Name: an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

Detta arbete finansierades av National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Författarna vill tacka Dr. Kevin Haworth för att ha hjälpt till med Drabkins analys och Dr. Viktor Bollen för hans stöd i utformningen av protokollet. Författarna är också tacksamma mot Dr. Adam Maxwell för hans vägledning om att designa histotripsy källan.

För de resultat som presenteras här drogs venöst humant blod för att bilda blodproppar efter godkännande från den lokala interna granskningsnämnden (IRB #19-1300) och skriftligt informerat samtycke från frivilligagivare 24. I det här avsnittet beskrivs ett designprotokoll för att bedöma lysotripsy-effekten. Protokollet bygger på ett tidigare arbete av Bollen et al.24.
1. Proppmodellering
OBS: Förbered blodpr...

Det föreslagna protokollet presenterar en modell för att kvantifiera behandlingseffekten av lysotripsy. Även om de viktigaste detaljerna har diskuterats finns det vissa kritiska aspekter att ta hänsyn till för att protokollet ska lyckas. Den enzymatiska aktiviteten hos rt-PA har ett Arrhenius temperaturberoende30. Temperaturen är också en bidragande faktor till ljudets hastighet i vatten och vävnad, och temperaturvariationer kan orsaka mindre förändringar av fokuszonsgeometrin. Vattentem...

Trombos är tillståndet för blodproppsbildning i ett annars friskt blodkärl som hindrar cirkulationen1,2. Venös tromboembolism har en årlig sjukvårdskostnad på $ 7-10 miljarder, med 375,000-425,000 fall i USA3. Pulmonell emboli är obstruktion av lungartären och är den allvarligaste konsekvensen av venös tromboembolism. Den primära källan till lungobstruktion är djup ven thrombi, främst från iliofemorala venösa segment4,5,6. Djup ven blodpropp (DVT) har inneboende och sviter förutom pulmonell obstruktioner, med långsiktiga komplikationer som resulterar i smärta, svullnad, bensår och lem amputationer7,8,9. För kritiska hinder är kateterstyrda trombolytika (CDT) frontlinjen för fartygsrenalisering10. Resultatet av CDT beror på ett antal faktorer, inklusive tromb ålder, plats, storlek, sammansättning, etiologi och patientrisk kategori11. Dessutom är CDT associerat med vaskulär skador, infektioner, blödningskomplikationer och lång behandlingstid10. Nästa generations enheter syftar till att kombinera mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmakomisk trombektomi)12,13. Användning av dessa enheter sänker den lytiska dosen vilket leder till minskade blödningskomplikationer och förkortad behandlingstid12,13,14 jämfört med CDT. Dessa enheter behåller fortfarande problem med hemorragiska biverkningar och ofullständigt avlägsnande av kronisk trombi15. En adjuvant strategi behövs alltså som kan ta bort tromben helt med lägre blödningskomplikationer.
Ett potentiellt tillvägagångssätt är histotripsy-stödd trombolytisk behandling, kallad lysotripsy. Histotripsy är en icke-invasiv behandling modalitet som använder fokuserad ultraljud för att nukleera bubbelmoln ivävnader 16. Bubbelaktivitet genereras inte via exogena atomkärnor, utan genom applicering av ultraljudspulser med tillräcklig spänning för att aktivera atomkärnor inneboende i vävnader, inklusive blodpropp17,18. Den mekaniska svängningen av bubbelmolnet ger stam till proppen och sönderfaller strukturen i acellulärt skräp19. Histotripsy bubbelaktivitet ger effektiv nedbrytning av indragna och orena blodproppar både in vivo och in vitro20,21,22. Tidigare studier har23,24 visat att kombinationen av histotripsy och den lytiska rekombinanta vävnadstyp plasminogenaktivatorn (rt-PA) avsevärt ökar behandlingseffekten jämfört med enbart lytisk eller histotripsy ensam. Det är hypotesen att två primära mekanismer i samband med histotripsy bubbel verksamhet är ansvariga för den förbättrade behandlingseffekten: 1) ökad fibrinolys på grund av att förbättrad lytisk leverans och 2) hemolys av röda blodkroppar inom blodproppen. Huvuddelen av blodproppsmassan består av röda blodkroppar24, och därför är spårning av erytrocytnedbrytning en bra surrogat för ablation av provet. Andra bildade blodproppselement är också sannolikt sönderdelas under histotripsy bubbel verksamhet men beaktas inte i detta protokoll.
Här beskrivs en bänktop för att behandla DVT in vitro med lysotripsy. Protokollet beskriver kritiska driftsparametrar för histotripsy källan, bedömning av behandling effektivitet och bild vägledning. Protokollet inkluderar att designa en flödeskanal för att efterlikna ett iliofemoralt venöst segment och tillverkning av hela blodproppar hos människa. Det experimentella förfarandet beskriver positionering av histotripsy källa och bildframställning array för att uppnå histotripsy exponering längs blodproppen placeras i flöde kanalen. Relevanta insoneringsparametrar för att uppnå blodproppsstörning och minimera bubbelaktivitet utanför målet definieras. Användningen av ultraljud imaging för vägledning och bedömning av bubbel verksamhet illustreras24. Mätvärden för att kvantifiera behandlingseffekten såsom blodproppsmassaförlust, D-dimer (fibrinolys) och hemoglobin (hemolys) beskrivs23,24,25,26,27. Sammantaget ger studien ett effektivt sätt att utföra och bedöma effekten av lysotripsy för att behandla DVT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbing sheets</td>
			<td>Precision acoustics</td>
			<td>F28-SMALL-M</td>
			<td>300mm x 300 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Pasteur pippettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820A</td>
			<td>14.6 cm length, 2 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>1.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drabkin&#39;s assay</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5941-6VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Draw syringe</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter bags</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5162K111</td>
			<td>Remove particle size upto 1 microns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow channel tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5154K25</td>
			<td>Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8&#34;, Inner diameter: 1/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating elements</td>
			<td>Won Brothers</td>
			<td>HT 300 Titanium</td>
			<td>Titanium rods placed at the bottom of tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging array</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td>L11-5v</td>
			<td>128 element with sensitivity from -55 to -49 dB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model vessel</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5234K98</td>
			<td>6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopure water</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>Nanopure Diamond</td>
			<td>ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Vitalant</td>
			<td>4PF000</td>
			<td>Plasma frozen within 24 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy Neo HST Plate Reader</td>
			<td>For haemoglobin quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe cover</td>
			<td>Civco</td>
			<td>610-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programming platform</td>
			<td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)</td>
			<td>Genentech</td>
			<td>Activase</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07945-43</td>
			<td>60 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-74900-20</td>
			<td>pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>In-house customized</td>
			<td></td>
			<td>Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound scaning system</td>
			<td>Verasonics</td>
			<td></td>
			<td>Vantage Research Ultrasound System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water tank</td>
			<td>Advanced acrylics</td>
			<td>C133</td>
			<td>14 x 14 x 12, 1/2&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro system to gauge the thrombolytic efficacy of histotripsy and a lytic drug

Djup ventrombos (DVT) är ett globalt hälsoproblem. Det primära tillvägagångssättet för att uppnå kärlrenalisering för kritiska hinder är kateterstyrda trombolytika (CDT). För att mildra kaustiska biverkningar och den långa behandlingstiden i samband med CDT, adjuvans och alternativa metoder är under utveckling. Ett sådant tillvägagångssätt är histotripsy, en fokuserad ultraljudsterapi för att brinna vävnad via bubbelmolnkärna. Prekliniska studier har visat stark synergi mellan histotripsy och trombolytika för blodpropp nedbrytning. Denna rapport beskriver en bänktop metod för att bedöma effektiviteten av histotripsy-stödd trombolytisk terapi, eller lysotripsy.
Blodproppar tillverkade av färskt venöst blod introducerades i en flödeskanal vars dimensioner och acoustomekaniska egenskaper efterliknar en iliofemoral ven. Kanalen var perfused med plasma och den lytiska rekombinanta vävnad-typ plasminogen aktivator. Bubbelmoln genererades i proppen med en fokuserad ultraljud källa utformad för behandling av femorala venösa blodproppar. Motoriserade positionerare användes för att översätta källfokus längs blodproppslängden. På varje insonationsplats registrerades akustiska utsläpp från bubbelmolnet passivt och strålformades för att generera passiva kavitationsbilder. Mätvärden för att mäta behandlingseffekten inkluderade blodproppsmassaförlust (övergripande behandlingseffekt) och koncentrationerna av D-dimer (fibrinolys) och hemoglobin (hemolys) i perfusatet. Det finns begränsningar för denna in vitro-design, inklusive brist på medel för att bedöma in vivo-biverkningar eller dynamiska förändringar i flödeshastigheten när blodproppen lyser. Sammantaget ger installationen en effektiv metod för att bedöma effektiviteten hos histotripsy-baserade strategier för att behandla DVT.

Protokollet som beskrivs i denna studie belyser detaljerna i venous blodpropp modellering, lysotripsy för blodpropp störningar och ultraljud imaging i en in vitro setup av DVT. Det antagna förfarandet visar de åtgärder som krävs för att bedöma blodproppsstörningar på grund av de kombinerade effekterna av rt-PA och histotripsy bubbelmolnaktivitet. Bänkskivan setup utformades för att efterlikna egenskaperna hos en venös iliofemoral ven ven ven. Figur 1A visar ett modellkärl som h...

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug at JoVE.com

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Histotripsy-stödda lytic leverans eller lysotripsy är under utveckling för behandling av djupa vein blodpropp. Ett in vitro-förfarande presenteras här för att bedöma effekten av denna kombinationsbehandling. Viktiga protokoll för proppmodellen, bildvägledning och bedömning av behandlingseffekt diskuteras.

Ett in vitro-system för att mäta den trombolytiska effekten av histotripsi och ett lytiskt läkemedel

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Detta protokoll ger en bänkskiva metod för att bedöma effektiviteten och verkningsmekanismerna av histotripsy stödd trombolytisk terapi eller lysotripsy, en alternativ icke-invasiv strategi för behandling av kritiska djupa vein blodpropp. Denna teknik använder bubbelaktivitet för att ha en dubbelvägseffekt genom en ökad fibrinolys på grund av en förbättrad lytisk leverans och hemolys av röda blodkroppar i blodproppen. Denna bänktop tillvägagångssätt för behandling av djup ven blodpropp underlättar modellering av blodproppar, behandling med lysotripsy och samtidig bildbehandling under behandling.Bubbelmolngenerering, behandlingsplanering och bildvägledning kan vidare användas för att undersöka in vitro histotripsy-baserade behandlingar av andra sjukdomar, såsom njur- och levertumörer. För att ställa in histotripsy-källan monterar du källan på ett motoriserat positioneringssystem. Täck avbildningsmatrisen med ett sondskydd och fixera matrisen coaxially i bländaren av histotripsy källan.Anslut bildmatrisen till ett ultraljudsskanningssystem och helt dränka histotripsy-källan och bildmatrisen i tanken. Använd en spruta för att försiktigt ta bort eventuella luftbubblor och använd bildmatrisen och skannern för att få avgasade B-lägesvattenbilder med 20 bilder per sekund. När du hämtar bilderna justerar du avbildningsmatrisens position inuti den konfokala givarens öppning tills bubbelmolnet finns ungefär i mitten av bildfönstret och registrerar den detekterade brännpunkten i bildfönstret.Avbryt sedan insonationen och ställ in spänningen som appliceras på histotripsy-källan till noll. För att förbereda en blodpropp för analys, använd tång för att skära den förseglade änden av en pipett som innehåller en blodpropp och låt proppen och serumet glida in i en petriskål. Använd en skalpell för att skära proppen till en centimeter lång och använd en rengöringsservett för att försiktigt fläcka den skurna delen för att ta bort överflödig vätska.Använd pincett för att försiktigt placera klotdelen på en skala och registrera vikten. Lyft sedan upp flödeskanalen manuellt ur en avgasad omvänd osmosvattentank och ta bort modellkärlet från kanalen. Använd pincett för att försiktigt placera proppen i modellkärlet utan att skada proppen och fäst kärlet på flödeskanalen.Sänk flödeskanalen i tanken så att den proximala änden av scenen i förhållande till behållaren är låg jämfört med den distala sidan och använd en pipett för att lägga till 30 mikroliter 37 grader Celsius uppvärmd plasma till behållaren. Övervaka vattentankens temperatur tills den når minst 36 grader Celsius och använd en pipett för att lägga till 80,4 mikrogram rt-PA i plasmabehållaren. För att fylla flödeskanalen, använd en sprutpump för att dra plasma från behållaren till kanalen tills modellkärlet har fyllts.Jämna sedan ut modellkärlet manuellt för att säkerställa att det inte finns några luftbubblor i modellkärlet, vilket syns i bildfönstret. För att planera en väg för histotripsy-källan och bildmatrisen för en enhetlig histotripsyexponering längs blodproppslängden, använd bildskriptet för att använda de motoriserade positionerarna för att justera bildmatrisen parallellt med blodproppens längd och bekräfta att inga luftbubblor finns i kärlet. Använd de motoriserade positionerna för att justera bildmatrisen så att bildplanet är parallellt med blodproppens tvärsnitt.Använd bildfönstret som guide och flytta histotripsykällan till proximala änden av proppen, i förhållande till behållaren. För att bestämma insoneringsvägen längs blodproppslängden, ställ in waypoints längs blodproppens längd i fem millimetersteg. Innan varje waypoint slutförs pulserar brandtesten från histotripsykällan med samma insoneringsparametrar som visats, men med den totala exponeringen reducerad till 10 totala pulser.Spara motorpositionerna med hjälp av de kommandon som anges av tillverkaren vid varje vägpunkt. För att behandla proppen längs dess längd enligt den väg som definieras i förbehandlingssteget, ställ in sprutpumpen på 0,65 milliliter per minut och vänta på att plasmans menisk ska röra sig. Interpolera behandlingssökvägen med mellanliggande steg mellan de etablerade waypointsna med en fast stegstorlek och använd positionerna för att flytta histotripsy-källan på varje sökvägsplats med hjälp av de ursprungligen angivna insonationsparametrarna.Skapa sedan ett skript för att ställa in avbildningsmatrisen för att hämta en B-lägesbild av proppen och modellkärlet några sekunder före appliceringen av histotripsypuls på varje plats. Applicera sedan histotripsypulsen vid varje waypoint och förvärva de akustiska utsläppen i manuset för att bilda passiva kavitationsbilder efter analysen. Använd bildfönstret för att avbilda bubbelaktiviteten under tillämpningen av histotripsypulsen på varje sökvägsplats.Efter analysen, lyft manuellt modellkärlet ur vattentanken för att tömma perfusatet via gravitationen och använd sprutpumpen för att dra plasmalösningen från flödeskanalen för att tillåta insamling av hela perfusatet i en liten bägare. Koppla bort modellkärlet och ta bort proppen. Torka sedan av proppen med labbvävnader och väg blodproppen för att bedöma blodproppens massförlust.Vid applicering av tillräcklig spänning till histotripsy källan genereras ett bubbelmoln i fokal regionen av givaren och visualiseras via ultraljud imaging. Brännpunkten definieras som mitten av bubbelmolnet. Denna kontroll perfusate av en blodpropp utsätts för plasma ensam, och denna perfusate av en lysotripsy behandlade blodpropp användes för att bedöma hemoglobin och D-dimer innehåll som visats.Variationen i hemoglobinkoncentrationen kan kvantifieras genom optisk absorbans. Här kan en blodpropp visualiseras i ett modellkärl via B-lägesavbildning före histotripsy exponering för att bestämma blodproppspositionen för segmentering av den passiva kavitationsbilden. Som denna passiva kavitationsbild som samregistreras med koagelns B-lägesbild bekräftar, finns den akustiska energin främst i proppen under histotripsyexponeringen.I prover som exponeras för histotripsy är störningar främst begränsade till blodproppscentret, i överensstämmelse med de observerade platserna för bubbelaktivitet spårad via passiv kavitation imaging. Med tillsats av lytisk uppstår massförlust också i regioner närmare blodproppens periferi. Alternativt kan ekogena liposomer som innehåller rt-PA användas i stället för systemisk rt-PA-leverans för att möjliggöra bedömning av riktad läkemedelstillförsel till proppen.Lysotripsy ger ett alternativt icke-invasivt tillvägagångssätt för behandling av många sjukdomar. Detta in vitro-protokoll möjliggör bedömning av behandlingens effekt och dess potentiella framgång i in vivo-applikation.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering av en Human 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumör Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk analys för att mäta transkription Hämning av gallium (III) och H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug belastad Supra Hydrogel för lokal kateter Injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Användning av en hög kapacitet<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrofluidumanordning System för att utveckla muntliga Biofilmer Multi-arter

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Robotic Production of Cancer Cell Sfäroider med en vatten tvåfassystem för drogtestning

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Anpassning av Electro processen med att ge tre unika miljöer för en Tri-lager<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som en grund för In Vivo delvis lever Engineering i råtta

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...