Name: using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae at JoVE.com

Agradecemos la financiación de LSTM e IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (PhD studentship to BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship to LG: 215894/Z/19/Z) que han incorporado el análisis Gal4UAS en las propuestas.

1. Diseño y construcción de construcciones de UAS
<ol><li>Diseño y montaje de vectores para la expresión génica candidata
	<ol>
<li>Determinar la secuencia que se utilizará para la regulación ascendente de genes candidatos.<ol>
<li>Secuenciar el ADNc/ADNc a partir de la cepa de interés y compararlo con la secuencia publicada para verificar su identidad e identificar posibles SNP y sitios de restricción para la digestión diagnóstica.</li>
			<li>Asegúrese de que el cebador d...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+drosophila:+A+fly+geneticist's+swiss+army+knife.">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ELS. , (2012).</li><li>Edi, C. 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Comprender la función genética de los mosquitos es vital para desarrollar nuevos enfoques para controlar Anopheles e impactar la transmisión de la malaria. El sistema GAL4-UAS descrito es un sistema versátil y potente para el análisis funcional de genes candidatos y hasta la fecha hemos utilizado el sistema para examinar las bases genéticas de la resistencia a insecticidas17 y la producción de hidrocarburos cuticulares15,23...

El sistema bipartito GAL4-UAS es el caballo de batalla de la caracterización funcional de genes en el organismo modelo de insectos Drosophila melanogaster1,2,3. Para utilizar el sistema GAL4-UAS, las líneas conductoras transgénicas, que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 bajo control de una secuencia reguladora, se cruzan con líneas de respuesta que llevan un gen de interés o construcción de interferencia de ARN (RNAi) controlada por una secuencia de activación ascendente (UAS) reconocida por GAL4. La progenie de este cruce expresa el transgén de interés en un patrón espaciotemporal dictado por el promotor que controla la expresión de GAL4 (Figura 1). Los fenotipos mostrados por la progenie de los cruces conductor-respondedor se pueden evaluar para dilucidar la función de los genes candidatos. Aunque D. melanogaster se ha utilizado para examinar genes de otros organismos4,5,6,7, el sistema GAL4-UAS ha sido adaptado para su uso en insectos de importancia médica y agrícola para proporcionar un análisis directo en las especies de interés 8,9,10,11,12,13,14.
En el mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae, el sistema GAL4-UAS se probó por primera vez mediante la coinfección de líneas celulares9. Se ensayaron múltiples construcciones para determinar la eficiencia en diferentes combinaciones por pares y se encontró que 14 UAS repetidos en tándem complementados con un pequeño intrón artificial (UAS-14i) mostraron el rango más amplio de potencial de activación cuando se usaron con un panel de controladores GAL4. Para demostrar la funcionalidad in vivo, estos constructos se utilizaron para crear dos líneas transgénicas separadas de An. gambiae mediante transformación de PiggyBac8: una línea conductora que transporta GAL4 impulsada por un promotor específico del intestino medio, y una línea de respuesta que contiene tanto la luciferasa como los genes de proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) bajo regulación de secuencias de UAS. La actividad de la luciferasa específica intestinal y la fluorescencia en la progenie indicaron que el sistema era eficiente en Anopheles. Desde entonces, se han creado líneas conductoras que expresan transgenes en otros tejidos importantes para la capacidad vectorial y la resistencia a los insecticidas, incluidos los enocitos15 y hemocitos16, y en un patrón casi ubicuo10. También se han generado numerosas líneas de UAS para evaluar genes que se cree que están involucrados en el metabolismo y la resistencia a insecticidas mediada por el secuestro, la síntesis de hidrocarburos cuticulares y para etiquetar fluorescentemente diferentes tipos de células y tejidos (Tabla 1). Para las líneas de respuesta, la integración dirigida al sitio del transgén ahora se realiza mediante el intercambio de casetes de recombinación catalizados por ΦC311111111 para fijar el contexto genómico de los genes regulados por UAS. De esta manera, la expresión transgénica se normaliza con respecto a la ubicación de la inserción genómica, lo que permite una comparación más precisa de los efectos fenotípicos de diferentes genes candidatos.
Las líneas de respuesta creadas hasta la fecha están diseñadas para expresar el transgén a niveles elevados o para reducir la expresión génica a través de la interferencia de ARN (ARNi). Por lo general, los clones de ADNc se fusionan con la secuencia UAS para generar plásmidos de expresión adecuados, sin embargo, las secuencias genómicas completas también son factibles suponiendo que no sean demasiado grandes para la clonación. Para generar construcciones silenciadoras, hemos utilizado tres métodos diferentes para obtener secuencias invertidas en tándem adecuadas que forman dsRNA de horquilla que estimula el ARNi. Estos han incluido PCR de fusión, PCR asimétrica y síntesis comercial de construcciones de horquilla. Común a cada método es la inclusión de una secuencia de intrón entre las secuencias invertidas para proporcionar estabilidad de clonación. Se han desarrollado plásmidos respondedores en los que se puede insertar un gen de interés/construcción de ARNi15. Estos plásmidos también llevan los sitios attB ΦC31 requeridos para RMCE (descritos en el artículo de Adolfi que acompaña a JoVE que describe la técnica RCME en detalle). En este manuscrito se incluyen protocolos que cubren los pasos importantes requeridos al seleccionar la secuencia para la inserción en uno de estos plásmidos para la sobreexpresión. Además, se describen e ilustran dos protocolos para la creación de construcciones de horquillas de RNAi.
Al crear nuevas líneas, la identificación de individuos transgénicos raros es crucial para reproducirse para establecer y mantener colonias transgénicas. Lo más importante para el sistema GAL4-UAS es la necesidad de distinguir las líneas de respuesta y conductor para establecer cruces e identificar la progenie individual que transporta ambos transgenes. Esto se logra mediante el uso de diferentes genes marcadores seleccionables dominantes vinculados a los casetes del conductor y del respondedor. Más comúnmente, estos son genes marcadores fluorescentes que son claramente distinguibles utilizando filtros ópticos (por ejemplo, eYFP, eCFP, dsRed). Es importante que los marcadores se expresen en un patrón espaciotemporal conocido y confiable, ya que esto facilita la identificación de anomalías y contaminación. La expresión génica del marcador fluorescente es regulada rutinariamente por el promotor sintético 3xP3, que causa la expresión específica de los ganglios oculares y ventrales en todas las etapas del desarrollo de An. gambiae19. Los marcadores fluorescentes controlados por 3xP3 se incluyen en todos los plásmidos de transformación descritos en este artículo. Aquí se incluye un protocolo que detalla los métodos comunes utilizados para detectar líneas fluorescentes an. gambiae pupae GAL4-UAS.
Uno de los elementos clave del sistema GAL4-UAS es la necesidad de cruzar las líneas de conductor y respuesta marcadas diferencialmente. Para hacer esto, los machos y las hembras de cada línea deben separarse antes del apareamiento. Los adultos son fácilmente distinguibles por la vista, sin embargo, para establecer cruces genéticos es sensato separar los sexos antes de la aparición adulta para garantizar que no se haya producido el apareamiento. La diferencia general de tamaño entre las pupas de An. gambiae macho y hembra es demasiado variable para ser un método eficiente y confiable de determinación del sexo20. En cambio, las claras diferencias morfológicas en los genitales externos proporcionan una base confiable para el sexado en An. gambiae. En este artículo, describimos un método confiable para sexar pupas de An. gambiae para establecer cruces apropiados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg"> Figura 1 - Representación esquemática del proceso para el uso del sistema bipartito GAL4-UAS en Anopheles gambiae. (A) Se representan los componentes principales de un vector de ejemplo (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]), detallando los sitios de restricción disponibles (EcoRI, NheI, XhoI y NcoI) dentro de los múltiples sitios de clonación que son adecuados para su uso para insertar la construcción de horquilla o la secuencia de codificación para el gen de interés. También se representa la estructura de la línea de acoplamiento. (B) El paso de cruce se ilustra indicando el uso de machos de la línea del conductor (que transportan al conductor GAL4 por un promotor de interés y eCFP impulsado por el promotor 3xP3) y hembras de la línea de respuesta (portadores del gen de interés o construcción de horquilla controlada por un promotor de UAS y un marcador eYFP controlado por el promotor 3xP3). (C) Una representación esquemática de GAL4 que impulsa la expresión del gen de interés en la progenie de la cruz en B y una lista de algunos de los fenotipos típicos que se evalúan. Abreviaturas: Sitio de clonación múltiple (MCS), Intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE), Secuencia del activador ascendente (UAS), Proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP), Proteína fluorescente cian mejorada (eCFP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Es el uso de cruces lo que proporciona la naturaleza bipartita del sistema GAL4-UAS, que tiene claras ventajas sobre los enfoques más lineales. Por ejemplo, se pueden evaluar muchas más combinaciones de líneas de conductor y respuesta de lo que sería factible si se tuviera que generar y mantener una nueva línea transgénica para cada combinación promotor/gen. Más importante aún, permite el análisis de genes que producen fenotipos letales o estériles cuando se perturba su expresión que son difíciles de crear/mantener en un sistema lineal. Tales fenotipos letales pueden manifestarse en todas las etapas del desarrollo, dependiendo de la función génica y la expresión espaciotemporal, pero se observan con mayor frecuencia durante el desarrollo embrionario. Visualizar el desarrollo embrionario del mosquito requiere la limpieza del corion opaco que recubre los huevos. Siguiendo los métodos descritos en Trpiš (1970)21 y Kaiser et al. (2014)22, describimos los protocolos que utilizamos para fijar embriones, manteniendo la integridad estructural, y el blanqueamiento para despejar el endodocoro que permite la visualización microscópica y la obtención de imágenes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm plastic Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td>2175546</td>
			<td>Pack of 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Gilson Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20/25 mL Universal Tubes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1412-3020</td>
			<td>Pack of 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur Pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>G612398</td>
			<td>Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11512303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>SLS</td>
			<td>45726-1L-F</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E6099</td>
			<td>30x30x30 with screen port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Paint Brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>UKDPB66</td>
			<td>KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth Aspirator</td>
			<td>John Hock</td>
			<td>612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pond Salt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupae Pots</td>
			<td>Cater4you</td>
			<td>SP8OZ</td>
			<td>250 pots with lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plastic Buckets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25552</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the gal4-uas system for functional genetics in anopheles gambiae

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil y potente para el análisis genético funcional. La esencia del sistema es cruzar líneas transgénicas "conductoras" que expresan el factor de transcripción de levadura GAL4 de una manera específica del tejido, con líneas transgénicas "respondedoras" que llevan una construcción candidata de interferencia de gen / ARN cuya expresión está controlada por secuencias de activación ascendentes (UAS) que se unen a GAL4. En la progenie subsiguiente, el gen o la construcción silenciadora se expresa de una manera espaciotemporal prescrita, lo que permite ensayar los fenotipos resultantes e inferir la función génica. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para detectar fenotipos generados por la expresión transgénica en múltiples patrones específicos de tejidos, incluso si se inducen costos severos de aptitud física. Hemos adaptado este sistema para Anopheles gambiae, el principal vector de malaria en África.
En este artículo, proporcionamos algunos de los procedimientos comunes utilizados durante el análisis GAL4-UAS. Describimos las líneas GAL4-UAS de An. gambiae ya generadas, así como la clonación de nuevas construcciones de respuesta para la regulación ascendente y el derribo de ARNi. Especificamos una guía paso a paso para el sexado de pupas de mosquitos para establecer cruces genéticos, que también incluye la detección de la progenie para seguir la herencia de marcadores genéticos fluorescentes que etiquetan las inserciones del conductor y del respondedor. También presentamos un protocolo para la limpieza de embriones de An. gambiae para estudiar el desarrollo embrionario. Finalmente, introducimos posibles adaptaciones del método para generar líneas conductoras a través de la inserción CRISPR/Cas9 de GAL4 aguas abajo de los genes diana.

La expresión 3xP3 de eYFP, dsRed y eCFP proporciona una identificación confiable y fácilmente distinguible de individuos que poseen los genes marcadores que producen expresión en los ojos y los ganglios ventrales de las pupas de An. gambiae (Figura 3). La morfología diferencial observada en los genitales externos masculinos y femeninos utilizados para el sexado y un ejemplo de pupas no identificables se destacan en la Figura 4. La eliminac...

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Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para el análisis genético funcional en Anopheles gambiae a través de la modificación genética de la expresión génica de manera espaciotemporal controlada. El sistema binario permite flexibilidad en los enfoques experimentales para la caracterización fenotípica de la expresión transgénica, incluso si se inducen costos severos de aptitud. Este sistema se puede utilizar para la caracterización fenotípica de genes potencialmente involucrados en la resistencia a insecticidas, la transmisión de patógenos o aquellos que tienen usos en métodos de control genético.Fraser Coleman, un técnico de investigación, ayudará a demostrar este procedimiento Comience recolectando pupas usando una pipeta Pasteur de plástico de tres mililitros con el extremo cortado en un plato plano transparente adecuado para su uso con un microscopio estéreo. Retire con cuidado la mayor parte del agua alrededor de las pupas. Encienda la bombilla fluorescente y deje que se caliente.Considere los patrones espaciotemporales de color de una expresión y proporción de diferentes fenotipos que se esperan al detectar marcadores fluorescentes. Seleccione el filtro requerido en el estereoscopio de fluorescencia y verifique que haya un haz de luz de color visible que se dirija al centro de la placa del escenario. Bajo luz blanca, centra las pupas en el campo de visión y enfócalas.Apague la luz blanca y use el enfoque fino para enfocar el área de las pupas que llevan el fenotipo de interés con un patrón fluorescente visible. Use un pincel de detalle fino para girar suavemente las pupas y mueva las paletas anales para que se puedan identificar los genitales externos. Pupas separadas basadas en genitales externos distintivos.Los machos tienen un tubo largo que extruye desde el segmento dorsal final aproximadamente la mitad de la longitud de las paletas anales. Los genitales externos de las pupas femeninas son considerablemente más cortos y bifurcados. Separe las pupas sexadas en grupos de 10 o menos en tubos transparentes de 20 mililitros con agua, y selle los tubos con una bola de algodón.Aspire el número deseado de adultos machos y hembras de los tubos en una jaula o cubo pequeño, teniendo cuidado de no dañar a los adultos durante esta transferencia. Mantenga la cruz durante cinco a siete días antes de la alimentación con sangre. Al día siguiente, se pueden recolectar óvulos para estudiar el desarrollo embrionario.Ensamble la cámara de oviposición e introduzca cuidadosamente de 10 a 15 hembras alimentadas con sangre en ella. Cubra la cámara de oviposición y deje actuar durante 20 minutos. Separe cuidadosamente el tubo de polipropileno de 50 mililitros de la olla de oviposición, asegurándose de no liberar a los mosquitos.Cubra la maceta y permita que los huevos maduren hasta la etapa de desarrollo de interés. Recoge los huevos de la olla con un pincel de detalles finos y colócalos sobre el agua en un bloque de vidrio excavado de 40 milímetros cuadrados. Retire cuidadosamente el agua del bloque de vidrio con una micropipeta y cubra los huevos en 500 microlitros de FAA.Oscile suavemente sobre el agitador orbital a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague bien los huevos 15 veces con agua destilada para eliminar todos los rastros de solución FAA. Usando una micropipeta de 1000 microlitros agregue y luego retire un mililitro de agua destilada a la vez, teniendo cuidado de no dañar los huevos mientras lo hace.Cubra los huevos fijos con un mililitro de solución de Trpis e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los huevos comenzarán a desarrollar parches pálidos después de cinco minutos de incubación, alcanzando finalmente un color blanco lechoso una vez despejados. Enjuague bien los huevos 15 veces con agua destilada para eliminar todos los rastros de solución de Trpis.La expresión de marcadores fluorescentes impulsados por el promotor 3xP3 se observa en los ojos y ganglios ventrales de las pupas de Anopheles gambiae. El uso de marcadores fluorescentes de diferentes colores permite la selección y detección de individuos modificados que llevan diferentes componentes GAL4 y UAS. Cuando se trabaja con un sistema BIPARTITO GAL4-UAS, es necesario cruzar machos y hembras de diferentes cepas para adquirir progenie llevando tanto los componentes GAL4 como UAS.La morfología diferencial observada en el genital externo masculino y femenino de las pupas se utiliza para el sexado. Aquí se destaca un ejemplo de una pupa no identificable. La eliminación de toda el agua de las pupas, como se muestra a la derecha, aumenta la dificultad de sexado ya que las paletas anales oscurecen la visualización de los genitales.El sistema bipartito GAL4-UAS permite la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada. Esto se puede visualizar cruzando el enocito y el omnipresente GAL4 cuatro líneas de conductor que expresan con la línea de respuesta UAS-mCherry. Un beneficio clave del uso de un sistema bipartito GAL4-UAS es la facilidad de estudiar fenotipos letales incluso en la etapa embrionaria.Para ello, es necesario visualizar la morfología interna de los embriones. Las características morfológicas normales observadas en diferentes etapas del desarrollo embrionario a las 12, 24 y 36 horas después de la puesta se pueden ver después de la finalización del protocolo de limpieza embrionaria. Es vital a lo largo de este procedimiento que no se permita que las pupas y los huevos se desecan.Por lo tanto, es importante trabajar rápidamente al eliminar líquidos. El método GAL4-UAS nos ha permitido caracterizar funcionalmente genes implicados en la resistencia a los insecticidas y aquellos con usos potenciales en los métodos de control de impulsores genéticos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Investigación

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

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Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

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Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

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