Name: using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae at JoVE.com

Vi anerkjenner takknemlig finansiering fra LSTM og IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (PhD studentship til BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship til LG: 215894/Z/19/Z) som har innlemmet Gal4UAS-analyse i forslagene.

1. Design og bygging av UAS-konstruksjoner
<ol><li>Design og montering av vektorer for kandidatgenuttrykk
	<ol>
<li>Bestem sekvensen som skal brukes til kandidatgenregulering.<ol>
<li>Sekvenser cDNA/gDNA fra interessestammen og sammenlign den med den publiserte sekvensen for å bekrefte identiteten og identifisere potensielle SNPer og begrensningssteder for diagnostisk sammendrag.</li>
			<li>Forsikre deg om at den fremre primeren som brukes til genforsterkning dekker den innfødte Koz...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ELS. , (2012).</li><li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genetics. 10 (3), 1004236 (2014).</li><li>Daborn, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+validate+metabolism-based+insecticide+resistance+from+insect+pests.">Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).</li><li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcription+and+functional+analyses+reveal+heterogeneous+molecular+mechanisms+driving+pyrethroids+resistance+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+funestus+across+Africa.">Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa.</a> Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).</li><li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+the+GSTe2+gene+allows+tracking+of+metabolically+based+insecticide+resistance+in+a+major+malaria+vector.">A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector.</a> Genome Biology. 15 (2), (2014).</li><li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Bi-Partite+Gal4-UAS+System+in+the+African+Malaria+Mosquito,+Anopheles+gambiae.">Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31552 (2012).</li><li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Gal4-UAS+system+in+an+Anopheles+gambiae+cell+line.">Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line.</a> Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).</li><li>Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-tissue+GAL4-mediated+gene+expression+in+all+Anopheles+gambiae+life+stages+using+an+endogenous+polyubiquitin+promoter.">Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).</li><li>Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+the+transgenic+Aedes+aegypti+using+the+binary+Gal4-UAS+system.">Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).</li><li>O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4-based+Enhancer-Trapping+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi.">Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi.</a> Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Gut-Specific+Carboxypeptidase:+A+Study+Using+the+Binary+Gal4/UAS+System+in+the+Mosquito+Aedes+Aegypti.">Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).</li><li>Imamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+Using+the+GAL4/UAS+System+in+the+Silkworm+Bombyx+mori.">Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori.</a> Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).</li><li>Lynd, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+genetic+tool+for+Anopheles+gambiae+oenocyte+characterisation:+application+to+cuticular+hydrocarbon+synthesis.">Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocyte-targeted+gene+expression+in+the+female+malaria+mosquito+using+the+hemolectin+promoter+from+Drosophila.">Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+validation+of+key+genes+conferring+insecticide+resistance+in+the+major+African+malaria+vector,+Anopheles+gambiae.">Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).</li><li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+integrase-mediated+site-specific+germline+transformation+of+Anopheles+gambiae.">Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).</li><li>Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+transformation+markers+for+insect+transgenesis.">Fluorescent transformation markers for insect transgenesis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).</li><li>Clements, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. 1, (1992).</li><li>Trpi&#353;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bleaching+and+decalcifying+method+for+general+use+in+zoology.">A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology.</a> Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).</li><li>Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Development+and+Rates+of+Metabolic+Activity+in+Early+and+Late+Hatching+Eggs+of+the+Major+Malaria+Vector+Anopheles+gambiae.">Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114381 (2014).</li><li>Grigoraki, L., Grau-Bov&#233;, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptomic+analysis+of+Anopheles+gambiae+oenocytes+enables+the+delineation+of+hydrocarbon+biosynthesis.">Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis.</a> eLife. 9, 58019 (2020).</li><li>Xiao, Y. -. H., Yin, M. -. H., Hou, L., Pei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+amplification+of+intron-containing+hairpin+RNA+construct+from+genomic+DNA.">Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA.</a> BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).</li><li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Mapping+of+a+Sequence+on+the+Drosophila+melanogaster+X+and+Y+Chromosomes+That+Is+Transcribed+during+Spermatogenesis.">Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis.</a> Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).</li><li>MR4, CDC, NEI &amp; beiResources. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition. , (2015).</li><li>Sik Lee, Y., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+better+RNAi+vector+for+Drosophila:+use+of+intron+spacers.">Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers.</a> Methods. 30 (4), 322-329 (2003).</li><li>Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R., Peccoud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Synthesis: Methods and Protocols. , 97-110 (2012).</li><li>Cavener, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+consensus+sequence+flanking+translational+start+sites+in+Drosophila+and+vertebrates.">Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates.</a> Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).</li><li>Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2A+self-cleaving+peptide-based+multi-gene+expression+system+in+the+silkworm+Bombyx+mori.">2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature Communications. 5, 3977 (2014).</li><li>Kondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+organisation+of+the+Drosophila+Brain+Visualised+by+Endogenously+Tagged+Neurotransmitter+Receptors.">Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors.</a> Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).</li><li>Lee, P. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-specific+T2A-GAL4+library+for+Drosophila.">A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila.</a> eLife. 7, 35574 (2018).</li><li>Marois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sorting+of+mosquito+larvae+for+laboratory+studies+and+for+future+vector+control+interventions.">High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions.</a> Malaria Journal. 11, 302 (2012).</li><li>Crawford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+male+Wolbachia-infected+Aedes+aegypti+mosquitoes+enables+large-scale+suppression+of+wild+populations.">Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations.</a> Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).</li><li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).</li><li>Rezende, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+desiccation+resistance+in+Aedes+aegypti:+presumptive+role+of+the+chitinized+Serosal+Cuticle.">Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle.</a> BMC Developmental Biology. 8 (1), 82 (2008).</li><li>Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serosal+cuticle+formation+and+distinct+degrees+of+desiccation+resistance+in+embryos+of+the+mosquito+vectors+Aedes+aegypti,+Anopheles+aquasalis+and+Culex+quinquefasciatus.">Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus.</a> Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-canonical+Notch+signaling+is+essential+for+the+control+of+fertility+in+Aedes+aegypti.">The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307 (2018).</li><li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+of+Protein+Expression+during+Aedes+aegypti+Development.">Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development.</a> Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+in+situ+of+Salivary+Glands,+Ovaries+and+Embryos+of+Vector+Mosquitoes.">Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3709 (2012).</li></ol>

Forståelse av mygggenfunksjon er viktig for å utvikle nye tilnærminger for å kontrollere Anopheles og påvirke malariaoverføring. GAL4-UAS-systemet som er beskrevet er et allsidig og kraftig system for funksjonell analyse av kandidatgener, og til dags dato har vi brukt systemet til å undersøke det genetiske grunnlaget for insektmiddelresistens17 og cuticular hydrokarbonproduksjon15,23, samt å fluorescerende merke forskjellige</s...

Det todelte GAL4-UAS-systemet er arbeidshesten for funksjonell karakterisering av gener i insektmodellorganismen Drosophila melanogaster1,2,3. For å bruke GAL4-UAS-systemet krysses transgene driverlinjer, som uttrykker gjærtranskripsjonsfaktoren GAL4 under kontroll av en regulatorisk sekvens, med responderlinjer som bærer et gen av interesse eller RNA-interferens (RNAi) konstruert av en oppstrøms aktiveringssekvens (UAS) anerkjent av GAL4. Avkommet til dette korset uttrykker transgene av interesse for et romlig mønster diktert av promotoren som kontrollerer GAL4-uttrykket (figur 1). Fenotyper som vises ved avkom av fører-responder kryss kan vurderes for å belyse funksjonen til kandidatgener. Selv om D. melanogaster har blitt brukt til å undersøke gener fra andre organismer4,5,6,7, har GAL4-UAS-systemet nå blitt tilpasset for bruk i insekter av medisinsk og landbruksmessig betydning for å gi direkte analyse i arten av interesse 8,9,10,11,12,13,14.
I den afrikanske malariamyggen, Anopheles gambiae, ble GAL4-UAS-systemet først testet av cellelinje co-transfection9. Flere konstruksjoner ble analysert for effektivitet i forskjellige parvise kombinasjoner og fant at 14 tandemly gjentatte UAS supplert med en liten kunstig intron (UAS-14i) viste det bredeste spekteret av aktiveringspotensial når de ble brukt med et panel av GAL4-drivere. For å demonstrere in vivo-funksjonalitet ble disse konstruksjonene deretter brukt til å lage to separate transgene An. gambiae linjer av PiggyBac transformasjon8: en driverlinje som bærer GAL4 drevet av en midgutspesifikk promotor, og en responderlinje som inneholder både luciferase og forbedrede gule fluorescerende protein (eYFP) gener under regulering av UAS-sekvenser. Tarmspesifikk luciferaseaktivitet og fluorescens i avkom indikerte at systemet var effektivt i Anopheles. Siden da har driverlinjer blitt opprettet som uttrykker transgenes i andre vev som er viktige for vektorkapasitet og insektmiddelresistens, inkludert oenocytter15 og hemocytter16, og i et nær allestedsnærværende mønster10. Tallrike UAS-linjer har også blitt generert til analysegener som antas å være involvert i metabolisme og fangstmediert insektmiddelresistens, kutikulær hydrokarbonsyntese og fluorescerende merke forskjellige celle- og vevstyper (tabell 1). For responderlinjene utføres nå stedsstyrt integrasjon av transgene av ΦC31 katalysert rekombinasjonskassettutveksling17,18 for å fikse den genomiske konteksten til de UAS-regulerte genene. På denne måten normaliseres transgene uttrykk når det gjelder genomisk innsettingsplassering, noe som gir en mer nøyaktig sammenligning av fenotypiske effekter av forskjellige kandidatgener.
Responderlinjene som er opprettet til dags dato, er utformet for enten å uttrykke transgene enten på forhøyede nivåer eller for å redusere genuttrykk gjennom RNA-interferens (RNAi). Vanligvis er cDNA-kloner smeltet sammen til UAS-sekvensen for å generere passende uttrykksplasmider, men fulle genomiske sekvenser er også mulig forutsatt at de ikke er for store for kloning. For å generere silencing konstruksjoner, har vi brukt tre forskjellige metoder for å oppnå passende tandem inverterte sekvenser som danner hårnål dsRNA som stimulerer RNAi. Disse har inkludert fusjon PCR, asymmetrisk PCR og kommersiell syntese av hårnål konstruksjoner. Felles for hver metode er inkludering av en intronsekvens mellom de inverterte sekvensene for å gi kloningsstabilitet. Responder plasmider der et gen av interesse / RNAi konstruksjon kan settes inn er utviklet15. Disse plasmidene har også de nødvendige ΦC31 attB-stedene for RMCE (beskrevet i Adolfi medfølgende JoVE-papir som beskriver RCME-teknikken i detalj). Protokoller som dekker de viktige trinnene som kreves når du velger sekvensen for innsetting i en av disse plasmidene for overtrykk, er inkludert i dette manuskriptet. I tillegg beskrives og illustreres to protokoller for RNAi hårnålkonstruksjonsoppretting.
Når du oppretter nye linjer, er identifisering av sjeldne transgene individer avgjørende å avle fra for å etablere og opprettholde transgene kolonier. Viktigst for GAL4-UAS-systemet er det en nødvendighet å skille mellom responder- og driverlinjene for å etablere kryss og identifisere individuelle avkom som bærer begge transgenes. Dette oppnås ved å bruke forskjellige dominerende valgbare markørgener knyttet til driver- og responderkassettene. Vanligvis er dette fluorescerende markørgener som er tydelig skille ved hjelp av optiske filtre (f.eks. eYFP, eCFP, dsRed). Det er viktig at markører uttrykkes i et kjent og pålitelig romlig mønster, da dette gjør identifisering av abnormiteter og forurensning enklere. Fluorescerende markørgenuttrykk reguleres rutinemessig av den syntetiske 3xP3-promotoren , noe som forårsaker øye- og ventral ganglia-spesifikt uttrykk i alle stadier av An. gambiae utvikling19. Fluorescerende markører kontrollert av 3xP3 er inkludert i alle transformasjonsplasmider beskrevet i denne artikkelen. En protokoll som beskriver de vanlige metodene som brukes til å screene fluorescerende An. gambiae pupae GAL4-UAS linjer er inkludert her.
Et av nøkkelelementene i GAL4-UAS-systemet er nødvendigheten av å krysse de differensialmerkede driver- og responderlinjene. For å gjøre dette må mann og kvinner fra hver linje skilles før parring. Voksne er lett å skille fra syne, men for å etablere genetiske kryss er det fornuftig å skille kjønnene før voksen fremvekst for å sikre at parring ikke har skjedd. Den generelle størrelsesforskjellen mellom mann og kvinne An. gambiae pupper er for variabel til å være en effektiv og pålitelig metode for kjønnsbestemmelse20. I stedet gir klare morfologiske forskjeller i de ytre kjønnsorganene et pålitelig grunnlag for sexing i An. gambiae. I denne artikkelen beskriver vi en pålitelig metode for sexing An. gambiae pupper for å sette opp passende kryss.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg"> Figur 1 – Diagrammatisk fremstilling av prosessen for bruk av det todelte GAL4-UAS-systemet i Anopheles gambiae. (A) Hovedkomponentene i en eksempelvektor (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) er avbildet, med detaljer om tilgjengelige begrensningssteder (EcoRI, NheI, XhoI og NcoI) innenfor de mange kloningsstedene som er egnet for bruk til å sette inn hårnålkonstruksjonen eller kodesekvensen for genet av interesse. Strukturen på forankringslinjen er også avbildet. (B) Kryssingstrinnet er illustrert som indikerer bruk av menn fra førerlinjen (bærer GAL4-driver av en arrangør av interesse og eCFP drevet av 3xP3-promotoren) og kvinner fra responderlinjen (bærer genet av interesse eller hårnålkonstruksjon kontrollert av en UAS-promotor og en eYFP-markør kontrollert av 3xP3-promotoren). (C) En diagrammatisk representasjon av GAL4 kjøreuttrykk av genet av interesse for korsets avkom i B og en liste over noen av de typiske fenotypene som vurderes. Forkortelser: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase mediert kassettutveksling (RMCE), Oppstrøms Activator Sequence (UAS), forbedret gult fluorescerende protein (eYFP), forbedret cyan fluorescerende protein (eCFP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> 
Det er bruken av kryss som gir den todelte naturen til GAL4-UAS-systemet, som har klare fordeler i forhold til mer lineære tilnærminger. For eksempel kan mange flere kombinasjoner av fører- og responderlinjer vurderes enn det som ville være mulig hvis en ny transgen linje måtte genereres og vedlikeholdes for hver promotor / genkombinasjon. Enda viktigere er at det tillater analyse av gener som produserer dødelige eller sterile fenotyper når deres uttrykk er forskrekket som er vanskelig å skape / vedlikeholde i et lineært system. Slike dødelige fenotyper kan manifestere seg i alle utviklingsstadier, avhengig av genfunksjonen og romlige uttrykk, men observeres oftest under embryonal utvikling. Visualisering av myggembryoutvikling krever rydding av den ugjennomsiktige korionen som dekker eggene. Følgende metoder beskrevet i Trpiš (1970)21 og Kaiser et al. (2014)22, beskriver vi protokollene vi bruker for å fikse embryoer, samtidig som vi opprettholder strukturell integritet, og bleking for å fjerne endokorionen som tillater mikroskopisk visualisering og avbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm plastic Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td>2175546</td>
			<td>Pack of 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Gilson Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/25 mL Universal Tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1412-3020</td>
			<td>Pack of 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur Pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>G612398</td>
			<td>Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11512303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>SLS</td>
			<td>45726-1L-F</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E6099</td>
			<td>30x30x30 with screen port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Paint Brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>UKDPB66</td>
			<td>KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Aspirator</td>
			<td>John Hock</td>
			<td>612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond Salt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupae Pots</td>
			<td>Cater4you</td>
			<td>SP8OZ</td>
			<td>250 pots with lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plastic Buckets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25552</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae

Det todelte GAL4-UAS-systemet er et allsidig og kraftig verktøy for funksjonell genetisk analyse. Essensen av systemet er å krysse transgene 'driver' linjer som uttrykker gjær transkripsjon faktor GAL4 på en vevsspesifikk måte, med transgene 'responder' linjer bærer en kandidat gen / RNA interferens konstruksjon hvis uttrykk er kontrollert av Upstream Activation Sequences (UAS) som binder GAL4. I det påfølgende avkom uttrykkes gen- eller silencingkonstruksjonen på en foreskrevet romlig måte, slik at de resulterende fenotypene kan analysees og genfunksjonen utledes. Det binære systemet muliggjør fleksibilitet i eksperimentelle tilnærminger til skjermfenotyper generert av transgene uttrykk i flere vevsspesifikke mønstre, selv om alvorlige treningskostnader blir indusert. Vi har tilpasset dette systemet for Anopheles gambiae, den viktigste malariavektoren i Afrika.
I denne artikkelen tilbyr vi noen av de vanlige prosedyrene som brukes under GAL4-UAS-analyse. Vi beskriver An. gambiae GAL4-UAS linjer allerede generert, samt kloning av nye responder konstruksjoner for upregulation og RNAi knockdown. Vi spesifiserer en trinnvis guide for sexing av myggpupper for å etablere genetiske kryss, som også inkluderer screening avkom for å følge arv av fluorescerende genmarkører som merker driveren og responderinnsettinger. Vi presenterer også en protokoll for rydding av An. gambiae embryoer for å studere embryonal utvikling. Til slutt introduserer vi potensielle tilpasninger av metoden for å generere driverlinjer gjennom CRISPR / Cas9-innsetting av GAL4 nedstrøms målgener.

3xP3-uttrykk for eYFP, dsRed og eCFP gir pålitelig, lett gjenkjennelig identifikasjon av individer som har markørgenene som produserer uttrykk i øyne og ventral ganglia av An. gambiae pupper (figur 3). Differensialmorfologien som observeres i mannlige og kvinnelige ytre kjønnsorganer som brukes til sexing og et eksempel på en uidentifiserbar pupper, fremheves i figur 4. Fjerning av alt vann fra pupper øker sexing vanskeligheter som anal p...

Watch this Scientific Journal Video about Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae at JoVE.com

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Det todelte GAL4-UAS-systemet er et allsidig verktøy for modifikasjon av genuttrykk på en kontrollert romlig måte som tillater funksjonell genetisk analyse i Anopheles gambiae. Prosedyrene beskrevet for bruk av dette systemet er en semi-standardisert kloning strategi, sexing og screening av pupper for fluorescerende protein markører og embryo fiksering.

Bruke GAL4-UAS-systemet for funksjonell genetikk i Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Det todelte GAL4-UAS-systemet er et allsidig verktøy for funksjonell genetisk analyse i Anopheles gambiae gjennom genetisk modifikasjon av genuttrykk på en romlig kontrollert måte. Det binære systemet muliggjør fleksibilitet i eksperimentelle tilnærminger for fenotypisk karakterisering av transgene uttrykk selv om alvorlige kondisjonskostnader blir indusert. Dette systemet kan brukes til fenotypisk karakterisering av gener som potensielt er involvert i insektmiddelresistens, patogenoverføring eller de som har bruk i genetiske kontrollmetoder.Fraser Coleman, en forskningstekniker, vil bidra til å demonstrere denne prosedyren Begynn med å samle pupper ved hjelp av en tre milliliter plast Pasteur pipet med enden avskåret på en klar flat tallerken egnet for bruk med et stereomikroskop. Fjern forsiktig det meste av vannet rundt puppene. Slå på fluorescerende pære og la den varme opp.Vurder fargespatiotemporale mønstre av et uttrykk og forholdet mellom forskjellige fenotyper som forventes ved screening for fluorescerende markør. Velg det nødvendige filteret på fluorescensstereopet og kontroller at det er en farget lysstråle som er synlig som er rettet mot midten av sceneplaten. Under hvitt lys sentrerer du puppene i synsfeltet og bringer dem i fokus.Slå av det hvite lyset og bruk det fine fokuset for å få området av puppene som bærer fenotypen av interesse med et synlig fluorescerende mønster i fokus. Bruk en fin detaljmaling for å forsiktig snu puppene og flytte anal padler slik at de ytre kjønnsorganene kan identifiseres. Separat pupper basert på særegne ytre kjønnsorganer.Hannene har et langt rør som ekstruderer fra det endelige dorsalsegmentet omtrent halvparten av lengden på anal padler. De ytre kjønnsorganene til kvinnelige pupper er betydelig kortere og bifurcate. Del den kjønnede puppen i grupper på 10 eller mindre i klare 20 milliliter rør med vann, og forsegle rørene med en ball av bomullsull.Aspirer ønsket antall mannlige og kvinnelige voksne fra rørene inn i et bur eller en liten bøtte, pass på at du ikke skader de voksne under denne overføringen. Opprettholde korset i fem til syv dager før blodfôring. Påfølgende dag kan egg samles for å studere embryoutvikling.Monter oviposisjonskammeret og introduser forsiktig 10 til 15 blodmatede kvinner i den. Dekk oviposisjonskammeret og la det stå i 20 minutter. Løsne forsiktig 50 milliliter polypropylenrøret fra oviposisjonspotten, sørg for ikke å frigjøre myggene.Dekk potten og la egg modnes til utviklingsstadiet av interesse. Plukk opp egg fra potten ved hjelp av en fin detaljmaling og legg dem på vann i en 40-kvadrat millimeter utgravd glassblokk. Fjern forsiktig vannet fra glassblokken med en mikropipette og dekk egg i 500 mikroliter FAA.Oscillate forsiktig på orbital shaker ved romtemperatur i 30 minutter. Skyll eggene grundig 15 ganger med destillert vann for å fjerne alle spor av FAA-løsning. Bruk en mikropipette på 1000 mikroliter til å tilsette og fjern deretter en milliliter destillert vann om gangen, pass på at du ikke skader eggene mens du gjør det.Dekk de faste eggene med en milliliter Trpis-løsning og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Egg vil begynne å utvikle bleke flekker etter fem minutter med inkubasjon som til slutt når en melkehvit farge når den er ryddet. Skyll eggene grundig 15 ganger med destillert vann for å fjerne alle spor av Trpis-oppløsning.Uttrykket av fluorescerende markører drevet av 3xP3-promotoren observeres i øynene og ventral ganglia av Anopheles gambiae pupper. Ved hjelp av forskjellige fargede fluorescerende markører tillater valg og screening av modifiserte personer som bærer forskjellige GAL4- og UAS-komponenter. Når du arbeider med et todelt GAL4-UAS-system, er det nødvendig å krysse menn og kvinner fra forskjellige stammer for å skaffe avkom som bærer både GAL4- og UAS-komponentene.Differensialmorfologien som observeres i mannlige og kvinnelige ytre kjønnsorganer av pupper, brukes til sexing. Et eksempel på en uidentifiserbar pupper er fremhevet her. Fjerning av alt vann fra pupper, som vist til høyre, øker sexing vanskeligheter som anal padler uklar visualisering av kjønnsorganer.Det todelte GAL4-UAS-systemet tillater modifikasjon av genuttrykk på en kontrollert romlig måte. Dette kan visualiseres ved å krysse oenocytten og allestedsnærværende GAL4 fire uttrykkende driverlinjer med responderlinjen UAS-mCherry. En viktig fordel med å bruke et bipartit gal4-UAS-system er den enkle å studere dødelige fenotyper selv på embryonalt stadium.For å gjøre dette er det nødvendig å visualisere embryoenes indre morfologi. De normale morfologiske egenskapene som observeres i ulike stadier av embryonal utvikling ved 12, 24 og 36 timer etter legging, kan ses etter ferdigstillelse av embryoryddingsprotokollen. Det er viktig gjennom hele denne prosedyren at pupper og egg ikke får lov til å desiccate.Derfor er det viktig å jobbe raskt når du fjerner væsker. GAL4-UAS-metoden har gjort det mulig for oss å karakterisere gener som er involvert i insektmiddelresistens og de med potensiell bruk i gendriftskontrollmetoder.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse av Ambient Svevestøv-indusert kromosomavvik ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering av MicroRNA ved hjelp av rekombinant Adeno-assosiert Virus Serotype 9 til å behandle Neuromuscular sykdommen i gnagere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Måle trening nivåer i Drosophila melanogaster bruke den roterende øvelse kvantifisering System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...