Name: an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Forfatterne vil gerne takke Dr. Kevin Haworth for at hjælpe med Drabkin's assay og Dr. Viktor Bollen for hans støtte i udformningen af protokollen. Forfatterne er også taknemmelige for Dr. Adam Maxwell for hans vejledning om at designe histotripsy kilde.

For de resultater, der præsenteres her, venøse humane blod blev trukket til at danne blodpropper efter godkendelse fra den lokale interne review board (IRB # 19-1300) og skriftligt informeret samtykke fra frivillige donorer24. I dette afsnit skitseres en designprotokol til vurdering af lysotripsieffekten. Protokollen er baseret på et tidligere værk af Bollen et al.24.
1. Clot modellering
BEMÆRK: Forbered blodpropper...

Den foreslåede protokol præsenterer en model til at kvantificere behandlingseffekten af lysotripsi. Mens de vigtigste detaljer er blevet drøftet, er der visse kritiske aspekter at overveje for succesen af denne protokol. Den enzymatiske aktivitet af RT-PA har en Arrhenius temperatur afhængighed30. Temperatur er også en medvirkende faktor til lydens hastighed i vand og væv, og temperaturudsving kan forårsage mindre ændringer af fokuszonens geometri. Vandtemperaturen bør således reguleres ...

Trombose er tilstanden af blodprop dannelse i en ellers sund blodkar, der hindrer omsætning1,2. Venøs tromboemboli har en årlig sundhedsudgifter på $7-10 milliarder, med 375,000-425,000 tilfælde i USA3. Lungeemboli er obstruktion af lungepulsåren og er den mest alvorlige konsekvens af venøs tromboemboli. Den primære kilde til lungeobstruktion er dyb vene thrombi, primært fra iliofemoral venøse segmenter4,5,6. Dyb venetrombose (DVT) har iboende følgevirkninger udover lungeobstruktioner, med langsigtede komplikationer, der resulterer i smerte, hævelse, bensår og amputationer aflemmerne 7,8,9. For kritiske forhindringer, kateter rettet trombolytics (CDT) er frontlinjen tilgang til fartøj recanalization10. Resultatet af CDT afhænger af en række faktorer, herunder trombe alder, placering, størrelse, sammensætning, ætiologi, og patientrisiko kategori11. Desuden er CDT forbundet med vaskulær skade, infektioner, blødningskomplikationer og lang behandlingstid10. Næste generations enheder har til formål at kombinere mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmakkomesisk trombektomi)12,13. Brugen af disse enheder sænker den lytiske dosis, hvilket fører til reducerede blødningskomplikationer, og forkortede behandlingstiden12,13,14 sammenlignet med CDT. Disse enheder stadig bevare problemer med hæmoragiske bivirkninger og ufuldstændig fjernelse af kronisk thrombi15. En adjuvans strategi er derfor nødvendig, der kan fjerne tromben helt med lavere blødning komplikationer.
En potentiel tilgang er histotripsi-aided trombolytisk behandling, benævnt lysotripsi. Histotripsi er en ikke-invasiv behandling modalitet, der bruger fokuseret ultralyd til at nukleate boble skyer i væv16. Bobleaktivitet genereres ikke via eksogene kerner, men ved anvendelse af ultralydsimpulser med tilstrækkelig spænding til at aktivere kerner iboende væv, herunder blodprop17,18. Den mekaniske svingning af bobleskyen giver stammen til blodproppen og opløser strukturen i acellulære snavs19. Histotripsi boble aktivitet giver effektiv nedbrydning af tilbagetrukne og unretracted blodpropper både in vivo og in vitro20,21,22. Tidligere undersøgelser har23,24 påvist, at kombinationen af histotripsi og lytic rekombinant vævstype plasminogen aktivator (rt-PA) øger behandlingseffektiviteten (rt-PA) betydeligt i forhold til lytic alene eller histotripsi alene. Det er en hypotese, at to primære mekanismer forbundet med histotripsi boble aktivitet er ansvarlige for den forbedrede behandling effekt: 1) øget fibrinolyse på grund af øget lytic levering, og 2) hæmolyse af røde blodlegemer i blodproppen. Hovedparten af blodproppen består af røde blodlegemer24, og derfor er sporing af erythrocyt nedbrydning en god surrogat for ablation af prøven. Andre dannede blodprop elementer er også sandsynligvis opløst under histotripsi boble aktivitet, men er ikke taget i betragtning i denne protokol.
Her er en bordplade tilgang til behandling af DVT in vitro med lysotripsi skitseret. Protokollen beskriver kritiske driftsparametre for histotripsikilden, vurdering af behandlingseffekt og billedvejledning. Protokollen omfatter designe en flow kanal til at efterligne en iliofemoral venøs segment og fremstilling af humane fuldblodspropper. Den eksperimentelle procedure skitserer placeringen af histotripsi kilde og billeddannelse array for at opnå histotripsi eksponering langs blodproppen placeret i flowkanalen. Relevante insonationsparametre for at opnå blodpropforstyrrelser og minimere off-target bobleaktivitet defineres. Brugen af ultralydsscanning til vejledning og vurdering af bobleaktivitet er illustreret24. Målinger til kvantificering af behandlingseffekten, såsom massetab af blodpropper, D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) er skitseret23,24,25,26,27. Samlet set giver undersøgelsen et effektivt middel til at udføre og vurdere effekten af lysotripsi til behandling af DVT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbing sheets</td>
			<td>Precision acoustics</td>
			<td>F28-SMALL-M</td>
			<td>300mm x 300 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Pasteur pippettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820A</td>
			<td>14.6 cm length, 2 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drabkin&#39;s assay</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5941-6VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draw syringe</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter bags</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5162K111</td>
			<td>Remove particle size upto 1 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow channel tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5154K25</td>
			<td>Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8&#34;, Inner diameter: 1/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating elements</td>
			<td>Won Brothers</td>
			<td>HT 300 Titanium</td>
			<td>Titanium rods placed at the bottom of tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging array</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td>L11-5v</td>
			<td>128 element with sensitivity from -55 to -49 dB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5234K98</td>
			<td>6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Nanopure Diamond</td>
			<td>ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Vitalant</td>
			<td>4PF000</td>
			<td>Plasma frozen within 24 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo HST Plate Reader</td>
			<td>For haemoglobin quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe cover</td>
			<td>Civco</td>
			<td>610-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programming platform</td>
			<td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)</td>
			<td>Genentech</td>
			<td>Activase</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-74900-20</td>
			<td>pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>In-house customized</td>
			<td></td>
			<td>Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound scaning system</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td></td>
			<td>Vantage Research Ultrasound System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water tank</td>
			<td>Advanced acrylics</td>
			<td>C133</td>
			<td>14 x 14 x 12, 1/2&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug

Dyb venetrombose (DVT) er et globalt sundhedsmæssigt problem. Den primære tilgang til at opnå recanalisering af fartøjer for kritiske forhindringer er kateterstyret trombolytika (CDT). For at afbøde kaustiske bivirkninger og den lange behandlingstid forbundet med CDT, adjuvans og alternative tilgange er under udvikling. En sådan tilgang er histotripsi, en fokuseret ultralydsbehandling for at ablate væv via bobleskynukleation. Prækliniske undersøgelser har vist stærk synergi mellem histotripsi og trombolytika for blodprop nedbrydning. Denne rapport skitserer en bordplade metode til at vurdere effekten af histotripsi-aided trombolytisk behandling, eller lysotripsi.
Blodpropper fremstillet af frisk humant venøs blod blev indført i en flowkanal, hvis dimensioner og acousto-mekaniske egenskaber efterligner en iliofemoralsk vene. Kanalen var gennemsyret af plasma og lytic rekombinant væv-type plasminogen aktivator. Bobleskyer blev genereret i blodproppen med en fokuseret ultralydskilde designet til behandling af lårvenvenøse blodpropper. Motoriserede positioners blev brugt til at oversætte kilden fokus langs blodproppen længde. På hvert insonationssted blev akustiske emissioner fra bobleskyen passivt registreret og stråleformet for at generere passive kavitationsbilleder. Målinger til måling af behandlingseffekten omfattede blodprop massetab (samlet behandlingseffekt) og koncentrationerne af D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) i perfusat. Der er begrænsninger for denne in vitro design, herunder manglende midler til at vurdere in vivo bivirkninger eller dynamiske ændringer i strømningshastighed som blodproppen lyses. Samlet set giver opsætningen en effektiv metode til at vurdere effekten af histotripsi-baserede strategier til behandling af DVT.

Protokollen skitseret i denne undersøgelse fremhæver detaljerne i venøs blodprop modellering, lysotripsi for blodprop forstyrrelser, og ultralydsscanning i en in vitro setup af DVT. Den vedtagne procedure viser de nødvendige skridt til at vurdere forstyrrelser i blodpropper på grund af de kombinerede virkninger af rt-PA og histotripsy boble cloud aktivitet. Bænken setup var designet til at efterligne de særlige kendetegn ved en venøs iliofemoral vene. Figur 1A viser et modelkar, der ...

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Histotripsi-aided lytic levering eller lysotripsi er under udvikling til behandling af dyb venetrombose. En in vitro-procedure præsenteres her for at vurdere effekten af denne kombinationsbehandling. Nøgleprotokoller for blodpropmodellen, billedvejledningen og vurderingen af behandlingseffektiviteten diskuteres.

Et In vitro-system til at måle den trombolytiske effekt af histotripsi og et lytisk lægemiddel

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Denne protokol giver en bordplade metode til vurdering af effekten og virkningsmekanismerne af histotripsi hjulpet trombolytisk terapi eller lysotripsi, en alternativ ikke-invasiv tilgang til behandling af kritisk dyb venetrombose. Denne teknik bruger bobleaktivitet til at have en tovejseffekt gennem en øget fibrinolyse på grund af en forbedret lytisk levering og hæmolyse af røde blodlegemer i blodproppen. Denne bænk tilgang til behandling af dyb vene trombose letter modellering af blodpropper, behandling med lysotripsi, og samtidig billeddannelse under behandlingen.Bubble cloud generation, behandling planlægning, og image vejledning kan yderligere bruges til at undersøge in vitro histotripsi-baserede behandlinger af andre sygdomme, såsom nyre og lever tumorer. Hvis du vil oprette histotripsykilden, skal du montere kilden på et motoriseret positioneringssystem. Dæk billeddannelse array med en sonde dække og fastsætte array koaksially i blænden af histotripsy kilde.Tilslut billeddannelse array til en ultralyd scanning system og helt nedsænke histotripsy kilde og billeddannelse array i tanken. Brug en sprøjte til forsigtigt at fjerne eventuelle luftbobler, og brug billeddannelsesmatrixen og scanneren til at anskaffe afgassede B-tilstand vandbilleder med 20 billeder i sekundet. Mens du erhverver billederne, skal du justere placeringen af billedmatrixen inde i den konfokale transduceråbning, indtil bobleskyen er placeret ca. i midten af billedvinduet og registrere det fundne brændpunkt i billedvinduet.Derefter afbryde insonation og indstille spændingen anvendes til histotripsy kilde til nul. For at forberede en blodprop til analyse skal du bruge tænger til at skære den forseglede ende af en pipette indeholdende en blodprop og lade blodproppen og serum glide ind i en petriskål. Brug en skalpel til at skære blodproppen til en centimeter længde og bruge en rengøring tørre til forsigtigt blotlægge den afskårne sektion for at fjerne overskydende væske.Brug pincet til forsigtigt at placere den del af blodproppen på en skala og registrere vægten. Derefter manuelt hæve flowkanalen ud af en afgasset omvendt osmose vandtank og fjerne modelbeholderen fra kanalen. Brug pincet til forsigtigt at placere blodproppen i modelbeholderen uden at beskadige blodproppen, og fastgør beholderen til strømningskanalen.Sænk strømningskanalen ind i tanken, så den proksimale ende af scenen i forhold til reservoiret er lav sammenlignet med den distale side, og brug en pipette til at tilføje 30 mikroliter på 37 grader Celsius opvarmet plasma til reservoiret. Overvåg vandtankens temperatur, indtil den når mindst 36 grader Celsius, og brug en pipette til at tilføje 80,4 mikrogram rt-PA i plasmatanken. For at prime flowkanalen skal du bruge en sprøjtepumpe til at trække plasma fra reservoiret ind i kanalen, indtil modelbeholderen er fyldt.Derefter skal du manuelt udjævne modelbeholderen for at sikre, at der ikke er luftbobler i modelbeholderen, som det ses i billedvinduet. For at planlægge en sti til histotripsi kilde og billeddannelse array for en ensartet histotripsi eksponering langs blodproppen længde, skal du bruge billedbehandling script til at bruge de motoriserede positioners at justere billeddannelse array parallelt med længden af blodproppen og bekræfte, at ingen luftbobler er til stede i fartøjet. Brug de motoriserede positioners til at justere billeddannelsesmatrixen, så billedplanet er parallelt med koppens tværsnit.Brug billeddannelsesvinduet som vejledning, flyt histotripsikilden til den proksimale ende af blodproppen i forhold til reservoiret. For at bestemme insonationsstien langs blodproppens længde skal du indstille waypoints langs længden af blodproppen i fem millimeter intervaller. Før du afslutter hvert waypoint, brand test pulser fra histotripsy kilde med de samme insonation parametre som påvist, men med den samlede eksponering reduceret til 10 samlede pulser.Gem motorpositionerne ved hjælp af de kommandoer, som producenten har angivet. For at behandle blodproppen langs dens længde i henhold til den vej, der er defineret i forbehandlingstrinnet, skal du indstille sprøjtepumpen til 0,65 milliliter i minuttet og vente på, at plasmaets menisk bevæger sig. Interpoler behandlingsstien med mellemliggende trin mellem de etablerede waypoints med en fast trinstørrelse, og brug positionerne til at flytte histotripsykilden på hvert stisted ved hjælp af de oprindeligt indstillede insonationsparametre.Derefter skal du oprette et script for at indstille billedmatrixen til at erhverve et B-tilstandsbillede af blodproppen og modelbeholderen et par sekunder før anvendelsen af histotripsy puls på hvert sted. Derefter anvende histotripsi puls på hvert waypoint, erhverve de akustiske emissioner i scriptet til at danne passive kavitation billeder efter analysen. Brug billedbehandlingsvinduet til at afbilde bobleaktiviteten under anvendelsen af histotripsipulsen på hvert stisted.Efter analysen skal du manuelt hæve modelbeholderen ud af vandtanken for at dræne perfusate via tyngdekraften og bruge sprøjtepumpen til at trække plasmaopløsningen fra flowkanalen for at tillade indsamling af hele perfusate i et lille bæger. Tag modelbeholderen ud, og fjern blodproppen. Tør derefter blodproppen af med laboratorievæv og afvej blodproppen for at vurdere massetabet af blodproppen.Ved anvendelse af tilstrækkelig spænding til histotripsikilden genereres en boblesky i transducerens brændvidde og visualiseres via ultralydsscanning. Brændpositionen defineres som midten af bobleskyen. Denne kontrolpersat af en blodprop, der blev udsat for plasma alene, og denne perfusat af en lysotripsibehandlet blodprop blev brugt til at vurdere indholdet af hæmoglobin og D-dimer som påvist.Variationen i hæmoglobinkoncentrationen kan kvantificeres ved optisk absorbans. Her kan en blodprop visualiseres i et modelkar via B-tilstandsbilleddannelse forud for histotripsieksponering for at bestemme blodproppens position for segmentering af det passive kavitationsbillede. Da dette passive kavitationsbillede er co-registreret med B-mode-billedet af blodproppen bekræfter, er den akustiske energi primært indeholdt i blodproppen under histotripsieksponeringen.I prøver udsat for histotripsi, forstyrrelser er primært begrænset til blodprop center, i overensstemmelse med de observerede steder af boble aktivitet spores via passiv kavitation billeddannelse. Ved tilsætning af lytic forekommer massetab også i regioner tættere på blodproppens periferi. Alternativt kan økogene liposomer, der indeholder rt-PA, anvendes i stedet for systemisk rt-PA-levering for at gøre det muligt at vurdere målrettet lægemiddellevering til blodproppen.Lysotripsi giver en alternativ ikke-invasiv tilgang til behandling af mange sygdomme. Denne in vitro-protokol gør det muligt at vurdere effekten af behandlingen og dens potentielle succes med in vivo-anvendelse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering af et menneske 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In vitro</em&gt; Enzymatisk assay til måling Transskription Inhibering af gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug-loaded Supramolekylær Hydrogel for Local kateter injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Anvendelse af et High-throughput<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Produktion af Cancer Cell Sfæroider med en vandig tofasesystem for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning af Electrospinning proces med at give tre unikke miljøer for en Tri-lags<em&gt; In vitro</em&gt; Model af Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som et fundament for In Vivo delvis lever ingeniør i rotten

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...