Name: an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00
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Ce travail a été financé par les National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Kevin Haworth pour son aide au test de Drabkin et le Dr Viktor Bollen pour son soutien dans la conception du protocole. Les auteurs sont également reconnaissants au Dr Adam Maxwell pour ses conseils sur la conception de la source d’histotripsie.

Pour les résultats présentés ici, du sang humain veineux a été prélevé pour former des caillots après approbation du comité d’examen interne local (CISR no 19-1300) et consentement éclairé écrit fourni par des donneurs bénévoles24. Cette section décrit un protocole de conception pour évaluer l’efficacité de la lysotripsie. Le protocole est basé sur un travail antérieur de Bollen et al.24.
1. Modélisation des caillots
<p ...

Le protocole proposé présente un modèle pour quantifier l’efficacité du traitement de la lysotripsie. Bien que les détails clés aient été discutés, il y a certains aspects critiques à considérer pour le succès de ce protocole. L’activité enzymatique de rt-PA a une dépendance de température d’Arrhenius30. La température est également un facteur contribuant à la vitesse du son dans l’eau et les tissus, et les variations de température peuvent entraîner des modifications m...

La thrombose est l’état de formation de caillots dans un vaisseau sanguin par ailleurs sain qui obstrue la circulation1,2. La thromboembolie veineuse a un coût annuel des soins de santé de 7 à 10 milliards de dollars, avec 375 000 à 425 000 cas aux États-Unis3. L’embolie pulmonaire est l’obstruction de l’artère pulmonaire et est la conséquence la plus grave de la thromboembolie veineuse. La principale source d’obstruction pulmonaire est le thrombus veineux profond, principalement à partir des segments veineux iliofémoraux4,5,6. La thrombose veineuse profonde (TVV) a des séquelles inhérentes en plus des obstructions pulmonaires, avec des complications à long terme qui entraînent de la douleur, de l’enflure, des ulcérations de la jambe et des amputations de membres7,8,9. Pour les obstructions critiques, les thrombolytiques dirigés par cathéter (CDT) sont l’approche de première ligne pour la recanalisation des vaisseaux10. Le résultat de la CDT dépend d’un certain nombre de facteurs, y compris l’âge du thrombus, l’emplacement, la taille, la composition, l’étiologie et la catégorie de risque du patient11. De plus, la TDC est associée à des lésions vasculaires, des infections, des complications hémorragiques et une longue durée de traitement10. Les dispositifs de nouvelle génération visent à combiner la thrombectomie mécanique avec des thrombolytiques (c.-à-d. thrombectomie pharmacomécanique)12,13. L’utilisation de ces dispositifs réduit la posologie lytique, ce qui réduit les complications hémorragiques et raccourcit le temps de traitement12,13,14 par rapport à la CDT. Ces dispositifs conservent encore des problèmes d’effets secondaires hémorragiques et d’élimination incomplète des thrombuschroniques 15. Une stratégie adjuvante est donc nécessaire pour éliminer complètement le thrombus avec des complications hémorragiques plus faibles.
Une approche potentielle est le traitement thrombolytique assisté par histotripsie, appelé lysotripsie. L’histotripsie est une modalité de traitement non invasive qui utilise des ultrasons focalisés pour nucléer les nuages de bulles dans les tissus16. L’activité des bulles n’est pas générée par des noyaux exogènes, mais par l’application d’impulsions ultrasonores avec une tension suffisante pour activer les noyaux intrinsèques aux tissus, y compris le caillot17,18. L’oscillation mécanique du nuage de bulles confère une contrainte au caillot, désintégrant la structure en débris acellulaires19. L’activité des bulles d’histotripsie permet une dégradation efficace des caillots sanguins rétractés et non rétractés à la fois in vivo et in vitro20,21,22. Des études antérieures ont démontré23,24 que la combinaison de l’histotripsie et de l’activateur plasminogène de type tissulaire recombinant lytique (rt-PA) augmente significativement l’efficacité du traitement par rapport au lytique seul ou à l’histotripsie seule. On émet l’hypothèse que deux mécanismes principaux associés à l’activité de la bulle d’histotripsie sont responsables de l’amélioration de l’efficacité du traitement: 1) augmentation de la fibrinolyse due à l’amélioration de l’administration lytique, et 2) hémolyse des globules rouges dans le caillot. La majeure partie de la masse du caillot est composée de globules rouges24, et, par conséquent, le suivi de la dégradation des érythrocytes est un bon substitut pour l’ablation de l’échantillon. D’autres éléments de caillot formés sont également probablement désintégrés sous l’activité de bulle d’histotripsie, mais ne sont pas pris en compte dans ce protocole.
Ici, une approche de paillasse pour traiter la TVP in vitro avec lysotripsie est décrite. Le protocole décrit les paramètres de fonctionnement critiques de la source d’histotripsie, l’évaluation de l’efficacité du traitement et le guidage par image. Le protocole comprend la conception d’un canal d’écoulement pour imiter un segment veineux iliofémoral et la fabrication de caillots de sang total humain. La procédure expérimentale décrit le positionnement de la source d’histotripsie et du réseau d’imagerie pour obtenir une exposition à l’histotripsie le long du caillot placé dans le canal d’écoulement. Des paramètres d’insonation pertinents pour atteindre la perturbation des caillots et minimiser l’activité des bulles hors cible sont définis. L’utilisation de l’imagerie par ultrasons pour le guidage et l’évaluation de l’activité des bulles estillustrée 24. Les mesures permettant de quantifier l’efficacité du traitement, telles que la perte de masse des caillots, le D-dimère (fibrinolyse) et l’hémoglobine (hémolyse), sont décrites23,24,25,26,27. Dans l’ensemble, l’étude fournit un moyen efficace d’exécuter et d’évaluer l’efficacité de la lysotripsie pour traiter la TVP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbing sheets</td>
			<td>Precision acoustics</td>
			<td>F28-SMALL-M</td>
			<td>300mm x 300 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Pasteur pippettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820A</td>
			<td>14.6 cm length, 2 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drabkin&#39;s assay</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5941-6VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draw syringe</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter bags</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5162K111</td>
			<td>Remove particle size upto 1 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow channel tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5154K25</td>
			<td>Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8&#34;, Inner diameter: 1/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating elements</td>
			<td>Won Brothers</td>
			<td>HT 300 Titanium</td>
			<td>Titanium rods placed at the bottom of tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging array</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td>L11-5v</td>
			<td>128 element with sensitivity from -55 to -49 dB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5234K98</td>
			<td>6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Nanopure Diamond</td>
			<td>ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Vitalant</td>
			<td>4PF000</td>
			<td>Plasma frozen within 24 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo HST Plate Reader</td>
			<td>For haemoglobin quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe cover</td>
			<td>Civco</td>
			<td>610-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programming platform</td>
			<td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)</td>
			<td>Genentech</td>
			<td>Activase</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-74900-20</td>
			<td>pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>In-house customized</td>
			<td></td>
			<td>Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound scaning system</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td></td>
			<td>Vantage Research Ultrasound System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water tank</td>
			<td>Advanced acrylics</td>
			<td>C133</td>
			<td>14 x 14 x 12, 1/2&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug

La thrombose veineuse profonde (TVPH) est un problème de santé mondial. La principale approche pour obtenir la recanalisation des vaisseaux pour les obstructions critiques est la thrombolytique dirigée par cathéter (CDT). Pour atténuer les effets secondaires caustiques et la longue durée du traitement associée à la TDC, des approches adjuvantes et alternatives sont en cours de développement. L’une de ces approches est l’histotripsie, une thérapie par ultrasons focalisés pour ablater les tissus via la nucléation des nuages de bulles. Des études précliniques ont démontré une forte synergie entre l’histotripsie et les thrombolytiques pour la dégradation des caillots. Ce rapport décrit une méthode de paillasse pour évaluer l’efficacité du traitement thrombolytique assisté par histotripsie, ou lysotripsie.
Des caillots fabriqués à partir de sang veineux humain frais ont été introduits dans un canal d’écoulement dont les dimensions et les propriétés acousto-mécaniques imitent une veine iliofémorale. Le canal a été perfusé avec du plasma et l’activateur lytique recombinant de type tissulaire plasminogène. Des nuages de bulles ont été générés dans le caillot avec une source d’ultrasons focalisée conçue pour le traitement des caillots veineux fémoraux. Des positionneurs motorisés ont été utilisés pour traduire le foyer source le long de la longueur du caillot. À chaque emplacement d’insonation, les émissions acoustiques du nuage de bulles ont été enregistrées passivement et formées par faisceau pour générer des images de cavitation passive. Les mesures permettant d’évaluer l’efficacité du traitement comprenaient la perte de masse de caillots (efficacité globale du traitement) et les concentrations de D-dimère (fibrinolyse) et d’hémoglobine (hémolyse) dans le perfusate. Cette conception in vitro présente des limites, notamment le manque de moyens pour évaluer les effets secondaires in vivo ou les changements dynamiques du débit à mesure que le caillot se lyse. Dans l’ensemble, la configuration fournit une méthode efficace pour évaluer l’efficacité des stratégies basées sur l’histotripsie pour traiter la TVC.

Le protocole décrit dans cette étude met en évidence les détails de la modélisation des caillots veineux, de la lysotripsie pour la perturbation des caillots et de l’imagerie échographique dans une configuration in vitro de TVP. La procédure adoptée démontre les étapes nécessaires pour évaluer la perturbation des caillots due aux effets combinés de la rt-PA et de l’activité des nuages de bulles d’histotripsie. La configuration de la paillasse a été conçue pour imiter les caractéristiques d’une v...

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An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

L’accouchement lytique assisté par histotripsie ou lysotripsie est en cours de développement pour le traitement de la thrombose veineuse profonde. Une procédure in vitro est présentée ici pour évaluer l’efficacité de cette thérapie combinée. Les principaux protocoles pour le modèle de caillot, les conseils d’image et l’évaluation de l’efficacité du traitement sont discutés.

Un système in vitro pour évaluer l’efficacité thrombolytique de l’histotripsie et d’un médicament lytique

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Ce protocole fournit une méthode de paillasse pour évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de la thérapie thrombolytique assistée par histotripsie ou lysotripsie, une approche non invasive alternative pour traiter la thrombose veineuse profonde critique. Cette technique utilise l’activité des bulles pour avoir un effet bidirectionnel grâce à une augmentation de la fibrinolyse due à une livraison lytique améliorée et à l’hémolyse des globules rouges dans le caillot. Cette approche de paillasse pour traiter la thrombose veineuse profonde facilite la modélisation des caillots sanguins, le traitement par lysotripsie et l’imagerie simultanée pendant le traitement.La génération de nuages de bulles, la planification du traitement et le guidage par image peuvent également être utilisés pour étudier les traitements in vitro à base d’histotripsie d’autres maladies, telles que les tumeurs rénales et hépatiques. Pour configurer la source d’histotripsie, montez la source sur un système de positionnement motorisé. Couvrez le réseau d’imagerie avec un couvercle de sonde et fixez le réseau coaxialement dans l’ouverture de la source d’histotripsie.Connectez le réseau d’imagerie à un système de balayage par ultrasons et immergez complètement la source d’histotripsie et le réseau d’imagerie dans le réservoir. Utilisez une seringue pour éliminer doucement les bulles d’air et utilisez le réseau d’imagerie et le scanner pour acquérir des images d’eau dégazées en mode B à 20 images par seconde. Lors de l’acquisition des images, ajustez la position du réseau d’imagerie à l’intérieur de l’ouverture du transducteur confocal jusqu’à ce que le nuage de bulles soit situé approximativement au centre de la fenêtre d’image et enregistrez l’emplacement focal détecté dans la fenêtre d’imagerie.Ensuite, arrêtez l’insonation et réglez la tension appliquée à la source d’histotripsie à zéro. Pour préparer un caillot pour l’analyse, utilisez une pince pour couper l’extrémité scellée d’une pipette contenant un caillot et laissez le caillot et le sérum glisser dans une boîte de Pétri. Utilisez un scalpel pour couper le caillot à une longueur d’un centimètre et utilisez une lingette nettoyante pour éponger doucement la section coupée afin d’éliminer tout excès de liquide.Utilisez une pince à épilez pour placer soigneusement la section de caillot sur une balance et enregistrer le poids. Ensuite, soulevez manuellement le canal d’écoulement d’un réservoir d’eau à osmose inverse dégazé et retirez le récipient modèle du canal. Utilisez une pince à épileuse pour placer soigneusement le caillot dans le récipient modèle sans endommager le caillot et attacher le récipient au canal d’écoulement.Abaissez le canal d’écoulement dans le réservoir de sorte que l’extrémité proximale de l’étage par rapport au réservoir soit basse par rapport au côté distal et utilisez une pipette pour ajouter 30 microlitres de plasma réchauffé de 37 degrés Celsius au réservoir. Surveillez la température du réservoir d’eau jusqu’à ce qu’il atteigne au moins 36 degrés Celsius et utilisez une pipette pour ajouter 80,4 microgrammes de rt-PA dans le réservoir de plasma. Pour amorcer le canal d’écoulement, utilisez une pompe à seringue pour aspirer le plasma du réservoir dans le canal jusqu’à ce que le récipient modèle ait été rempli.Ensuite, nivelez manuellement le modèle de récipient pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le récipient modèle, comme on le voit dans la fenêtre d’imagerie. Pour planifier un chemin pour la source d’histotripsie et le réseau d’imagerie pour une exposition uniforme à l’histotripsie le long de la longueur du caillot, utilisez le script d’imagerie pour utiliser les positionneurs motorisés afin d’aligner le réseau d’imagerie parallèlement à la longueur du caillot et de confirmer qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le vaisseau. Utilisez les positionneurs motorisés pour aligner le réseau d’imagerie de manière à ce que le plan d’imagerie soit parallèle à la section transversale du caillot.En utilisant la fenêtre d’imagerie comme guide, déplacez la source d’histotripsie à l’extrémité proximale du caillot, par rapport au réservoir. Pour déterminer le chemin d’insonation le long de la longueur du caillot, définissez des points de cheminement le long de la longueur du caillot par incréments de cinq millimètres. Avant de finaliser chaque waypoint, les impulsions d’essai au feu proviennent de la source d’histotripsie avec les mêmes paramètres d’insonation que ceux démontrés, mais avec l’exposition globale réduite à 10 impulsions totales.À chaque waypoint, enregistrez les positions du moteur à l’aide des commandes désignées par le fabricant. Pour traiter le caillot sur toute sa longueur en fonction du trajet défini à l’étape de prétraitement, réglez la pompe à seringue à 0,65 millilitre par minute et attendez que le ménisque du plasma bouge. Interpolez le chemin de traitement avec des étapes intermédiaires entre les points de cheminement établis avec une taille de pas fixe et utilisez les positionneurs pour déplacer la source d’histotripsie à chaque emplacement de chemin, en utilisant les paramètres d’insonation définis à l’origine.Ensuite, créez un script pour configurer le réseau d’imagerie afin d’acquérir une image en mode B du caillot et du vaisseau modèle quelques secondes avant l’application de l’impulsion d’histotripsie à chaque emplacement. Appliquez ensuite l’impulsion d’histotripsie à chaque waypoint, en acquérant les émissions acoustiques dans le script pour former des images de cavitation passive après l’analyse. Utilisez la fenêtre d’imagerie pour imager l’activité de la bulle pendant l’application de l’impulsion d’histotripsie à chaque emplacement de chemin.Après l’analyse, soulevez manuellement le récipient modèle hors du réservoir d’eau pour drainer le perfusate par gravité et utilisez la pompe à seringue pour extraire la solution plasmatique du canal d’écoulement afin de permettre la collecte de l’ensemble du perfusate dans un petit bécher. Débranchez le récipient modèle et retirez le caillot. Ensuite, essuyez le caillot avec des tissus de laboratoire et pesez le caillot pour évaluer la perte de masse du caillot.Lors de l’application d’une tension suffisante à la source d’histotripsie, un nuage de bulles est généré dans la région focale du transducteur et visualisé par imagerie ultrasonore. La position focale est définie comme le centre du nuage de bulles. Ce perfusate témoin d’un caillot exposé au plasma seul, et ce perfusate d’un caillot traité par lysotripsie ont été utilisés pour évaluer la teneur en hémoglobine et en D-dimère comme démontré.La variabilité de la concentration d’hémoglobine peut être quantifiée par absorption optique. Ici, un caillot peut être visualisé dans un vaisseau modèle via l’imagerie en mode B avant l’exposition à l’histotripsie afin de déterminer la position du caillot pour la segmentation de l’image de cavitation passive. Comme le confirme cette image de cavitation passive co-enregistrée avec l’image en mode B du caillot, l’énergie acoustique est contenue principalement dans le caillot pendant l’exposition à l’histotripsie.Dans les échantillons exposés à l’histotripsie, la perturbation est principalement limitée au centre du caillot, ce qui correspond aux emplacements observés de l’activité des bulles suivis par imagerie par cavitation passive. Avec l’ajout de lytique, la perte de masse se produit également dans les régions plus proches de la périphérie du caillot. Alternativement, des liposomes écogéniques contenant de la rt-PA peuvent être utilisés à la place de l’administration systémique de rt-PA pour permettre l’évaluation de l’administration ciblée de médicaments au caillot.La lysotripsie offre une approche alternative non invasive au traitement de nombreuses maladies. Ce protocole in vitro permet d’évaluer l’efficacité du traitement et son succès potentiel dans l’application in vivo.

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