Name: using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae at JoVE.com

Wir danken ihnen für die Finanzierung durch LSTM und IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (PhD studentship to BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship to LG: 215894/Z/19/Z), die die Gal4UAS-Analyse in die Vorschläge aufgenommen haben.

1. Planung und Konstruktion von UAS-Konstrukten
<ol><li>Design und Montage von Vektoren für die Kandidaten-Genexpression
	<ol>
<li>Bestimmen Sie die Sequenz, die für die Hochregulierung von Kandidatengenen verwendet werden soll.<ol>
<li>Sequenzieren Sie die cDNA/gDNA aus dem interessierenden Stamm und vergleichen Sie sie mit der veröffentlichten Sequenz, um ihre Identität zu überprüfen und potenzielle SNPs und Einschränkungsstellen für diagnostische Digests zu identifizieren.</...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ELS. , (2012).</li><li>Edi, C. 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Das Verständnis der Mückengenfunktion ist entscheidend, um neue Ansätze zur Kontrolle von Anopheles und zur Beeinflussung der Malariaübertragung zu entwickeln. Das beschriebene GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges und leistungsfähiges System zur funktionellen Analyse von Kandidatengenen, und bisher haben wir das System verwendet, um die genetischen Grundlagen der Insektizidresistenz17 und der kutikulären Kohlenwasserstoffproduktion15,23 zu untersuchen sowie verschiedene Mückenzellpopulationen fluoresziere...

Das zweigliedrige GAL4-UAS-System ist das Arbeitspferd der funktionellen Charakterisierung von Genen im Insektenmodellorganismus Drosophila melanogaster1,2,3. Um das GAL4-UAS-System zu verwenden, werden transgene Treiberlinien, die den Hefetranskriptionsfaktor GAL4 unter Kontrolle einer regulatorischen Sequenz exprimieren, mit Responderlinien gekreuzt, die ein Gen von Interesse oder ein RNAi-Konstrukt (RNA Interference) tragen, das von einer von GAL4 erkannten Upstream Activation Sequence (UAS) gesteuert wird. Die Nachkommen dieses Kreuzes drücken das interessierende Transgen in einem raumzeitlichen Muster aus, das vom Promotor diktiert wird, der die GAL4-Expression kontrolliert (Abbildung 1). Phänotypen, die von Nachkommen von Driver-Responder-Kreuzungen gezeigt werden, können bewertet werden, um die Funktion von Kandidatengenen aufzuklären. Obwohl D. melanogaster verwendet wurde, um Gene aus anderen Organismen zu untersuchen4,5,6,7, wurde das GAL4-UAS-System nun für den Einsatz bei Insekten von medizinischer und landwirtschaftlicher Bedeutung angepasst, um eine direkte Analyse der interessierenden Arten zu ermöglichen 8,9,10,11,12,13,14.
Bei der afrikanischen Malariamücke Anopheles gambiae wurde das GAL4-UAS-System zunächst mittels Zelllinien-Co-Transfektion9 getestet. Mehrere Konstrukte wurden auf Effizienz in verschiedenen paarweisen Kombinationen untersucht und fanden heraus, dass 14 tandemly wiederholte UAS, ergänzt mit einem kleinen künstlichen Intron (UAS-14i), das breiteste Aktivierungspotenzial aufwiesen, wenn sie mit einem Panel von GAL4-Treibern verwendet wurden. Um die In-vivo-Funktionalität zu demonstrieren, wurden diese Konstrukte dann verwendet, um zwei separate transgene An. gambiae-Linien durch PiggyBac-Transformation8 zu erzeugen: eine Treiberlinie mit GAL4, die von einem Mitteldarm-spezifischen Promotor angetrieben wird, und eine Responder-Linie, die sowohl die Luciferase- als auch die eYFP-Gene (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) unter Regulation von UAS-Sequenzen enthält. Darmspezifische Luciferase-Aktivität und Fluoreszenz in den Nachkommen zeigten, dass das System in Anopheles effizient war. Seitdem wurden Treiberlinien erstellt, die Transgene in anderen Geweben exprimieren, die für die Vektorkapazität und insektizidresistenz wichtig sind, einschließlich Derozyten15 und Derhämozyten16, und in einem nahezu allgegenwärtigen Muster10. Zahlreiche UAS-Linien wurden auch erzeugt, um Gene zu untersuchen, von denen angenommen wird, dass sie an stoffwechsel- und sequestrierungsvermittelter Insektizidresistenz, kutikulärer Kohlenwasserstoffsynthese beteiligt sind, und um verschiedene Zell- und Gewebetypen fluoreszierend zu markieren (Tabelle 1). Für die Responder-Linien wird nun die ortsgerichtete Integration des Transgens durch ΦC31 katalysierten Rekombinationskassettenaustausch17,18 durchgeführt, um den genomischen Kontext der UAS-regulierten Gene zu fixieren. Auf diese Weise wird die Transgenexpression in Bezug auf die position der genomischen Insertion normalisiert, was einen genaueren Vergleich der phänotypischen Effekte verschiedener Kandidatengene ermöglicht.
Die bisher erstellten Responder-Linien sind so konzipiert, dass sie das Transgen entweder in erhöhten Konzentrationen exprimieren oder die Genexpression durch RNA-Interferenz (RNAi) reduzieren. Normalerweise werden cDNA-Klone mit der UAS-Sequenz fusioniert, um geeignete Expressionsplasmide zu erzeugen, aber auch vollständige genomische Sequenzen sind möglich, vorausgesetzt, sie sind nicht zu groß für das Klonen. Um Silencing-Konstrukte zu erzeugen, haben wir drei verschiedene Methoden verwendet, um geeignete tandeminvertierte Sequenzen zu erhalten, die Hairpin dsRNA bilden, die RNAi stimuliert. Dazu gehörten Fusions-PCR, asymmetrische PCR und kommerzielle Synthese von Haarnadelkonstrukten. Allen Methoden gemeinsam ist die Aufnahme einer Intronsequenz zwischen die invertierten Sequenzen, um die Klonstabilität zu gewährleisten. Es wurden Responder-Plasmide entwickelt, in die ein Gen von Interesse/RNAi-Konstrukt eingefügt werden kann15. Diese Plasmide tragen auch die erforderlichen ΦC31 attB-Stellen für RMCE (beschrieben in Adolfi begleitendem JoVE-Papier, das die RCME-Technik im Detail beschreibt). Protokolle, die die wichtigen Schritte abdecken, die bei der Auswahl der Sequenz für die Insertion in eines dieser Plasmide zur Überexpression erforderlich sind, sind in diesem Manuskript enthalten. Zusätzlich werden zwei Protokolle für die Erstellung von RNAi-Haarnadelkonstrukten beschrieben und veranschaulicht.
Bei der Schaffung neuer Linien ist die Identifizierung seltener transgener Individuen entscheidend für die Zucht, um transgene Kolonien zu etablieren und zu erhalten. Am wichtigsten für das GAL4-UAS-System ist, dass die Responder- und Treiberlinien unterschieden werden müssen, um Kreuze zu ermitteln und einzelne Nachkommen zu identifizieren, die beide Transgene tragen. Dies wird durch die Verwendung verschiedener dominanter selektorierbarer Markergene erreicht, die mit den Treiber- und Responder-Kassetten verknüpft sind. Am häufigsten handelt es sich dabei um fluoreszierende Markergene, die durch optische Filter (z.B. eYFP, eCFP, dsRed) deutlich unterscheidbar sind. Es ist wichtig, dass Marker in einem bekannten und zuverlässigen raumzeitlichen Muster ausgedrückt werden, da dies die Identifizierung von Anomalien und Kontaminationen erleichtert. Die Expression des fluoreszierenden Markergens wird routinemäßig durch den synthetischen 3xP3-Promotor reguliert, der in allen Stadien der Entwicklung von An. gambiae eine augen- und ventrale Ganglien-spezifische Expression verursacht19. Fluoreszierende Marker, die von 3xP3 kontrolliert werden, sind in allen in diesem Artikel beschriebenen Transformationsplasmiden enthalten. Ein Protokoll, das die gängigen Methoden zum Screening von fluoreszierenden An. gambiae Puppen GAL4-UAS-Linien beschreibt, ist hier enthalten.
Eines der Schlüsselelemente des GAL4-UAS-Systems ist die Notwendigkeit, die differentiell markierten Treiber- und Responder-Linien zu überqueren. Um dies zu tun, müssen Männchen und Weibchen aus jeder Linie vor der Paarung getrennt werden. Erwachsene sind durch das Sehen leicht unterscheidbar, aber für die Feststellung genetischer Kreuzungen ist es sinnvoll, die Geschlechter vor dem Auftauchen des Erwachsenen zu trennen, um sicherzustellen, dass keine Paarung stattgefunden hat. Der allgemeine Größenunterschied zwischen männlichen und weiblichen An. gambiae-Puppen ist zu variabel, um eine effiziente und zuverlässige Methode der Geschlechtsbestimmung zu sein20. Stattdessen liefern deutliche morphologische Unterschiede in den äußeren Genitalien eine verlässliche Grundlage für das Sexing bei An. gambiae. In diesem Artikel beschreiben wir eine zuverlässige Methode zum Sexing von An. gambiae Puppen, um geeignete Kreuzungen aufzustellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg"> Abbildung 1 - Schematische Darstellung des Prozesses zur Verwendung des zweigliedrigen GAL4-UAS-Systems in Anopheles gambiae. (A) Die Hauptkomponenten eines Beispielvektors (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) werden dargestellt, wobei die verfügbaren Restriktionsstellen (EcoRI, NheI, XhoI und NcoI) innerhalb der multiplen Klonierungsstellen aufgeführt sind, die für die Verwendung geeignet sind, das Haarnadelkonstrukt oder die kodierende Sequenz für das interessierende Gen einzufügen. Der Aufbau der Andocklinie ist ebenfalls dargestellt. (B) Der Kreuzungsschritt ist dargestellt und zeigt die Verwendung von Männchen aus der Fahrerlinie (mit GAL4-Fahrer durch einen Promoter von Interesse und eCFP, der vom 3xP3-Promoter gesteuert wird) und Weibchen aus der Responder-Linie (mit dem von einem UAS-Promotor kontrollierten Gen oder Haarnadelkonstrukt und einem eYFP-Marker, der vom 3xP3-Promotor kontrolliert wird). (C) Eine schematische Darstellung der GAL4-treibenden Expression des Gens, das für die Nachkommen des Kreuzes von Interesse ist, in B und eine Liste einiger der typischen Phänotypen, die bewertet werden. Abkürzungen: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase mediated cassette exchange (RMCE), Upstream Activator Sequence (UAS), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), enhanced cyan fluorescent protein (eCFP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Es ist die Verwendung von Kreuzen, die die zweigliedrige Natur des GAL4-UAS-Systems bietet, die gegenüber lineareren Ansätzen deutliche Vorteile bietet. Beispielsweise können viel mehr Kombinationen von Treiber- und Responder-Linien bewertet werden, als es möglich wäre, wenn für jede Promotor-Gen-Kombination eine neue transgene Linie erzeugt und aufrechterhalten werden müsste. Noch wichtiger ist, dass es die Analyse von Genen ermöglicht, die tödliche oder sterile Phänotypen produzieren, wenn ihre Expression gestört ist, die in einem linearen System schwer zu erzeugen / aufrechtzuerhalten sind. Solche tödlichen Phänotypen können sich in allen Entwicklungsstadien manifestieren, abhängig von der Genfunktion und der raumzeitlichen Expression, werden aber am häufigsten während der Embryonalentwicklung beobachtet. Die Visualisierung der Entwicklung von Mückenembryonen erfordert die Reinigung des undurchsichtigen Chorions, das die Eier bedeckt. Nach Methoden, die in Trpiš (1970) 21 und Kaiser et al. (2014) 22 beschrieben sind, beschreiben wir die Protokolle, die wir verwenden, um Embryonen unter Beibehaltung der strukturellen Integrität zu fixieren, und Bleichen, um die Endochorion zu beseitigen, die eine mikroskopische Visualisierung und Bildgebung ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm plastic Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td>2175546</td>
			<td>Pack of 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Gilson Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/25 mL Universal Tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1412-3020</td>
			<td>Pack of 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur Pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>G612398</td>
			<td>Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11512303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>SLS</td>
			<td>45726-1L-F</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E6099</td>
			<td>30x30x30 with screen port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Paint Brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>UKDPB66</td>
			<td>KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Aspirator</td>
			<td>John Hock</td>
			<td>612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond Salt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupae Pots</td>
			<td>Cater4you</td>
			<td>SP8OZ</td>
			<td>250 pots with lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plastic Buckets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25552</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae

Das zweigliedrige GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges und leistungsfähiges Werkzeug für die funktionelle genetische Analyse. Das Wesen des Systems besteht darin, transgene "Treiber" -Linien zu kreuzen, die den Hefe-Transkriptionsfaktor GAL4 auf gewebespezifische Weise exprimieren, wobei transgene "Responder" -Linien ein Kandidatengen / RNA-Interferenzkonstrukt tragen, dessen Expression durch Upstream Activation Sequences (UAS) gesteuert wird, die GAL4 binden. In den nachfolgenden Nachkommen wird das Gen oder Stummschaltungskonstrukt somit in einer vorgeschriebenen raumzeitlichen Weise exprimiert, so dass die resultierenden Phänotypen untersucht und die Genfunktion abgeleitet werden können. Das binäre System ermöglicht Flexibilität in experimentellen Ansätzen, um Phänotypen zu screenen, die durch transgene Expression in mehreren gewebespezifischen Mustern erzeugt werden, selbst wenn schwere Fitnesskosten induziert werden. Wir haben dieses System für Anopheles gambiae, den wichtigsten Malaria-Vektor in Afrika, angepasst.
In diesem Artikel stellen wir einige der gängigen Verfahren vor, die während der GAL4-UAS-Analyse verwendet werden. Wir beschreiben die bereits erzeugten GAL4-UAS-Linien von An. gambiae sowie das Klonen neuer Responder-Konstrukte für Upregulation und RNAi-Knockdown. Wir spezifizieren eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Geschlecht von Mückenpuppen, um genetische Kreuzungen zu etablieren, die auch das Screening von Nachkommen umfasst, um die Vererbung von fluoreszierenden Genmarkern zu verfolgen, die den Treiber und die Responder-Insertionen markieren. Wir stellen auch ein Protokoll zur Klärung von An. gambiae-Embryonen vor, um die Embryonalentwicklung zu untersuchen. Schließlich stellen wir mögliche Anpassungen der Methode zur Erzeugung von Treiberlinien durch CRISPR/Cas9-Insertion von GAL4 stromabwärts von Zielgenen vor.

Die 3xP3-Expression von eYFP, dsRed und eCFP ermöglicht eine zuverlässige, leicht unterscheidbare Identifizierung von Individuen, die die Markergene besitzen, die die Expression in Augen und ventralen Ganglien von An. gambiae puppen erzeugen (Abbildung 3). Die Differentielle Morphologie, die in männlichen und weiblichen äußeren Genitalien beobachtet wurde, die für die Geschlechtsbestimmung verwendet wurden, und ein Beispiel für eine nicht identifizierbare Puppe sind ...

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Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Das bipartite GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges Werkzeug zur Modifikation der Genexpression in kontrolliert raumzeitlicher Weise, das eine funktionelle genetische Analyse in Anopheles gambiae ermöglicht. Die beschriebenen Verfahren für die Verwendung dieses Systems sind eine semi-standardisierte Klonierungsstrategie, Sexing und Screening von Puppen auf fluoreszierende Proteinmarker und Embryofixierung.

Einsatz des GAL4-UAS-Systems für die funktionelle Genetik bei Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Das bipartite GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges Werkzeug für die funktionelle genetische Analyse in Anopheles gambiae durch genetische Veränderung der Genexpression in raumzeitlicher kontrollierter Weise. Das binäre System ermöglicht Flexibilität in experimentellen Ansätzen zur phänotypischen Charakterisierung der Transgenexpression, auch wenn schwere Fitnesskosten induziert werden. Dieses System kann zur phänotypischen Charakterisierung von Genen verwendet werden, die möglicherweise an der Insektizidresistenz, der Übertragung von Krankheitserregern oder solchen beteiligt sind, die in genetischen Kontrollmethoden eingesetzt werden.Fraser Coleman, ein Forschungstechniker, wird helfen, dieses Verfahren zu demonstrieren Beginnen Sie mit dem Sammeln von Puppen mit einem Drei-Milliliter-Pasteur-Pipett aus Kunststoff, bei dem das Ende auf eine klare flache Schüssel geschnitten wird, die für die Verwendung mit einem Stereomikroskop geeignet ist. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Wassers um die Puppen. Schalten Sie die Leuchtstofflampe ein und lassen Sie sie aufwärmen.Betrachten Sie die räumlich-zeitlichen Farbmuster eines Ausdrucks und eines Verhältnisses verschiedener Phänotypen, die beim Screening auf fluoreszierenden Marker erwartet werden. Wählen Sie den gewünschten Filter am Fluoreszenzsteroskop aus und prüfen Sie, ob ein farbiger Lichtstrahl sichtbar ist, der auf die Mitte der Bühnenplatte gerichtet ist. Zentrieren Sie unter weißem Licht die Puppen im Sichtfeld und bringen Sie sie in den Fokus.Schalten Sie das weiße Licht aus und verwenden Sie den Feinfokus, um den Bereich der Puppen, der den interessierenden Phänotyp mit einem sichtbaren fluoreszierenden Muster trägt, in den Fokus zu rücken. Verwenden Sie einen feinen Detailpinsel, um die Puppen vorsichtig zu drehen und die Analpaddel so zu bewegen, dass die äußeren Genitalien identifiziert werden können. Separate Puppen basierend auf markanten äußeren Genitalien.Männchen haben eine lange Röhre, die aus dem letzten rückenförmigen Segment etwa auf der Hälfte der Länge der Analpaddel extrudiert. Die äußeren Genitalien der weiblichen Puppen sind wesentlich kürzer und verzweigen sich. Trennen Sie die geschlechtsspezifischen Puppen in Gruppen von 10 oder weniger in klaren 20-Milliliter-Röhren mit Wasser und versiegeln Sie die Röhren mit einem Wattebausch.Aspirieren Sie die gewünschte Anzahl von männlichen und weiblichen Erwachsenen aus den Schläuchen in einen Käfig oder einen kleinen Eimer und achten Sie darauf, die Erwachsenen während dieses Transfers nicht zu beschädigen. Halten Sie das Kreuz fünf bis sieben Tage vor der Blutfütterung aufrecht. Am folgenden Tag können Eier gesammelt werden, um die Embryonalentwicklung zu untersuchen.Bauen Sie die Eiablagekammer zusammen und führen Sie vorsichtig 10 bis 15 blutverspeiste Weibchen hinein. Decken Sie die Eiablagekammer ab und lassen Sie sie 20 Minuten einwirken. Lösen Sie das 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen vorsichtig vom Eiablagetopf und achten Sie darauf, dass die Moskitos nicht freigesetzt werden.Decken Sie den Topf ab und lassen Sie die Eier bis zum Entwicklungsstadium von Interesse reifen. Heben Sie Eier mit einem feinen Detailpinsel aus dem Topf auf und legen Sie sie auf Wasser in einen 40 Quadratmeter großen ausgegrabenen Glasblock. Entfernen Sie vorsichtig das Wasser mit einer Mikropipette aus dem Glasblock und decken Sie die Eier in 500 Mikroliter FAA ab.Schwingen Sie sanft auf orbital shaker bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Spülen Sie die Eier 15 Mal gründlich mit destilliertem Wasser ab, um alle Spuren der FAA-Lösung zu entfernen. Mit einer 1000-Mikroliter-Mikropipette einen Milliliter destilliertes Wasser nach dem anderen hinzufügen und dann entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass die Eier dabei nicht beschädigt werden.Die fixierten Eier mit einem Milliliter Trpis-Lösung bedecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Eier beginnen nach fünf Minuten Inkubation blasse Flecken zu entwickeln und erreichen schließlich eine milchig-weiße Farbe, sobald sie geklärt sind. Spülen Sie die Eier 15 Mal gründlich mit destilliertem Wasser ab, um alle Spuren von Trpis-Lösung zu entfernen.Die Expression von fluoreszierenden Markern, die vom 3xP3-Promotor angetrieben werden, wird in den Augen und ventralen Ganglien von Anopheles gambiae Puppen beobachtet. Die Verwendung verschiedenfarbiger Fluoreszenzmarker ermöglicht die Auswahl und das Screening von modifizierten Individuen, die verschiedene GAL4- und UAS-Komponenten tragen. Bei der Arbeit mit einem bipartiten GAL4-UAS-System ist es notwendig, Männchen und Weibchen aus verschiedenen Stämmen zu kreuzen, um Nachkommen zu erwerben, die sowohl die GAL4- als auch die UAS-Komponente tragen.Die Differentielle Morphologie, die im männlichen und weiblichen äußeren Genital von Puppen beobachtet wird, wird für das Sexing verwendet. Ein Beispiel für eine nicht identifizierbare Puppe wird hier hervorgehoben. Die Entfernung des gesamten Wassers aus Puppen, wie auf der rechten Seite gezeigt, erhöht die Sexing-Schwierigkeit, da Analpaddel die Visualisierung von Genitalien verdecken.Das zweigliedrige GAL4-UAS-System erlaubt die Modifikation der Genexpression auf kontrollierte raumzeitliche Weise. Dies kann visualisiert werden, indem die Oenozyten- und ubiquitären GAL4-Vier-Exprimationstreiberlinien mit der Responder-Linie UAS-mCherry überquert werden. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung eines bipartiten GAL4-UAS-Systems ist die einfache Untersuchung tödlicher Phänotypen bereits im Embryonalstadium.Um dies zu tun, ist es notwendig, die innere Morphologie der Embryonen zu visualisieren. Die normalen morphologischen Merkmale, die in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung 12, 24 und 36 Stunden nach dem Legen beobachtet wurden, können nach Abschluss des Embryo-Clearing-Protokolls beobachtet werden. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Puppen und Eier nicht austrocknen dürfen.Daher ist es wichtig, beim Entfernen von Flüssigkeiten schnell zu arbeiten. Die GAL4-UAS-Methode hat es uns ermöglicht, Gene, die an der Insektizidresistenz beteiligt sind, und solche mit potenziellen Anwendungen in Gene-Drive-Kontrollmethoden funktionell zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

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Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

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Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

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