Name: an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, грантом R01HL13334. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Кевина Хауорта за помощь в анализе Драбкина и д-ра Виктора Боллена за его поддержку в разработке протокола. Авторы также благодарны доктору Адаму Максвеллу за его руководство по разработке источника гистотрипсии.

Для результатов, представленных здесь, венозная человеческая кровь была взята с образованием сгустков после одобрения местного внутреннего наблюдательного совета (IRB #19-1300) и письменного информированного согласия, предоставленного добровольными донорами24. В этом разделе...

В предлагаемом протоколе представлена модель для количественной оценки эффективности лечения лизотрипсии. Хотя ключевые детали были обсуждены, есть определенные критические аспекты, которые необходимо учитывать для успеха этого протокола. Ферментативная активность rt-PA имеет темпер...

Тромбоз - это состояние образования сгустка в здоровом кровеносном сосуде, который препятствует циркуляции1,2. Венозная тромбоэмболия имеет ежегодные расходы на здравоохранение в размере 7-10 миллиардов долларов, с 375 000-425 000 случаев в Соединенных Штатах3. Тромбоэмболия легочной артерии является обструкцией легочной артерии и является наиболее серьезным последствием венозной тромбоэмболии. Основным источником легочной обструкции являются тромбы глубоких вен, в первую очередь из подвычелюстных венозных сегментов4,5,6. Тромбоз глубоких вен (ТГВ) имеет врожденные последствия, помимо легочных обструкций, с долгосрочными осложнениями, которые приводят к боли, отеку, изъязвлению ног и ампутациям конечностей7,8,9. Для критических обструкций катетерные тромболитики (CDT) являются фронтальным подходом для реканализации сосудов10. Исход CDT зависит от ряда факторов, включая возраст тромба, местоположение, размер, состав, этиологию и категорию риска пациента11. Кроме того, CDT связан с повреждением сосудов, инфекциями, осложнениями кровотечения и длительным временемлечения 10. Устройства следующего поколения направлены на сочетание механической тромбэктомии с тромболитиками (т.е. фармакомеханической тромбэктомией)12,13. Использование этих устройств снижает литическую дозировку, что приводит к уменьшению осложнений кровотечения и сокращениювремени лечения на 12,13,14 по сравнению с CDT. Эти устройства по-прежнему сохраняют проблемы геморрагических побочных эффектов и неполного удаления хронических тромбов15. Таким образом, необходима адъювантная стратегия, которая может полностью удалить тромб с более низкими осложнениями кровотечения.
Одним из потенциальных подходов является тромблитическое лечение с помощью гистотрипсии, называемое лизотрипсией. Гистотрипсия является неинвазивным методом лечения, который использует сфокусированный ультразвук для нуклеатильных пузырьковых облаков в тканях16. Пузырьковая активность генерируется не через экзогенные ядра, а путем применения ультразвуковых импульсов с достаточным напряжением для активации ядер, присущих тканям, включая сгусток17,18. Механическое колебание пузырькового облака придает деформацию сгустку, распадая структуру на бесклеточные обломки19. Гистотрипсия активности пузырьков обеспечивает эффективную деградацию втянутых и невытягивающихся тромбов как invivo,так и in vitro20,21,22. Предыдущие исследованияпоказали 23,24 продемонстрированные, что сочетание гистотрипсии и литического рекомбинантного активатора плазминогена тканевого типа (rt-PA) значительно повышает эффективность лечения по сравнению с только литическим или только гистотрипсией. Предполагается, что два основных механизма, связанных с активностью пузырьков гистотрипсии, ответственны за повышение эффективности лечения: 1) увеличение фибринолиза из-за усиленной доставки литики и 2) гемолиз эритроцитов в сгустке. Основная часть массы сгустка состоит из эритроцитов24,и, следовательно, отслеживание деградации эритроцитов является хорошим суррогатом для абляции образца. Другие сформированные элементы сгустка также, вероятно, распадаются под действием активности пузырьков гистотрипсии, но не рассматриваются в этом протоколе.
Здесь изложен настольный подход к лечению ТГВ in vitro с помощью лизотрипсии. Протокол описывает критические рабочие параметры источника гистотрипсии, оценку эффективности лечения и руководство по изображению. Протокол включает в себя проектирование протокового канала для имитации подвечерно-бедренного венозного сегмента и производство цельных сгустков крови человека. Экспериментальная процедура описывает позиционирование источника гистотрипсии и массива изображений для достижения экспозиции гистотрипсии вдоль сгустка, помещенного в канал потока. Определены соответствующие параметры инсонации для достижения разрушения сгустка и минимизации нецелевой активности пузырьков. Использование ультразвуковой визуализации для руководства и оценки активности пузырьков проиллюстрировано24. Показатели для количественной оценки эффективности лечения, такие как потеря массы сгустка, D-димер (фибринолиз) и гемоглобин (гемолиз), изложены23,24,25,26,27. В целом, исследование предоставляет эффективные средства для выполнения и оценки эффективности лизотрипсии для лечения ТГВ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbing sheets</td>
			<td>Precision acoustics</td>
			<td>F28-SMALL-M</td>
			<td>300mm x 300 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Pasteur pippettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820A</td>
			<td>14.6 cm length, 2 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drabkin&#39;s assay</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5941-6VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draw syringe</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter bags</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5162K111</td>
			<td>Remove particle size upto 1 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow channel tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5154K25</td>
			<td>Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8&#34;, Inner diameter: 1/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating elements</td>
			<td>Won Brothers</td>
			<td>HT 300 Titanium</td>
			<td>Titanium rods placed at the bottom of tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging array</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td>L11-5v</td>
			<td>128 element with sensitivity from -55 to -49 dB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5234K98</td>
			<td>6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Nanopure Diamond</td>
			<td>ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Vitalant</td>
			<td>4PF000</td>
			<td>Plasma frozen within 24 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo HST Plate Reader</td>
			<td>For haemoglobin quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe cover</td>
			<td>Civco</td>
			<td>610-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programming platform</td>
			<td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)</td>
			<td>Genentech</td>
			<td>Activase</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-74900-20</td>
			<td>pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>In-house customized</td>
			<td></td>
			<td>Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound scaning system</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td></td>
			<td>Vantage Research Ultrasound System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water tank</td>
			<td>Advanced acrylics</td>
			<td>C133</td>
			<td>14 x 14 x 12, 1/2&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug

Тромбоз глубоких вен (ТГВ) является глобальной проблемой здравоохранения. Основным подходом к достижению реканализации сосудов при критических препятствиях являются тромболитики, направленные на катетер (CDT). Для смягчения едких побочных эффектов и длительного времени лечения, связанного с CDT, разрабатываются адъювантные и альтернативные подходы. Одним из таких подходов является гистотрипсия, сфокусированная ультразвуковая терапия для абляции тканей через заромание пузырьковых облаков. Доклинические исследования продемонстрировали сильную синергию между гистотрипсией и тромболитиками для деградации сгустка. В этом отчете описывается настольный метод оценки эффективности тромболитической терапии с помощью гистотрипсии или лизотрипсии.
Сгустки, изготовленные из свежей венозной крови человека, были введены в прототочный канал, размеры и акустомеханические свойства которого имитируют подвычеловечную вену. Канал перфузировали плазмой и литическим рекомбинантным активатором плазминогена тканевого типа. Пузырьковые облака были сгенерированы в сгустке с помощью сфокусированного ультразвукового источника, предназначенного для лечения бедренных венозных сгустков. Моторизованные позиционеры использовались для перевода фокуса источника по длине сгустка. В каждом месте инсонации акустические излучения пузырькового облака пассивно регистрировались и формировались пучком для создания пассивных кавитационных изображений. Показатели для оценки эффективности лечения включали потерю массы сгустка (общая эффективность лечения) и концентрации D-димера (фибринолиз) и гемоглобина (гемолиз) в перфузате. Существуют ограничения для этой конструкции in vitro, в том числе отсутствие средств для оценки побочных эффектов in vivo или динамических изменений скорости потока по мере того, как сгусток лизируется. В целом, установка обеспечивает эффективный метод оценки эффективности стратегий на основе гистотрипсии для лечения ТГВ.

Протокол, изложенный в этом исследовании, подчеркивает детали моделирования венозного сгустка, лизотрипсии для разрушения сгустка и ультразвуковой визуализации в установке ТГВ in vitro. Принятая процедура демонстрирует шаги, необходимые для оценки разрушения сгустка из-за комбинирован?...

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Гистотрипсия с помощью литической доставки или лизотрипсии находится в стадии разработки для лечения тромбоза глубоких вен. Процедура in vitro представлена здесь для оценки эффективности этой комбинированной терапии. Обсуждаются ключевые протоколы для модели сгустка, руководство по изображению и оценка эффективности лечения.

Система in vitro для оценки тромболитической эффективности гистотрипсии и литического препарата

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Этот протокол обеспечивает настольный метод оценки эффективности и механизмов действия гистотрипсии с помощью тромболитической терапии или лизотрипсии, альтернативного неинвазивного подхода для лечения критического тромбоза глубоких вен. Этот метод использует активность пузырьков для двустороннего эффекта через повышенный фибринолиз из-за усиленной доставки литики и гемолиза красных кровяных клеток в сгустке. Этот настольный подход к лечению тромбоза глубоких вен облегчает моделирование тромбов, лечение лизотрипсией и одновременную визуализацию во время лечения.Генерация пузырьковых облаков, планирование лечения и руководство по изображениям могут быть дополнительно использованы для исследования методов лечения других заболеваний, таких как опухоли почек и печени, на основе гистотрипсии in vitro. Чтобы настроить источник гистотрипсии, установите источник на моторизованную систему позиционирования. Накройте массив визуализации крышкой зонда и зафиксируйте массив коаксиально в отверстии источника гистотрипсии.Подключите массив изображений к системе ультразвукового сканирования и полностью погружайте источник гистотрипсии и массив визуализации в резервуар. Используйте шприц, чтобы аккуратно удалить пузырьки воздуха, и используйте массив изображений и сканер для получения дегазированных изображений воды в режиме B со скоростью 20 кадров в секунду. При получении изображений отрегулируйте положение массива изображений внутри отверстия конфокального преобразователя до тех пор, пока пузырьковое облако не будет расположено примерно в центре окна изображения, и запишите обнаруженное фокальное местоположение в окне изображения.Затем прекратите инсонацию и установите напряжение, приложенное к источнику гистотрипсии, равным нулю. Чтобы подготовить сгусток к анализу, используйте плоскогубцы, чтобы разрезать герметичный конец пипетки, содержащей сгусток, и дайте сгустку и сыворотке скользить в чашку Петри. Используйте скальпель, чтобы разрезать сгусток до одного сантиметра длины и используйте чистящую салфетку, чтобы аккуратно промокнуть разрезанный участок, чтобы удалить лишнюю жидкость.Используйте пинцет, чтобы аккуратно поместить участок сгустка на весы и записать вес. Затем вручную поднимите канал потока из дегазированного резервуара для воды обратного осмоса и извлеките модель сосуда из канала. Используйте пинцет, чтобы аккуратно поместить сгусток в модельный сосуд, не повреждая сгусток, и прикрепить сосуд к каналу потока.Опустите канал потока в резервуар таким образом, чтобы проксимальный конец ступени относительно резервуара был низким по сравнению с дистальной стороной, и используйте пипетку, чтобы добавить 30 микролитров нагретой плазмы 37 градусов Цельсия в резервуар. Контролируйте температуру резервуара для воды, пока она не достигнет по крайней мере 36 градусов по Цельсию, и используйте пипетку, чтобы добавить 80,4 микрограмма rt-PA в плазменный резервуар. Чтобы загрунтовать канал потока, используйте шприцевой насос для вытягивания плазмы из резервуара в канал до тех пор, пока модельный сосуд не будет заполнен.Затем вручную выровняйте модель судна, чтобы убедиться, что в сосуде модели нет пузырьков воздуха, как видно в окне визуализации. Чтобы спланировать путь для источника гистотрипсии и массива изображений для равномерного воздействия гистотрипсии по длине сгустка, используйте сценарий визуализации, чтобы использовать моторизованные позиционеры для выравнивания массива изображений параллельно длине сгустка и подтверждения того, что в сосуде нет пузырьков воздуха. Используйте моторизованные позиционеры для выравнивания массива изображений таким образом, чтобы плоскость изображения была параллельна поперечному сечению сгустка.Используя окно визуализации в качестве ориентира, переместите источник гистотрипсии к проксимальному концу сгустка, относительно резервуара. Чтобы определить путь инсонации по длине сгустка, задайте путевые точки по длине сгустка с шагом в пять миллиметров. Перед завершением каждой путевой точки огневые тестовые импульсы от источника гистотрипсии с теми же параметрами инсонации, которые были продемонстрированы, но с общим воздействием, уменьшенным до 10 суммарных импульсов.В каждой путевой точке сохраняйте положения двигателя с помощью команд, назначенных производителем. Чтобы обработать сгусток по его длине в соответствии с путем, определенным на этапе предварительной обработки, установите шприцевой насос на 0,65 миллилитра в минуту и дождитесь движения мениска плазмы. Интерполировать путь обработки промежуточными шагами между установленными путевыми точками с фиксированным размером шага и использовать позиционеры для перемещения источника гистотрипсии в каждом месте контура, используя первоначально заданные параметры инсонации.Далее создайте скрипт для настройки массива визуализации на получение B-режима изображения сгустка и модельного сосуда за несколько секунд до применения импульса гистотрипсии в каждом месте. Затем применяйте импульс гистотрипсии в каждой путевой точке, приобретая акустические излучения в скрипте для формирования пассивных кавитационных изображений после анализа. Используйте окно визуализации для изображения активности пузырьков во время применения импульса гистотрипсии в каждом месте пути.После анализа вручную поднимите сосуд модели из резервуара для воды, чтобы слить перфусат под действием силы тяжести, и используйте шприцевой насос для вытягивания плазменного раствора из протокового канала, чтобы обеспечить сбор всего перфузата в небольшой контейнер. Отсоедините модельный сосуд и удалите сгусток. Затем протрите сгусток лабораторными тканями и взвесьте сгусток, чтобы оценить потерю массы сгустка.При подаче достаточного напряжения на источник гистотрипсии в фокальной области преобразователя генерируется пузырьковое облако и визуализируется с помощью ультразвуковой визуализации. Фокальная позиция определяется как центр пузырькового облака. Этот контрольный перфузат сгустка, подвергаемого воздействию только плазмы, и этот перфусат сгустка, обработанного лизотрипсией, использовались для оценки содержания гемоглобина и D-димера, как показано.Изменчивость концентрации гемоглобина может быть количественно определена оптическим поглощением. Здесь сгусток может быть визуализирован в модельном сосуде с помощью визуализации в B-режиме до экспозиции гистотрипсии для определения положения сгустка для сегментации пассивного кавитационного изображения. Как подтверждает это пассивное кавитационное изображение, совместно зарегистрированное с изображением сгустка в B-режиме, акустическая энергия содержится в основном внутри сгустка во время экспозиции гистотрипсии.В образцах, подвергшихся гистотрипсии, разрушение в основном ограничивается центром сгустка, что согласуется с наблюдаемыми местами активности пузырьков, отслеживаемыми с помощью пассивной кавитационной визуализации. С добавлением литика потеря массы происходит и в областях, близких к периферии сгустка. Альтернативно, экогенные липосомы, содержащие rt-PA, могут быть использованы вместо системной доставки RT-PA, чтобы позволить оценить целевую доставку лекарственного средства в сгусток.Лизотрипси обеспечивает альтернативный неинвазивный подход к лечению многих заболеваний. Этот протокол in vitro позволяет оценить эффективность лечения и его потенциальный успех при применении in vivo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Тканевая инженерия человеческого 3D<em&gt; В пробирке</em&gt; Опухоль Тестовая система

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

<em&gt; In Vitro</em&gt; Ферментативный анализ для измерения транскрипции ингибирование галлия (III) и H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-трис (пентафторфенил) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Инъекций и медикаментов загружены Супрамолекулярная Гидрогель для местного катетера для инъекций в сердце свиньи

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Использование высокой пропускной<em&gt; In Vitro</em&gt; Микрожидкостных систему для разработки Устные биопленки Многовидовые

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Роботизированная Производство раковой клетки сфероидов с водной двухфазной системе для тестирования на наркотики

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель дыхательных путях стены

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...