Name: an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Forfatterne vil takke Dr. Kevin Haworth for å ha hjulpet til med Drabkins analyse og Dr. Viktor Bollen for hans støtte til å designe protokollen. Forfatterne er også takknemlige til Dr. Adam Maxwell for hans veiledning om å designe histotripsy kilden.

For resultatene som presenteres her, ble venøst menneskelig blod trukket for å danne blodpropp etter godkjenning fra det lokale interne gjennomgangsstyret (IRB # 19-1300) og skriftlig informert samtykke gitt av frivillige givere24. Denne delen skisserer en utformingsprotokoll for å vurdere lysotripsy effekt. Protokollen er basert på et tidligere verk av Bollen et al.24.
1. Clot modellering
MERK: Forbered blodproppene...

Den foreslåtte protokollen presenterer en modell for å kvantifisere behandlingseffekten av lysotripsy. Selv om nøkkeldetaljene har blitt diskutert, er det visse kritiske aspekter å vurdere for å lykkes med denne protokollen. Den enzymatiske aktiviteten til rt-PA har en Arrhenius temperaturavhengighet30. Temperatur er også en medvirkende årsak til lydens hastighet i vann og vev, og variasjoner i temperatur kan forårsake mindre endringer i fokalsonegeometrien. Dermed bør vanntemperaturen re...

Trombose er tilstanden til blodproppdannelse i et ellers sunt blodkar som hindrersirkulasjon 1,2. Venøs tromboembolisme har en årlig helsekostnad på $ 7-10 milliarder, med 375,000-425,000 tilfeller i USA3. Lungeemboli er hindringen av lungearterien og er den mest alvorlige konsekvensen av venøs tromboembolisme. Den primære kilden til lungeobstruksjon er dyp venetrom, hovedsakelig fra iliofemorale venøse segmenter4,5,6. Dyp venetrombose (DVT) har iboende oppfølgere i tillegg til lungeobstruksjoner, med langsiktige komplikasjoner som resulterer i smerte, hevelse, bensår og lemmer amputasjoner7,8,9. For kritiske hindringer er kateter rettet trombolytikk (CDT) frontlinjetilnærmingen for karrekanalisering10. Utfallet av CDT avhenger av en rekke faktorer, inkludert trombealder, plassering, størrelse, sammensetning, etiologi og pasientrisikokategori11. Videre er CDT forbundet med vaskulær skade, infeksjoner, blødningskomplikasjoner og lang behandlingstid10. Neste generasjons enheter tar sikte på å kombinere mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmacomechanical trombektomi)12,13. Bruk av disse enhetene senker lytisk dosering som fører til reduserte blødningskomplikasjoner, og forkortet behandlingstid12,13,14 sammenlignet med CDT. Disse enhetene beholder fortsatt problemer med hemorragiske bivirkninger og ufullstendig fjerning av kronisk trombe15. En adjuvant strategi er dermed nødvendig som kan fjerne tromben helt med lavere blødningskomplikasjoner.
En potensiell tilnærming er histotripsy-støttet trombolytisk behandling, referert til som lysotripsy. Histotripsy er en ikke-invasiv behandlingsmodalitet som bruker fokusert ultralyd for å nukleere bobleskyer i vev16. Bobleaktivitet genereres ikke via eksogene kjerner, men ved bruk av ultralydpulser med tilstrekkelig spenning til å aktivere kjerner iboende i vev, inkludert blodpropp17,18. Den mekaniske svingningen av bobleskyen gir belastning til blodpropp, og oppløser strukturen i acellulært rusk19. Histotripsy boble aktivitet gir effektiv nedbrytning av trukket og uberørt blodpropp både in vivo og in vitro20,21,22. Tidligere studier har23,24 vist at kombinasjonen av histotripsy og lytisk rekombinant vev-type plasminogen aktivator (rt-PA) øker behandlingseffekten betydelig sammenlignet med lytisk alene eller histotripsy alene. Det er hypoteset at to primære mekanismer forbundet med histotripsy bobleaktivitet er ansvarlig for forbedret behandlingseffekt: 1) økt fibrinolyse på grunn av forbedret lytisk levering, og 2) hemolyse av røde blodlegemer i blodpropp. Hoveddelen av blodproppmassen består av røde blodlegemer24, og derfor er sporing av erytrocyttforringelse en god surrogat for ablasjon av prøven. Andre dannede blodproppelementer er også sannsynligvis oppløst under histotripsy bobleaktivitet, men vurderes ikke i denne protokollen.
Her er en stasjonær tilnærming for å behandle DVT in vitro med lysotripsy skissert. Protokollen beskriver kritiske driftsparametere for histotripsykilden, vurdering av behandlingseffekt og bildeveiledning. Protokollen inkluderer å designe en strømningskanal for å etterligne et iliofemoralt venøst segment og produsere menneskelige hele blodpropper. Den eksperimentelle prosedyren skisserer plasseringen av histotripsy-kilden og bildebehandlingsmatrisen for å oppnå histotripsyeksponering langs blodpropp plassert i strømningskanalen. Relevante insonasjonsparametere for å oppnå blodproppavbrudd og minimere off-target bobleaktivitet er definert. Bruk av ultralydavbildning for veiledning og vurdering av bobleaktivitet er illustrert24. Målinger for å kvantifisere behandlingseffekten som blodproppmassetap, D-dimer (fibrinolyse) og hemoglobin (hemolyse) er skissert23,24,25,26,27. Totalt sett gir studien et effektivt middel for å utføre og vurdere effekten av lysotripsy for å behandle DVT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbing sheets</td>
			<td>Precision acoustics</td>
			<td>F28-SMALL-M</td>
			<td>300mm x 300 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Pasteur pippettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820A</td>
			<td>14.6 cm length, 2 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drabkin&#39;s assay</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5941-6VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draw syringe</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter bags</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5162K111</td>
			<td>Remove particle size upto 1 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow channel tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5154K25</td>
			<td>Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8&#34;, Inner diameter: 1/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating elements</td>
			<td>Won Brothers</td>
			<td>HT 300 Titanium</td>
			<td>Titanium rods placed at the bottom of tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging array</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td>L11-5v</td>
			<td>128 element with sensitivity from -55 to -49 dB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5234K98</td>
			<td>6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Nanopure Diamond</td>
			<td>ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Vitalant</td>
			<td>4PF000</td>
			<td>Plasma frozen within 24 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo HST Plate Reader</td>
			<td>For haemoglobin quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe cover</td>
			<td>Civco</td>
			<td>610-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programming platform</td>
			<td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)</td>
			<td>Genentech</td>
			<td>Activase</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-74900-20</td>
			<td>pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>In-house customized</td>
			<td></td>
			<td>Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound scaning system</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td></td>
			<td>Vantage Research Ultrasound System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water tank</td>
			<td>Advanced acrylics</td>
			<td>C133</td>
			<td>14 x 14 x 12, 1/2&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug

Dyp venetrombose (DVT) er et globalt helseproblem. Den primære tilnærmingen for å oppnå karrekanalisering for kritiske hindringer er kateterstyrt trombolytikk (CDT). For å redusere kaustiske bivirkninger og den lange behandlingstiden forbundet med CDT, er adjuvans og alternative tilnærminger under utvikling. En slik tilnærming er histotripsy, en fokusert ultralydbehandling for å fyre opp vev via bobleskykjernedannelse. Prekliniske studier har vist sterk synergi mellom histotripsy og trombolytika for blodpropp nedbrytning. Denne rapporten skisserer en benkeplatemetode for å vurdere effekten av histotripsy-støttet trombolytisk terapi, eller lysotripsy.
Blodpropper produsert av friskt menneskelig venøst blod ble introdusert i en strømningskanal hvis dimensjoner og acousto-mekaniske egenskaper etterligner en iliofemoral vene. Kanalen ble perfundert med plasma og den lytiske rekombinante vevs-type plasminogenaktivatoren. Bobleskyer ble generert i blodpropp med en fokusert ultralydkilde designet for behandling av lår venøse blodpropper. Motoriserte posisjoner ble brukt til å oversette kildefokuset langs blodpropplengden. På hvert insonasjonssted ble akustiske utslipp fra bobleskyen passivt registrert, og stråleformet for å generere passive kavitasjonsbilder. Målinger for å måle behandlingseffekten inkluderte blodproppmassetap (total behandlingseffekt), og konsentrasjonene av D-dimer (fibrinolyse) og hemoglobin (hemolyse) i perfusatet. Det er begrensninger i denne in vitro design, inkludert mangel på midler til å vurdere in vivo bivirkninger eller dynamiske endringer i strømningshastigheten som blodpropp lyses. Totalt sett gir oppsettet en effektiv metode for å vurdere effekten av histotripsy-baserte strategier for å behandle DVT.

Protokollen som er skissert i denne studien fremhever detaljene i venøs blodproppmodellering, lysotripsy for blodproppforstyrrelser og ultralydavbildning i et in vitro-oppsett av DVT. Den vedtatte prosedyren demonstrerer trinnene som er nødvendige for å vurdere blodproppforstyrrelser på grunn av de kombinerte effektene av rt-PA og histotripsy boble skyaktivitet. Benkeplaten ble designet for å etterligne egenskapene til en venøs iliofemoral vene. Figur 1A viser et modellfartøy som har ...

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Histotripsy-støttet lytisk levering eller lysotripsy er under utvikling for behandling av dyp venetrombose. En in vitro-prosedyre presenteres her for å vurdere effekten av denne kombinasjonsterapien. Viktige protokoller for blodproppmodellen, bildeveiledningen og vurderingen av behandlingseffekten diskuteres.

Et in vitro-system for å måle trombolytisk effekt av histotripsy og et lytisk legemiddel

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Denne protokollen gir en stasjonær metode for å vurdere effekten og virkningsmekanismene til histotripsyassistert trombolytisk terapi eller lysotripsy, en alternativ ikke-invasiv tilnærming for behandling av kritisk dyp venetrombose. Denne teknikken bruker bobleaktivitet for å ha en toveis effekt gjennom økt fibrinolyse på grunn av en forbedret lytisk levering og hemolyse av røde blodlegemer i blodpropp. Denne benkplaten tilnærming til behandling av dyp venetrombose letter modellering av blodpropp, behandling med lysotripsy, og samtidig avbildning under behandling.Bobleskygenerering, behandlingsplanlegging og bildeveiledning kan videre brukes til å undersøke in vitro histotripsy-baserte behandlinger av andre sykdommer, for eksempel nyre- og leversvulster. For å sette opp histotripsy-kilden, monter kilden på et motorisert posisjoneringssystem. Dekk bildebehandlingsmatrisen med et sondedeksel og fest matrisen koaksialt i blenderåpningen til histotripsy-kilden.Koble bildebehandlingsrekken til et ultralydskanningssystem og senk den histotripsy kilden og bildebehandlingsrekken helt ned i tanken. Bruk en sprøyte til forsiktig å fjerne eventuelle luftbobler og bruke bildebehandlingsmatrisen og skanneren til å skaffe avgassede B-modus vannbilder med 20 bilder per sekund. Når du anskaffer bildene, justerer du plasseringen av bildetabellen inne i den konfokale svingeråpningen til bobleskyen er plassert omtrent midt i bildevinduet og registrerer den oppdagede brennvidden i bildevinduet.Avslutt deretter insonasjonen og sett spenningen på histotripsykilden til null. For å forberede en blodpropp for analyse, bruk tanger for å kutte den forseglede enden av en pipette som inneholder en blodpropp og la blodpropp og serum gli inn i en petriskål. Bruk en skalpell til å kutte blodpropp til en centimeter lengde og bruk en rengjøringsserviett for å forsiktig flekke kuttdelen for å fjerne overflødig væske.Bruk pinsett for å forsiktig plassere delen av blodpropp på en skala og registrere vekten. Deretter hever du strømningskanalen manuelt ut av en avgasset omvendt osmosevanntank og fjerner modellbeholderen fra kanalen. Bruk pinsett for å forsiktig plassere blodpropp i modellbeholderen uten å skade blodpropp og feste fartøyet til strømningskanalen.Senk strømningskanalen inn i tanken slik at den proksimale enden av scenen i forhold til reservoaret er lav sammenlignet med den distale siden, og bruk en pipette for å legge til 30 mikroliter 37 grader Celsius oppvarmet plasma til reservoaret. Overvåk temperaturen på vanntanken til den når minst 36 grader Celsius, og bruk en pipette for å legge til 80,4 mikrogram rt-PA i plasmareservoaret. For å klargjøre strømningskanalen, bruk en sprøytepumpe til å trekke plasma fra reservoaret inn i kanalen til modellfartøyet er fylt.Deretter utjevner du modellfartøyet manuelt for å sikre at det ikke finnes luftbobler i modellfartøyet, som vist i bildevinduet. Hvis du vil planlegge en bane for histotripsy-kilden og bildebehandlingsmatrisen for en jevn histotripsyeksponering langs blodpropplengden, bruker du bildeskriptet til å bruke de motoriserte posisjoneringsenhetene til å justere bildebehandlingsmatrisen parallelt med lengden på blodproppen og bekrefte at det ikke finnes luftbobler i fartøyet. Bruk de motoriserte posisjoneringsenhetene til å justere bildebehandlingsmatrisen slik at bildeplanet er parallelt med tverrsnittet av blodproppen.Bruk bildevinduet som en guide, flytt histotripsykilden til den proksimale enden av blodpropp, i forhold til reservoaret. For å bestemme insonasjonsbanen langs blodpropplengden, angi veipunkter langs lengden på blodpropp i fem millimeter intervaller. Før du fullfører hvert veipunkt, pulserer branntest fra histotripsy-kilden med de samme insonasjonsparametrene som vist, men med den totale eksponeringen redusert til 10 totale pulser.På hvert veipunkt lagrer du motorposisjonene ved hjelp av kommandoene utpekt av produsenten. For å behandle blodpropp langs lengden i henhold til banen som er definert i forbehandlingstrinnet, sett sprøytepumpen til 0,65 milliliter per minutt, og vent på at menisken i plasmaet skal bevege seg. Interpoler behandlingsbanen med mellomliggende trinn mellom de etablerte veipunktene med en fast trinnstørrelse, og bruk posisjoneringsstillerne til å flytte histotripsykilden ved hver baneplassering ved hjelp av de opprinnelig angitte insonasjonsparameterne.Deretter oppretter du et skript for å angi bildematrisen for å få et B-modusbilde av blodpropp- og modellfartøyet noen sekunder før anvendelsen av histotripsy-pulsen på hvert sted. Bruk deretter histotripsypulsen på hvert veipunkt, og skaff de akustiske utslippene i manuset for å danne passive kavitasjonsbilder etter analysen. Bruk bildevinduet til å se for deg bobleaktiviteten under påføringen av histotripsypulsen på hvert banested.Etter analysen, løft modellfartøyet manuelt ut av vanntanken for å tømme perfusatet via tyngdekraften, og bruk sprøytepumpen til å trekke plasmaløsningen fra strømningskanalen for å tillate innsamling av hele perfusate i et lite beger. Koble fra modellbeholderen og fjern blodpropp. Tørk deretter koaguleringen med laboratorievev og vei blodpropp for å vurdere blodpropp massetapet.Ved påføring av tilstrekkelig spenning til histotripsykilden genereres en boblesky i svingerens fokusområde og visualiseres via ultralydavbildning. Fokusposisjonen er definert som midten av bobleskyen. Denne kontrollen perfusate av en blodpropp utsatt for plasma alene, og dette perfusate av en lysotripsy behandlet blodpropp ble brukt til å vurdere hemoglobin og D-dimer innhold som demonstrert.Variasjonen i hemoglobinkonsentrasjonen kan kvantifiseres ved optisk absorbans. Her kan en blodpropp visualiseres i et modellfartøy via B-modusavbildning før histotripsyeksponering for å bestemme blodproppposisjonen for segmentering av det passive kavitasjonsbildet. Som dette passive kavitasjonsbildet som er registrert sammen med B-modusbildet av blodpropp bekrefter, er den akustiske energien hovedsakelig inneholdt i blodpropp under histotripsyeksponeringen.I prøver utsatt for histotripsy er forstyrrelser først og fremst begrenset til blodproppsenteret, i samsvar med de observerte stedene for bobleaktivitet sporet via passiv kavitasjonsavbildning. Med tilsetning av lytisk forekommer massetap også i regioner nærmere periferien av blodpropp. Alternativt kan økogene liposomer som inneholder rt-PA brukes i stedet for systemisk rt-PA-levering for å tillate vurdering av målrettet legemiddellevering til blodpropp.Lysotripsy gir en alternativ ikke-invasiv tilnærming til behandling av mange sykdommer. Denne in vitro-protokollen muliggjør vurdering av effekten av behandlingen og dens potensielle suksess i in vivo-applikasjonen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering av en menneskelig 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk Assay å måle transkripsjon Hemming av Gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injeksjon and Drug lastet Supramolecular hydrogel for Lokal kateter Injeksjon i Pig Hjerte

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Bruk av en High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrofluid System for å utvikle muntlige Multi-arter Biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Produksjon av Cancer Cell Spheroids med en vandig To-fase system for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning av electro prosess for å gi tre unike miljøer for en Tri-lag<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En kirurgiske teknikken som grunnlag for i Vivo delvis leveren Engineering i rotte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...