Name: using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae at JoVE.com

Мы с благодарностью отмечаем финансирование со стороны LSTM и IVCC (Адриана Адольфи), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (phD studentship to BCP:MR/P016197/1), Wellcome (sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship to LG: 215894/Z/Z/19/Z), которые включили анализ Gal4UAS в предложения.

1. Проектирование и строительство конструкций БАС
<ol><li>Проектирование и сборка векторов экспрессии генов-кандидатов
	<ol>
<li>Определите последовательность, которая будет использоваться для повышения регуляции генов-кандидатов.<ol>
<li>Секвенировать кДНК/гДНК с интересу?...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ELS. , (2012).</li><li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genetics. 10 (3), 1004236 (2014).</li><li>Daborn, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+validate+metabolism-based+insecticide+resistance+from+insect+pests.">Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).</li><li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcription+and+functional+analyses+reveal+heterogeneous+molecular+mechanisms+driving+pyrethroids+resistance+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+funestus+across+Africa.">Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa.</a> Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).</li><li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+the+GSTe2+gene+allows+tracking+of+metabolically+based+insecticide+resistance+in+a+major+malaria+vector.">A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector.</a> Genome Biology. 15 (2), (2014).</li><li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Bi-Partite+Gal4-UAS+System+in+the+African+Malaria+Mosquito,+Anopheles+gambiae.">Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 7 (2), 31552 (2012).</li><li>Lynd, A., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Gal4-UAS+system+in+an+Anopheles+gambiae+cell+line.">Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line.</a> Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).</li><li>Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-tissue+GAL4-mediated+gene+expression+in+all+Anopheles+gambiae+life+stages+using+an+endogenous+polyubiquitin+promoter.">Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).</li><li>Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+the+transgenic+Aedes+aegypti+using+the+binary+Gal4-UAS+system.">Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).</li><li>O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4-based+Enhancer-Trapping+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi.">Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi.</a> Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Gut-Specific+Carboxypeptidase:+A+Study+Using+the+Binary+Gal4/UAS+System+in+the+Mosquito+Aedes+Aegypti.">Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).</li><li>Imamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+Using+the+GAL4/UAS+System+in+the+Silkworm+Bombyx+mori.">Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori.</a> Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).</li><li>Lynd, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+genetic+tool+for+Anopheles+gambiae+oenocyte+characterisation:+application+to+cuticular+hydrocarbon+synthesis.">Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocyte-targeted+gene+expression+in+the+female+malaria+mosquito+using+the+hemolectin+promoter+from+Drosophila.">Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+validation+of+key+genes+conferring+insecticide+resistance+in+the+major+African+malaria+vector,+Anopheles+gambiae.">Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).</li><li>Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+integrase-mediated+site-specific+germline+transformation+of+Anopheles+gambiae.">Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).</li><li>Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+transformation+markers+for+insect+transgenesis.">Fluorescent transformation markers for insect transgenesis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).</li><li>Clements, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. 1, (1992).</li><li>Trpi&#353;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bleaching+and+decalcifying+method+for+general+use+in+zoology.">A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology.</a> Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).</li><li>Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Development+and+Rates+of+Metabolic+Activity+in+Early+and+Late+Hatching+Eggs+of+the+Major+Malaria+Vector+Anopheles+gambiae.">Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (12), 114381 (2014).</li><li>Grigoraki, L., Grau-Bov&#233;, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptomic+analysis+of+Anopheles+gambiae+oenocytes+enables+the+delineation+of+hydrocarbon+biosynthesis.">Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis.</a> eLife. 9, 58019 (2020).</li><li>Xiao, Y. -. H., Yin, M. -. H., Hou, L., Pei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+amplification+of+intron-containing+hairpin+RNA+construct+from+genomic+DNA.">Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA.</a> BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).</li><li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Mapping+of+a+Sequence+on+the+Drosophila+melanogaster+X+and+Y+Chromosomes+That+Is+Transcribed+during+Spermatogenesis.">Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis.</a> Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).</li><li>MR4, CDC, NEI &amp; beiResources. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition. , (2015).</li><li>Sik Lee, Y., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+better+RNAi+vector+for+Drosophila:+use+of+intron+spacers.">Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers.</a> Methods. 30 (4), 322-329 (2003).</li><li>Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R., Peccoud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Synthesis: Methods and Protocols. , 97-110 (2012).</li><li>Cavener, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+consensus+sequence+flanking+translational+start+sites+in+Drosophila+and+vertebrates.">Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates.</a> Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).</li><li>Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2A+self-cleaving+peptide-based+multi-gene+expression+system+in+the+silkworm+Bombyx+mori.">2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li><li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature Communications. 5, 3977 (2014).</li><li>Kondo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+organisation+of+the+Drosophila+Brain+Visualised+by+Endogenously+Tagged+Neurotransmitter+Receptors.">Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors.</a> Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).</li><li>Lee, P. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-specific+T2A-GAL4+library+for+Drosophila.">A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila.</a> eLife. 7, 35574 (2018).</li><li>Marois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sorting+of+mosquito+larvae+for+laboratory+studies+and+for+future+vector+control+interventions.">High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions.</a> Malaria Journal. 11, 302 (2012).</li><li>Crawford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+male+Wolbachia-infected+Aedes+aegypti+mosquitoes+enables+large-scale+suppression+of+wild+populations.">Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations.</a> Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).</li><li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo.">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).</li><li>Rezende, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+desiccation+resistance+in+Aedes+aegypti:+presumptive+role+of+the+chitinized+Serosal+Cuticle.">Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle.</a> BMC Developmental Biology. 8 (1), 82 (2008).</li><li>Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serosal+cuticle+formation+and+distinct+degrees+of+desiccation+resistance+in+embryos+of+the+mosquito+vectors+Aedes+aegypti,+Anopheles+aquasalis+and+Culex+quinquefasciatus.">Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus.</a> Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-canonical+Notch+signaling+is+essential+for+the+control+of+fertility+in+Aedes+aegypti.">The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307 (2018).</li><li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+of+Protein+Expression+during+Aedes+aegypti+Development.">Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development.</a> Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).</li><li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+in+situ+of+Salivary+Glands,+Ovaries+and+Embryos+of+Vector+Mosquitoes.">Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3709 (2012).</li></ol>

Понимание функции генов комаров имеет жизненно важное значение для разработки новых подходов к борьбе с Anopheles и воздействию на передачу малярии. Описанная система GAL4-UAS является универсальной и мощной системой для функционального анализа генов-кандидатов, и на сегодняшний день мы...

Двусторонняя система GAL4-UAS является рабочей лошадкой функциональной характеристики генов в модельном организме насекомых Drosophila melanogaster1,2,3. Для использования системы GAL4-UAS трансгенные линии драйвера, экспрессирующие фактор транскрипции дрожжей GAL4 под контролем регуляторной последовательности, пересекаются с ответными линиями, несущими интересующий ген или конструкцию РНК-интерференции (RNAi), контролируемую последовательностью активации (UAS), распознаваемой GAL4. Потомство этого креста выражает трансген интереса к пространственно-временному паттерну, продиктованному промотором, контролирующим экспрессию GAL4 (рисунок 1). Фенотипы, отображаемые потомством кроссов драйвер-ответчик, могут быть оценены для выяснения функции генов-кандидатов. Хотя D. melanogaster был использован для изучения генов других организмов4,5,6,7, система GAL4-UAS в настоящее время адаптирована для использования у насекомых медицинского и сельскохозяйственного значения для обеспечения прямого анализа на интересующих видах 8,9,10,11,12,13,14.
У африканского малярийного комара Anopheles gambiae система GAL4-UAS была впервые протестирована путем котрансфекции клеточной линии9. Несколько конструкций были проанализированы на эффективность в различных попарных комбинациях и обнаружили, что 14 тандемно повторяющихся БАС, дополненных небольшим искусственным интроном (UAS-14i), отображали самый широкий диапазон потенциала активации при использовании с панелью драйверов GAL4. Чтобы продемонстрировать функциональность in vivo, эти конструкции затем были использованы для создания двух отдельных трансгенных линий An. gambiae с помощью преобразования PiggyBac8: линии драйвера, несущей GAL4, управляемой специфическим промотором средней кишки, и линии ответчика, содержащей гены люциферазы и усиленного желтого флуоресцентного белка (eYFP) при регуляции последовательностей UAS. Специфическая активность люциферазы кишечника и флуоресценция в потомстве указывали на то, что система была эффективна у Anopheles. С тех пор были созданы драйверные линии, экспрессирующие трансгены в других тканях, важных для векторной емкости и устойчивости к инсектицидам, включая эноциты15 и гемоциты16, и в близкой к повсеместной схеме10. Также были созданы многочисленные линии БАС для анализа генов, которые, как считается, участвуют в метаболизме и секвестрации, опосредованной инсектицидной резистентности, синтезе кутикулярных углеводородов и флуоресцентной маркировке различных типов клеток и тканей (таблица 1). Для линий ответчика интеграция трансгена, направленная на сайт, теперь выполняется катализируемым рекомбинационным кассетным обменом ΦC31111,18 для фиксации геномного контекста генов, регулируемых БАС. Таким образом, экспрессия трансгенов нормализуется в отношении места геномной вставки, что позволяет более точно сравнивать фенотипические эффекты различных генов-кандидатов.
Линии ответчиков, созданные на сегодняшний день, предназначены либо для экспрессии трансгена либо на повышенных уровнях, либо для снижения экспрессии генов посредством РНК-интерференции (РНКи). Обычно клоны кДНК сплавляются с последовательностью БАС для генерации подходящих экспрессионных плазмид, однако полные геномные последовательности также возможны, если предположить, что они не слишком велики для клонирования. Для создания конструкций глушения мы использовали три различных метода для получения подходящих тандемных перевернутых последовательностей, которые образуют шпильку дцРНК, стимулирующую РНК. К ним относятся ПЦР слияния, асимметричная ПЦР и коммерческий синтез конструкций шпильки. Общим для каждого метода является включение интронной последовательности между инвертированными последовательностями для обеспечения стабильности клонирования. Были разработаны плазмиды ответчиков, в которые может быть вставлен интересующий ген/конструкция РНКI15. Эти плазмиды также несут необходимые участки ΦC31 attB для RMCE (описаны в статье Адольфи, сопровождающей JoVE, в которой подробно описывается метод RCME). Протоколы, охватывающие важные этапы, необходимые при выборе последовательности для вставки в одну из этих плазмид для сверхэкспрессии, включены в эту рукопись. Кроме того, описаны и проиллюстрированы два протокола для создания конструкции шпильки RNAi.
При создании новых линий идентификация редких трансгенных особей имеет решающее значение для размножения для создания и поддержания трансгенных колоний. Наиболее важным для системы GAL4-UAS является необходимость различать линии ответчика и водителя для установления пересечений и идентификации отдельных потомков, которые несут оба трансгена. Это достигается за счет использования различных доминантных выбираемых маркерных генов, связанных с кассетами драйвера и ответчика. Чаще всего это гены флуоресцентных маркеров, которые четко различимы с помощью оптических фильтров (например, eYFP, eCFP, dsRed). Важно, чтобы маркеры выражались в известной и надежной пространственно-временной картине, поскольку это облегчает идентификацию аномалий и загрязнения. Экспрессия гена флуоресцентного маркера обычно регулируется синтетическим промотором 3xP3, который вызывает специфическую экспрессию глазных и вентральных ганглиев на всех стадиях развития An. gambiae19. Флуоресцентные маркеры, контролируемые 3xP3, включены во все трансформационные плазмиды, описанные в этой статье. Здесь приведен протокол, подробно описывающий общие методы, используемые для скрининга флуоресцентных линий An. gambiae pupae GAL4-UAS.
Одним из ключевых элементов системы GAL4-UAS является необходимость пересечения дифференциально маркированных линий водителя и ответчика. Для этого самец и самки от каждой линии должны быть отделены перед спариванием. Взрослые особи легко различимы по зрению, однако для установления генетических скрещиваний разумно разделить полы до появления взрослых особей, чтобы гарантировать, что спаривание не произошло. Общая разница в размерах между самцами и самками куколок An. gambiae слишком изменчива, чтобы быть эффективным и надежным методом определения пола20. Вместо этого четкие морфологические различия в наружных гениталиях обеспечивают надежную основу для сексинга у An. gambiae. В этой статье мы опишем надежный метод сексинга Куколок An. gambiae для установки соответствующих крестов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg"> Рисунок 1 - Диаграммное представление процесса использования двусторонней системы GAL4-UAS в Anopheles gambiae. (A) Показаны основные компоненты примера вектора (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]), детализирующие имеющиеся участки ограничения (EcoRI, NheI, XhoI и NcoI) в нескольких участках клонирования, которые пригодны для использования для вставки конструкции шпильки или кодирующей последовательности для интересующего гена. Также изображено строение стыковочной линии. (B) Этап пересечения проиллюстрирован с указанием использования самцов из линии водителя (перевозка драйвера GAL4 заинтересованным промоутером и eCFP, управляемым промоутером 3xP3) и самок из линии ответчика (несущих ген интереса или шпильку, контролируемую промотором БАС и маркером eYFP, контролируемым промоутером 3xP3). (C) Диаграммное представление GAL4, стимулирующее экспрессию гена, представляющего интерес в потомстве креста в B, и список некоторых типичных фенотипов, которые оцениваются. Сокращения: Множественный клонирующий сайт (MCS), опосредованный рекомбиназой кассетный обмен (RMCE), Последовательность активаторов восходящего потока (UAS), улучшенный желтый флуоресцентный белок (eYFP), улучшенный голубой флуоресцентный белок (eCFP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Именно использование крестов обеспечивает двусторонний характер системы GAL4-UAS, которая имеет явные преимущества перед более линейными подходами. Например, можно оценить гораздо больше комбинаций линий драйвера и ответчика, чем было бы возможно, если бы для каждой комбинации промотор/ген была создана и поддерживалась новая трансгенная линия. Что еще более важно, он позволяет анализировать гены, которые производят смертельные или стерильные фенотипы, когда их экспрессия нарушена, которые трудно создать / поддерживать в линейной системе. Такие летальные фенотипы могут проявляться на всех стадиях развития, в зависимости от функции гена и пространственно-временной экспрессии, но чаще всего наблюдаются во время эмбрионального развития. Визуализация развития эмбриона комара требует очистки непрозрачного хориона, который покрывает яйца. Следуя методам, описанным в Trpiš (1970)21 и Kaiser et al. (2014)22, мы описываем протоколы, которые мы используем для фиксации эмбрионов, сохраняя при этом структурную целостность и отбеливание для очистки эндохориона, что позволяет микроскопическую визуализацию и визуализацию.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm plastic Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td>2175546</td>
			<td>Pack of 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Gilson Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/25 mL Universal Tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1412-3020</td>
			<td>Pack of 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur Pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>G612398</td>
			<td>Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11512303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>SLS</td>
			<td>45726-1L-F</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E6099</td>
			<td>30x30x30 with screen port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Paint Brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>UKDPB66</td>
			<td>KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Aspirator</td>
			<td>John Hock</td>
			<td>612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond Salt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupae Pots</td>
			<td>Cater4you</td>
			<td>SP8OZ</td>
			<td>250 pots with lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plastic Buckets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25552</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae

Двусторонняя система GAL4-UAS является универсальным и мощным инструментом для функционального генетического анализа. Суть системы заключается в пересечении трансгенных «драйверных» линий, которые экспрессируют фактор транскрипции дрожжей GAL4 тканевым специфическим образом, с трансгенными линиями «ответчика», несущими интерференционную конструкцию гена / РНК, экспрессия которой контролируется восходящими последовательностями активации (UAS), которые связывают GAL4. Таким образом, в последующем потомстве ген или глушительная конструкция экспрессируется предписанным пространственно-временным способом, что позволяет анализировать результирующие фенотипы и выводить функцию гена. Бинарная система обеспечивает гибкость в экспериментальных подходах к скринингу фенотипов, генерируемых экспрессией трансгенов в нескольких тканеспецифических паттернах, даже если вызваны серьезные затраты на приспособленность. Мы адаптировали эту систему для Anopheles gambiae, основного переносчика малярии в Африке.
В этой статье мы приводим некоторые из распространенных процедур, используемых при анализе GAL4-UAS. Мы описываем уже сгенерированные линии An. gambiae GAL4-UAS, а также клонирование новых конструкций ответчиков для повышения регуляции и нокдауна RNAi. Мы указываем пошаговое руководство по половому использованию кукол комаров для установления генетических скрещиваний, которое также включает скрининг потомства для отслеживания наследования флуоресцентных генных маркеров, которые помечают вставки водителя и ответчика. Мы также представляем протокол очистки эмбрионов An. gambiae для изучения эмбрионального развития. Наконец, мы вводим потенциальные адаптации метода для генерации линий драйверов посредством вставки CRISPR/Cas9 GAL4 после генов-мишеней.

Экспрессия 3xP3 eYFP, dsRed и eCFP обеспечивает надежную, легко различимую идентификацию лиц, обладающих маркерными генами, продуцирующими экспрессию в глазах и вентральных ганглиях куколок An. gambiae (рисунок 3). Дифференциальная морфология, наблюдаемая у мужских и женск?...

Watch this Scientific Journal Video about Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae at JoVE.com

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Двусторонняя система GAL4-UAS является универсальным инструментом для модификации экспрессии генов контролируемым пространственно-временным способом, который позволяет проводить функциональный генетический анализ в Anopheles gambiae. Процедуры, описанные для использования этой системы, представляют собой полустандартизированную стратегию клонирования, сексинг и скрининг куколок на флуоресцентные белковые маркеры и фиксацию эмбрионов.

Использование системы GAL4-UAS для функциональной генетики в Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Двусторонняя система GAL4-UAS является универсальным инструментом для функционального генетического анализа в Anopheles gambiae посредством генетической модификации экспрессии генов пространственно-временным контролируемым образом. Бинарная система обеспечивает гибкость экспериментальных подходов к фенотипической характеристике экспрессии трансгенов, даже если вызваны серьезные затраты на приспособленность. Эта система может быть использована для фенотипической характеристики генов, потенциально участвующих в резистентности к инсектицидам, передаче патогенов или тех, которые используются в методах генетического контроля.Фрейзер Коулман, техник-исследователь, поможет продемонстрировать эту процедуру Начните со сбора куколок с помощью трехмиллилитровой пластиковой пипетки Пастера с отрезанным концом на прозрачной плоской тарелке, подходящей для использования со стереомикроскопом. Осторожно удалите большую часть воды вокруг куколок. Включите люминесцентную лампу и дайте ей прогреться.Рассмотрим цветовые пространственно-временные паттерны выражения и соотношения различных фенотипов, которые ожидаются при скрининге на флуоресцентный маркер. Выберите необходимый фильтр на флуоресцентном стереоскопе и убедитесь, что виден цветной луч света, направленный в центр сценической пластины. Под белым светом центрируйте куколки в поле зрения и сосредоточьте их.Выключите белый свет и используйте тонкий фокус, чтобы сфокусировать область куколок, несущих интересующий фенотип с видимым флуоресцентным рисунком. Используйте кисть с мелкими деталями, чтобы аккуратно повернуть куколок и переместить анальные весла, чтобы можно было идентифицировать наружные гениталии. Отдельные куколки на основе отличительных наружных гениталий.Самцы имеют длинную трубку, которая выдавливается из конечного дорсального сегмента примерно половины длины анальных лопастей. Наружные половые органы самок куколок значительно короче и раздвоены. Разделите полых куколок на группы по 10 или менее в прозрачных 20-миллилитровых трубках с водой и запечатайте трубки клубком из ваты.Аспирируйте нужное количество взрослых самцов и самок из трубок в клетку или небольшое ведро, заботясь о том, чтобы не повредить взрослых во время этой передачи. Поддерживайте крест в течение пяти-семи дней перед кровоснабжением. На следующий день можно собирать яйцеклетки для изучения развития эмбриона.Соберите камеру яйцекладки и осторожно введите в нее от 10 до 15 кормленых кровью самок. Накройте камеру яйцекладки и оставьте на 20 минут. Осторожно отсоедините 50-миллилитровую полипропиленовую трубку от горшка с яйцекладкой, следя за тем, чтобы комары не выпустили.Накройте кастрюлю и дайте яйцам созреть до интересующей стадии развития. Соберите яйца из горшка, используя кисть с мелкими деталями, и поместите их на воду в выкопанный стеклянный блок площадью 40 квадратных миллиметров. Аккуратно извлеките воду из стеклянного блока с помощью микропипетки и накройте яйца 500 микролитрами FAA.Осторожно осциллируйте на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут. Тщательно промойте яйца 15 раз дистиллированной водой, чтобы удалить все следы раствора FAA. Используя 1000-микролитровый микропипетку, добавьте, а затем удалите один миллилитр дистиллированной воды за раз, заботясь о том, чтобы не повредить яйца при этом.Залейте неподвижные яйца одним миллилитром раствора Trpis и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Яйца начнут развивать бледные пятна после пяти минут инкубации, в конечном итоге достигнув молочно-белого цвета после очистки. Тщательно промойте яйца 15 раз дистиллированной водой, чтобы удалить все следы раствора Trpis.Экспрессия флуоресцентных маркеров, приводимых в действие промотором 3xP3, наблюдается в глазах и вентральных ганглиях куколок Anopheles gambiae. Использование различных цветных флуоресцентных маркеров позволяет выбирать и отсеивать модифицированных людей, несущих различные компоненты GAL4 и UAS. При работе с двусторонней системой GAL4-UAS необходимо скрещивать самцов и самок из разных штаммов для приобретения потомства, несущего как компоненты GAL4, так и UAS.Для сексинга используется дифференциальная морфология, наблюдаемая у мужских и женских наружных половых органов куколок. Здесь приведен пример неидентифицируемой куколки. Удаление всей воды из куколок, как показано справа, увеличивает сложность сексинга, так как анальные весла затемняют визуализацию гениталий.Двусторонняя система GAL4-UAS позволяет модифицировать экспрессию генов контролируемым пространственно-временным образом. Это можно визуализировать, скрещивая эноцит и вездесущие GAL4 четыре экспрессирующие линии драйвера с линией ответчика UAS-mCherry. Ключевым преимуществом использования двусторонней системы GAL4-UAS является легкость изучения летальных фенотипов даже на эмбриональной стадии.Для этого необходимо визуализировать внутреннюю морфологию эмбрионов. Нормальные морфологические характеристики, наблюдаемые на разных стадиях эмбрионального развития через 12, 24 и 36 часов после укладки, можно увидеть после завершения протокола очистки эмбриона. На протяжении всей этой процедуры жизненно важно, чтобы куколкам и яйцам не позволяли высыхать.Поэтому важно работать быстро при удалении жидкостей. Метод GAL4-UAS позволил нам функционально охарактеризовать гены, участвующие в резистентности к инсектицидам, и гены, которые потенциально используются в методах контроля генного драйва.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Анализ окружающей среды твердые частицы-индуцированных хромосомных аберраций Использование номера<em&gt; In Vitro</em&gt; система

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Системные поставки микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированный вирус серотипа 9 для лечения нервно-мышечных заболеваний у грызунов

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Измерение уровня осуществления в Drosophila melanogaster , с использованием системы количественной оценки вращающихся упражнения (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...