurch die klinische Übersetzung von Daten eingeschränkt wird. Im Gegensatz dazu ermöglicht die PDE-Plattform (Patient Derived Explant) durch die Darstellung der Kultur lebender Fragmente menschlicher Tumoren die Untersuchung von Arzneimittelreaktionen in einem dreidimensionalen (3D) Kontext, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der ursprünglichen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Frühere Berichte mit PDEs haben die Fähigkeit der Plattform dokumentiert, chemosensitive von chemoresistenten Tumoren zu unterscheiden, und es wurde gezeigt, dass diese Segregation prädiktiv für das Ansprechen von Patienten auf dieselben Chemotherapien ist. Gleichzeitig ermöglichen PDEs die Möglichkeit, molekulare, genetische und histologische Merkmale von Tumoren zu untersuchen, die Arzneimittelreaktionen vorhersagen, wodurch Biomarker für die Patientenstratifizierung sowie neuartige interventionelle Ansätze zur Sensibilisierung resistenter Tumore identifiziert werden. Dieses Papier berichtet ausführlich über die PDE-Methodik, von der Sammlung von Patientenproben bis hin zur Endpunktanalyse. Es enthält eine detaillierte Beschreibung der Explantatableitungs- und Kulturmethoden und hebt gegebenenfalls maßgeschneiderte Bedingungen für bestimmte Tumore hervor. Für die Endpunktanalyse liegt der Schwerpunkt auf der multiplexierten Immunfluoreszenz und der multispektralen Bildgebung für die räumliche Profilierung wichtiger Biomarker sowohl in tumoralen als auch in stromalen Regionen. Durch die Kombination dieser Methoden ist es möglich, quantitative und qualitative Drug-Response-Daten zu generieren, die mit verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern in Beziehung gesetzt und somit potenziell für die Identifizierung von Biomarkern verwendet werden können.

Die multispektrale Bildgebung von mIF-gefärbten histologischen Schnitten ermöglicht die Identifizierung und Phänotypisierung einzelner Zellpopulationen sowie die Identifizierung von Tumor- und Stromakomponenten im explantierten TME (Abbildung 2). Die multispektrale Bildgebung ist besonders nützlich für die Analyse von Geweben mit hoher intrinsischer Autofluoreszenz, wie z. B. Gewebe mit hohem Kollagengehalt, da sie es ermöglicht, das Autofluoreszenzsignal von anderen Signalen zu entpac...

Watch this Scientific Journal Video about Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients at JoVE.com

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Dieser Beitrag beschreibt Methoden zur Generierung, medikamentösen Behandlung und Analyse von patientenabgeleiteten Explantaten zur Beurteilung von Tumormedikamentenreaktionen in einem lebenden, patientenrelevanten, präklinischen Modellsystem.

Patienten-abgeleitete Tumor-Explantate als "Live" präklinische Plattform zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei Patienten

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Die vom Patienten abgeleiteten Explantate sind eine kurzfristige Methode, die sofortige Arzneimittelansprechdaten liefert, die die Patientenergebnisse genau vorhersagen können. Die PD-Plattformen ermöglichen es, Arzneimittelreaktionen in einem 3D-Kontext zu untersuchen, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der regionalen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Explantate haben das Potenzial, neue Einblicke in den Metabolismus und Wirkmechanismus eines Medikaments zu bieten und die Identifizierung neuer pharmakodynamischer Biomarker zu erleichtern.Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie alle chirurgischen Geräte mit 70% industrieller Methylbenzinlösung. Füllen Sie eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit 25 Millilitern frischem Medium auf Eis. Übertragen Sie die Probe mit einer Pinzette auf eine Zahnwachsoberfläche und schneiden Sie das Gewebe mit zwei Hauttransplantatklingen in Fragmente von etwa zwei bis drei Kubikmillimetern.Die Explantate in eine 10-Zentimeter-Schale geben und sechs bis neun Stücke des Gewebes in ein Ein-Milliliter-Röhrchen mit 10% nicht gepufferter Formalinlösung für eine 24-stündige Inkubation bei Raumtemperatur geben. Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 1,5 Millilitern frischem Medium pro Well. Und legen Sie eine organotypische Kulturschale in jeden Brunnen, so dass sie auf dem Medium schwebt.Legen Sie sechs bis neun Explantate auf jede Einlegescheibe und lagern Sie sie für eine 16-stündige Inkubation in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator, um die Rückgewinnung zu ermöglichen. Am nächsten Tag fügen Sie frisches Medium und Droge zu jedem Brunnen eines neuen Tellers hinzu. Fügen Sie einen Brunnen für die Fahrzeugsteuerung hinzu.Wenn alle medikamentösen Behandlungen vorbereitet sind, verwenden Sie eine Pinzette, um einen Einsatz in jede Vertiefung der neuen Sechs-Well-Platte für eine 24- bis 48-stündige Inkubation im Kohlendioxid-Inkubator zu übertragen. Nach der medikamentösen Behandlung werden die Bandscheiben in neue sechs Vertiefungsplatten mit 10% Formalin übertragen. Und fügen Sie ein paar Tropfen 10% Formalin an die Oberseite jeder Explantation hinzu, um eine vollständige Abdeckung mit dem Fixiermittel für 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur zu gewährleisten.Am nächsten Tag eine angemessene Anzahl kleiner Histologieschwämme in 70% industrieller Methylierungslösung einweichen. Und legen Sie die Schwämme in Histologiekassetten. Wenn alle Schwämme platziert wurden, übertragen Sie alle Explantate aus dem gleichen medikamentösen Behandlungszustand auf einen einzigen Schwamm, wobei die mit dem Medikament behandelte Seite jedes Explantats die eingeführte Bandscheibe berührt.Legen Sie einen weiteren vorgetränkten Schwamm auf jede Explant und schließen Sie die Kassette, um die Explantate in der Kassette zu sichern. Tauchen Sie dann die Kassetten in 70% industrielle Methylierungslösung, bevor Sie mit der histologischen Verarbeitung fortfahren. Führen Sie nach dem Scannen eine Trainingsanalyse durch und laden Sie die Scans mit den Stempeln für das Training in die entsprechende Analysesoftware.Navigieren Sie in der Singlemode-Ansicht durch die Bilder und wählen Sie die zu analysierenden Scans und den Scan mit intrinsischer Fluoreszenz aus. Klicken Sie mit dem intrinsischen Fluoreszenzscan in einer einzigen Ansicht auf die Autofluoreszenzauswahl, um ein Segment auf einem Bereich mit nicht gefärbtem Gewebe zu zeichnen. Klicken Sie auf Markierungen und Farben bearbeiten und geben Sie die Markernamen in das Feld ein, das jedem Fluorophor zugeordnet ist.Klicken Sie auf Bilder vorbereiten, damit die Software die Intensität der intrinsischen Fluoreszenz von allen hochgeladenen Bildern subtrahieren kann. Klicken Sie auf den Segmentgewebeschritt oben auf dem Bildschirm, um das Trainingsfenster für die Gewebesegmentierung zu öffnen. Geben Sie im Bereich Gewebekategorien den Namen jeder zu segmentierenden Gewebekategorie ein.Klicken Sie auf Zeichnen, um Bereiche um Gruppen von Zellen in der interessierenden Gewebekategorie zu zeichnen. Wechseln Sie dann zur nächsten Gewebekategorie und zeichnen Sie neue Regionen. Wenn alle Trainingsregionen definiert sind, verwenden Sie train tissue segmenter und warten Sie, bis sich die Trainingsgenauigkeit eingependelt hat.Möglicherweise bis zu einem Wert nahe 100% Klicken Sie auf das Segment, um die Gewebe zu segmentieren. Nachdem Sie die Qualität der Gewebesegmentierung überprüft haben, klicken Sie auf Zellsegmentierung und wählen Sie die zu segmentierenden Zellkompartimente aus. Um die Kernkomponente zu konfigurieren, verwenden Sie den typischen Intensitätsregler, um den Schwellenwert anzupassen, der zum Erkennen der Kernpixel verwendet wird.Live-Feedback wird vom Vorschaufenster bereitgestellt. Um die Cluster von Kernpixeln aufzuteilen, wählen Sie im Bedienfeld "Kernkomponentenaufteilung" die Schaltfläche aus, die die Färbequalität der Kerne am besten beschreibt, und verwenden Sie den Schieberegler, um die Teilungsempfindlichkeit anzupassen. Klicken Sie dann auf Alle segmentieren, um alle Bilder zu segmentieren.Wenn alle Bilder segmentiert wurden, fügen Sie im Phänotypbedienfeld die Liste der zu erkennenden Phänotypen hinzu und geben Sie den Namen der Phänotypen in das entsprechende Textfeld ein. Klicken Sie auf Phänotypen bearbeiten, um eine bestimmte Zelle auszuwählen, und wählen Sie den entsprechenden Phänotyp im Dropdown-Menü aus. Nachdem Sie die Auswahl für das Training abgeschlossen haben, klicken Sie auf den Zugklassifikator, um das Ergebnis jedes Phänotyps zu bewerten.Fahren Sie mit phenotype all fort, speichern Sie das Projekt und klicken Sie auf Exportieren. Wählen Sie die Registerkarte Stapelanalyse aus, und laden Sie das Projekt in den Stapelalgorithmus oder das Projektfeld. Um die Bilder und Tabellen zu exportieren, wählen Sie alle Felder in den Exportoptionen aus, klicken Sie auf Folien hinzufügen und laden Sie alle Bilder, die die Stempel für die zuvor vorbereiteten Stapel enthalten.Klicken Sie dann auf Ausführen, um die Stapelanalyse eines Stempels zu starten und die entsprechenden Daten zu exportieren, wenn er erfasst wurde. Die multispektrale Bildgebung von NSCLC-Explantatgewebe, das für Marker der Zelllebensfähigkeit gefärbt wurde, ermöglicht die Identifizierung und Phänotypisierung einzelner Zellpopulationen sowie die Identifizierung von Tumor- und Stromakomponenten innerhalb der explantierten Tumormikroumgebung. Gewebe- und Zellsegmentierung von Zelllebensfähigkeitsmarkerfärbungen multispektrale Bilder, wie gezeigt, können verwendet werden, um Zelltod und Proliferation in patientenabgeleiteten Explantaten zu quantifizieren, die mit Medikamenten von Interesse behandelt werden.Zum Beispiel wurde in dieser Analyse in Gewebeproben von Tumoren, die mit Nivolumab behandelt wurden, eine höhere Anzahl von sterbenden Zellen im Vergleich zu den kontrollbehandelten Tumorproben identifiziert. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, räumliche Informationen aus gefärbten Dissektionen zu extrahieren, wie dargestellt, die Berechnung von Interzellenabständen. Explantate können auch für eine umfassende räumliche Profilierung oder Massenzytometrie verwendet werden, wodurch Hunderte von Biomarkern gleichzeitig mit einer subsidiären Auflösung profiliert werden können, während die 3D-Struktur der Probe erhalten bleibt.PDs könnten die Wirksamkeit der Immuntherapie vorhersagen. Beispielsweise könnte es möglich sein, empfindliche oder resistente Fälle von Immun-Checkpoint-Inhibitoren zu unterscheiden und die Mechanismen zu untersuchen, die dieser Unterscheidung zugrunde liegen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Forschung

Krebsforschung

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...