Name: an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00
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이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 투자되었다, 그랜트 R01HL13334. 저자들은 드라킨 박사의 분석과 빅토르 볼렌 박사의 프로토콜 설계 지원에 도움을 준 케빈 하워스 박사에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자들은 또한 아담 맥스웰 박사에게 히스토트립소스 설계에 대한 그의 지침에 감사드립니다.

여기에 제시 된 결과에 대 한, 정맥 인간의 혈액 지역 내부 검토 위원회에서 승인 후 혈전을 형성 하기 위해 그려진 (IRB #19-1300) 자원 봉사 기부자에 의해 제공 된 서면 통보 된 동의24. 이 섹션에서는 lysotripsy 효능을 평가하기 위한 설계 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 프로토콜은 볼렌 외24에의해 이전 작품을 기반으로합니다.
1. 혈전 모델링...

제안된 프로토콜은 리소트립시의 치료 효능을 정량화하는 모델을 제시한다. 주요 세부 사항에 대해 논의되었지만 이 프로토콜의 성공을 고려해야 할 중요한 측면이 있습니다. rt-PA의 효소 활성은 아레니우스 온도의존30을가지고 있습니다. 온도는 또한 물과 조직의 소리 속도에 기여하는 요인이며, 온도의 변화는 초점 영역 지오메트리의 사소한 변화를 일으킬 수 있습니다. 따라?...

혈전증은순환을방해하는 건강한 혈관에서 응고 형성의 상태입니다1,2. 정맥 혈전 색전증은 미국에서 375,000-425,000 의 경우와 함께, 7-100 억 달러의 연간 의료 비용을 가지고3. 폐 색전증은 폐 동맥의 방해이며 정맥 혈전 색전증의 가장 심각한 결과입니다. 폐 방해의 주요 근원은 깊은 정맥 혈전, 주로 일리오페랄 정맥 세그먼트4,5,6에서. 깊은 정맥 혈전증 (DVT)은 폐 장애물 외에 내재 된 후유증을 가지고 있으며, 통증, 붓기, 다리 궤양 및 사지 절단7,8,9의장기 합병증을 앓고 있습니다. 중요한 장애물의 경우 카테터 지향 혈전용성(CDT)은 선박재방수(10)의최전선 접근법이다. CDT의 결과는 혈전 나이, 위치, 크기, 조성, 병인학 및 환자 위험 범주11을포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 더욱이, CDT는 혈관 손상, 감염, 출혈 합병증 및 긴 치료 시간10과연관된다. 차세대 장치는 기계적 혈전 절제술과 혈전성(즉, 약동기계 혈전절제술)을 12,13로결합하는 것을 목표로 한다. 이러한 장치의 사용은 감소 된 출혈 합병증으로 이어지는 용액 복용량을 낮추고, CDT에 비해 치료 시간12,13,14 단축. 이러한 장치는 여전히 출혈 성 부작용및 만성 혈전15의불완전한 제거의 문제를 유지합니다. 따라서 낮은 출혈 합병증으로 혈전을 완전히 제거 할 수있는 보조 전략이 필요합니다.
한 가지 잠재적인 접근법은 히스토트립시 보조 혈전용 치료이며, 리소트립시라고 합니다. 히스토트립증은조직(16)에서기포 구름을 핵에 심기 위해 집중초음파를 사용하는 비침습적 치료 양식이다. 버블 활성은 외인성 핵을 통해서가 아니라혈전(17,18)을포함한 조직에 내재된 핵을 활성화하기에 충분한 장력을 가진 초음파 펄스의 적용에 의해 생성된다. 기포 구름의 기계적 진동은 응고에 변형을 부여하여 구조를 세포이물질(19)으로붕괴시한다. 히스토트립시 버블 활성은 생체 내 및 시험관 내20,21,22모두에서 후퇴및 폐개되지 않은 혈전의 효과적인 분해를 제공한다. 선행 연구는23,24 히스토트립티와 리틱 재조합 조직 형 플라스미노겐 활성제 (rt-PA)의 조합이 단독으로 또는 히스토트립시에 비해 치료 효능을 크게 증가시킨다는 것을 입증하였다. 히스토트립시 버블 활동과 관련된 두 가지 주요 메커니즘이 향상된 치료 효능에 책임이 있다는 가설이 있습니다: 1) 향상된 용액 전달로 인한 세혈성 분석 증가, 그리고 2) 혈전 내의 적혈구의 용혈. 혈전 질량의 대부분은적혈구(24)로구성되며, 따라서 적혈구 분해를 추적하는 것은 시료의 절제에 좋은 대리이다. 다른 형성된 응고 요소는 히스토트립시 버블 활성하에서 분해될 가능성이 있지만 이 프로토콜에서는 고려되지 않습니다.
여기, 리소트립시와 시험관내에서 DVT를 치료하는 벤치탑 접근 방식이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 히스토트립소스의 중요한 작동 매개 변수, 치료 효능 평가 및 이미지 지침을 설명합니다. 이 프로토콜에는 일리오페랄 정맥 세그먼트를 모방하기 위한 흐름 채널을 설계하고 인간 전체 혈전을 제조하는 것이 포함됩니다. 실험 절차는 유동 채널에 배치된 응고를 따라 히스토트립시 노출을 달성하기 위해 히스토트립시 소스 및 이미징 어레이의 위치를 간략하게 설명합니다. 응고 중단을 달성하고 오프 타겟 버블 활동을 최소화하기 위한 관련 음화 매개 변수가 정의됩니다. 기포 활성의 지도 및 평가를 위한 초음파 영상의 사용은24를도시한다. 응고 질량 손실, D-디머(fibrinolysis), 헤모글로빈(혈전)과 같은 치료 효능을 정량화하는 메트릭은23,24,25,26,27로윤곽을 비운다. 전반적으로, 연구 결과는 DVT를 취급하기 위하여 lysotripsy의 효험을 실행하고 평가하기 위한 효과적인 수단을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbing sheets</td>
			<td>Precision acoustics</td>
			<td>F28-SMALL-M</td>
			<td>300mm x 300 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Pasteur pippettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820A</td>
			<td>14.6 cm length, 2 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drabkin&#39;s assay</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5941-6VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draw syringe</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter bags</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5162K111</td>
			<td>Remove particle size upto 1 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow channel tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5154K25</td>
			<td>Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8&#34;, Inner diameter: 1/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating elements</td>
			<td>Won Brothers</td>
			<td>HT 300 Titanium</td>
			<td>Titanium rods placed at the bottom of tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging array</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td>L11-5v</td>
			<td>128 element with sensitivity from -55 to -49 dB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5234K98</td>
			<td>6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Nanopure Diamond</td>
			<td>ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Vitalant</td>
			<td>4PF000</td>
			<td>Plasma frozen within 24 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo HST Plate Reader</td>
			<td>For haemoglobin quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe cover</td>
			<td>Civco</td>
			<td>610-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programming platform</td>
			<td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)</td>
			<td>Genentech</td>
			<td>Activase</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-74900-20</td>
			<td>pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>In-house customized</td>
			<td></td>
			<td>Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound scaning system</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td></td>
			<td>Vantage Research Ultrasound System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water tank</td>
			<td>Advanced acrylics</td>
			<td>C133</td>
			<td>14 x 14 x 12, 1/2&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug

깊은 정맥 혈전증 (DVT)은 글로벌 건강 문제입니다. 중요한 장애물을 위한 혈관 재냉화를 달성하기 위한 1차적인 접근은 카테터 지향 혈전성 (CDT)입니다. 가성 부작용및 CDT와 관련되었던 긴 처리 시간을 완화하기 위하여는, 보조및 대체 접근은 개발되고 있습니다. 이러한 접근 방법 중 하나는 히스토트립시, 거품 구름 핵형성을 통해 조직을 축산하는 집중초음파 요법이다. 전 임상 연구는 혈전 분해를 위한 히스토트립시와 혈전 분해 사이의 강한 시너지 효과를 입증했습니다. 이 보고서는 히스토트립시 보조 혈전용 요법 또는 리소트립시의 효능을 평가하는 벤치탑 방법을 간략하게 설명합니다.
신선한 인간 정맥 혈액에서 제조 된 혈전은 그 크기와 아쿠스토 기계적 특성이 일로페모랄 정맥을 모방 흐름 채널로 도입되었다. 채널은 플라즈마와 리틱 재조합 조직 형 플라스미노겐 활성제로 침투하였다. 기포 구름은 대퇴 정맥 혈전의 치료를 위해 설계된 집중 초음파 소스와 응고에서 생성되었다. 전동 포지셔너는 응고 길이를 따라 소스 포커스를 변환하는 데 사용되었습니다. 각 음광 위치에서 버블 클라우드의 음향 방출이 수동적으로 기록되고 빔을 형성하여 수동 캐비테이션 이미지를 생성했습니다. 치료 효능을 측정하는 메트릭에는 응고 질량 손실(전체 치료 효능) 및 퍼퓸에서 D-디머(fibrinolysis) 및 헤모글로빈(혈전)의 농도가 포함되었다. 생체 외 디자인에 이에 제한이 있다, 생체 내 부작용 또는 혈전 lyses로 유량의 동적 변화를 평가 하는 수단의 부족을 포함 하 여. 전반적으로, 설정은 DVT를 취급하기 위하여 히스토트립시 기지를 둔 전략의 효험을 평가하는 효과적인 방법을 제공합니다.

이 연구에서 설명된 프로토콜은 정맥 응고 모델링, 응고 중단을 위한 리소트립시 및 DVT의 체외 설정에서 초음파 이미징의 세부 사항을 강조합니다. 채택된 절차는 rt-PA 및 히스토트립버블 클라우드 활동의 결합된 효과로 인해 응고 중단을 평가하는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 벤치탑 설정은 정맥 일리오페랄덕 정맥의 특성을 모방하도록 설계되었습니다. 도 1A는 일리오페...

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An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

히스토트립시 에이드 리시 전달 또는 리소트립시 심부 정맥 혈전증 치료를 위해 개발 중입니다. 시험관 내 절차는 이 조합 치료의 효험을 평가하기 위하여 여기에서 제출됩니다. 응고 모델에 대한 주요 프로토콜, 이미지 지침 및 치료 효능 평가에 대해 설명합니다.

히스토트립시 및 리틱 약물의 혈전용 효능을 측정하는 체외 시스템

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

이 프로토콜은 히스토트립증 보조 혈전용 요법 또는 리소트립시, 중요한 심부 정맥 혈전증 치료에 대한 대체 비 침습적 접근 방식의 효능 및 작용 메커니즘을 평가하기위한 벤치탑 방법을 제공합니다. 이 기술은 향상된 용액 전달 및 혈전 내의 적혈구의 용혈성으로 인해 증가 된 세혈을 통해 양방향 효과를 가지기 위해 거품 활동을 사용합니다. 깊은 정맥 혈전증 치료에 이 벤치탑 접근은 혈전의 모델링을 용이하게, lysotripsy와 치료, 치료 중 동시 이미징.버블 클라우드 생성, 치료 계획 및 이미지 지침은 신장 및 간 종양과 같은 다른 질병의 체외 히스토트립티 기반 치료법을 조사하는 데 더 사용될 수 있습니다. 히스토트립시 소스를 설정하려면 소스를 동력 포지셔닝 시스템에 장착합니다. 이미징 어레이를 프로브 커버로 덮고 히스토트립시 소스의 조리개에서 배열을 동축으로 수정합니다.이미징 어레이를 초음파 스캐닝 시스템에 연결하고 탱크의 히스토트립시 소스 및 이미징 어레이를 완전히 침수합니다. 주사기를 사용하여 기포를 부드럽게 제거하고 이미징 어레이와 스캐너를 사용하여 초당 20 프레임에서 탈가스 B 모드 물 이미지를 얻습니다. 이미지를 획득하는 동안, 버블 구름이 이미지 창의 중앙에 대략 위치될 때까지 공초점 트랜스듀서 개구부 내부의 이미징 어레이의 위치를 조정하고 이미징 창에서 검출된 초점 위치를 기록한다.그런 다음 인소네이션을 중단하고 히스토트립시 소스에 가해지는 전압을 0으로 설정합니다. 분석을 위해 응고를 준비하려면 펜치를 사용하여 응고가 들어있는 파이펫의 밀봉 된 끝을 자르고 응고와 혈청이 페트리 접시로 밀어 넣습니다. 메스를 사용하여 혈전을 1센티미터 길이로 자르고 클리닝 와이프를 사용하여 절단 섹션을 부드럽게 얼룩져 여분의 유체를 제거하십시오.핀셋을 사용하여 응고 의 섹션을 스케일에 조심스럽게 배치하고 무게를 기록하십시오. 다음으로, 탈가스역 삼투압 물 탱크에서 유동 채널을 수동으로 올리고 채널에서 모델 용기를 제거한다. 핀셋을 사용하여 혈전을 손상시키지 않고 모형 용기에 응고를 조심스럽게 배치하고 선박을 유량 채널에 부착하십시오.저수지에 비해 스테이지의 근접 끝이 하천측에 비해 낮은 탱크내의 유동 채널을 낮추고, 피펫을 사용하여 37°C의 30 마이크로리터를 저수지에 따뜻하게 하였다. 급하 36도 이상에 도달할 때까지 물 탱크의 온도를 모니터링하고 파이펫을 사용하여 플라즈마 저수지에 80.4 마이크로그램의 rt-PA를 추가합니다. 유동 채널을 프라임하려면 주사기 펌프를 사용하여 모델 용기가 채워지을 때까지 저수지에서 채널로 플라즈마를 끌어들입니다.그런 다음 모델 용기를 수동으로 레벨화하여 이미징 창 내에서 볼 수 있듯이 모델 용기에 기포가 존재하지 않도록 합니다. 혈전 길이를 따라 균일한 히스토트립스 노출을 위한 히스토트립소스 및 이미징 어레이의 경로를 계획하려면 이미징 스크립트를 사용하여 전동 포지셔터를 사용하여 응고 길이와 평행한 이미징 어레이를 정렬하고 용기에 기포가 존재하지 않는지 확인합니다. 이미징 평면이 응고의 단면과 평행하도록 이미징 어레이를 정렬하기 위해 전동 포지셔터를 사용합니다.이미징 창을 가이드로 사용하여, 히스토트립시 소스를 저수지에 비해 혈전의 근접 끝으로 이동합니다. 응고 길이를 따라 인네이션 경로를 결정하려면 응고 길이를 따라 웨이점을 5밀리미터 단위로 설정합니다. 각 웨이포인트를 마무리하기 전에, 소화소트립시 소스에서 발사 테스트 펄스는 입증된 것과 동일한 인소네이션 파라미터를 가지고 있지만, 전체 노출은 총 10펄스로 감소합니다.각 웨이포인트에서 제조업체에서 지정한 명령을 사용하여 모터 위치를 저장합니다. 전처리 단계에 정의된 경로에 따라 응고를 처리하려면 주사기 펌프를 분당 0.65 밀리리터로 설정하고 플라즈마의 반월상연연증이 움직일 때까지 기다립니다. 설정된 웨이포인트 사이의 중간 단계로 처리 경로를 고정된 스텝 크기로 보간하고, 포지셔너를 사용하여 원래 설정된 인음매개변수를 사용하여 각 경로 위치에서 히스토트립시 소스를 이동한다.다음으로 각 위치에서 히스토트립시 펄스를 적용하기 몇 초 전에 응고 및 모델 용기의 B 모드 이미지를 획득하도록 이미징 배열을 설정하는 스크립트를 만듭니다. 그런 다음 각 웨이포인트에 히스토트립시 펄스를 적용하여 스크립트의 음향 방출을 획득하여 분석 후 수동 캐비테이션 이미지를 형성합니다. 각 경로 위치에서 히스토트립시 펄스를 적용하는 동안 이미징 창을 사용하여 거품 활성을 이미지화합니다.분석 후, 수동으로 물 탱크에서 모델 용기를 올려 중력을 통해 배설물을 배출하고, 주사기 펌프를 사용하여 유동 채널에서 플라즈마 용액을 끌어서 작은 비커에서 전체 난투질의 수집을 허용합니다. 모델 용기를 분리하고 응고를 제거합니다. 그런 다음 실험실 조직으로 응고를 닦고 응고를 계량하여 응고 질량 손실을 평가합니다.히스토트립시 소스에 충분한 전압을 적용하면 트랜스듀서의 초점 영역에서 버블 구름이 생성되고 초음파 이미징을 통해 시각화됩니다. 초점 위치는 버블 클라우드의 중심으로 정의됩니다. 이러한 제어는 플라즈마에만 노출된 응고의 난투를 하고, 리소트립시 처리 된 응고의 이러한 난투는 입증된 바와 같이 헤모글로빈 및 D-dimer 함량을 평가하는 데 사용되었다.헤모글로빈 농도의 가변성은 광학 흡광도에 의해 정량화될 수 있다. 여기서, 응고는 수동 캐비테이션 영상의 분할을 위한 응고 위치를 결정하기 전에 B 모드 이미징을 통해 모델 용기 내에서 시각화될 수 있다. 응고의 B 모드 이미지와 공동 등록된 이 수동 캐비테이션 이미지가 확인됨에 따라, 음향 에너지는 히스토트립시 노출 시 주로 응고 내에 포함된다.히스토트립시에 노출된 샘플에서, 중단은 수동 캐비테이션 이미징을 통해 추적되는 거품 활동의 관찰된 위치와 일치하는 응고 센터로 주로 제한됩니다. lytic의 첨가와 함께, 질량 손실은 또한 혈전의 주변에 가까운 지역에서 발생합니다. 대안적으로, rt-PA를 함유하는 에코제닉 리포솜은 혈전으로 표적 약물 전달의 평가를 허용하기 위해 전신 rt-PA 전달 대신 사용될 수 있다.Lysotripsy는 많은 질병의 치료에 대한 대체 비 침습적 인 접근 방식을 제공합니다. 이 시험관 내 프로토콜은 치료의 효능과 생체 내 응용 분야에서의 잠재적 성공의 평가를 가능하게합니다.

Research

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Bioengineering

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연구

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<em&gt; 체외</em&gt; 효소 분석은 갈륨 (III) 및 H에 의해 전사 억제를 측정하기 위해<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15 트리스 (펜타 플루오로 페닐) corroles

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