Name: systematic scoring analysis for intestinal inflammation in a murine dextran sodium sulfate-induced colitis model
Uploaded: 2021-02-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model at JoVE.com

作者希望感谢NIH资助DK055679、DK089763、DK079392、DK061739、DK072564和密歇根大学病理学幻灯片扫描服务的支持。

所有描述的动物实验都得到了密歇根大学动物使用和护理委员会的批准。
1. 组织收获
<ol><li>根据批准的协议，使用异氟烷麻醉进行人道安乐死小鼠，然后进行宫颈错位。对于所有动物实验，经认证的审查委员会根据国家和机构动物处理准则获得批准。</li>
	<li>将鼠标放在解剖垫上，处于超平位置。使用 20 G x 1 1/2 英寸 G 针固定鼠标四肢。</li>
	<li>使用钳子和剪刀，在腹部皮肤...

<ol>
	<li>Kagnoff, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelium+is+an+integral+component+of+a+communications+network.">The intestinal epithelium is an integral component of a communications network.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).</li><li>Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+intestinal+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).</li><li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+disease.">Crohn's disease.</a> Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li><li>Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+colitis.">Ulcerative colitis.</a> Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).</li><li>Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Armed Forces Institute of Pathology (U.S) &amp; Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).</li><li>Kelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+epithelium-expressed+sialyl+Lewis+glycans+improves+colonic+mucosal+wound+healing+and+protects+against+colitis.">Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis.</a> The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).</li><li>Reed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+CD47+is+critical+for+mucosal+repair+in+the+murine+intestine+in+vivo.">Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo.</a> Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).</li><li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo.">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).</li><li>Khounlotham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compromised+intestinal+epithelial+barrier+induces+adaptive+immune+compensation+that+protects+from+colitis.">Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis.</a> Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).</li></ol>

我们的组织结肠炎评分系统是量化肠道组织炎症和损伤的可靠工具。这种方法提高了对整个器官组织病理状态的理解，而没有选择小区域或不完整部分的偏见。成功执行此协议的关键步骤之一是适当准备瑞士卷，以便分析至少 90% 的结肠长度：石蜡嵌入和切口期间平行方向，以确保具有上皮墓穴纵向视图的直线和均匀组织部分：在经验丰富的病理学家的监督下进行实践和培训，以确认受训人员识?...

胃肠道上皮屏障在将发光抗原和病原与底层组织隔间1分离方面起着举足轻重的作用。在炎症性肠病 （IBD）、 缺血或手术损伤等病理条件下看到的上皮损伤和粘膜损伤与临床症状相关，这些症状包括腹泻、体重减轻、大便中的血液和腹痛。作为对损伤的反应，上皮细胞迁移和增殖，以重新上皮化和修复粘膜屏障缺陷。解决炎症和恢复粘性完整性是重建肠道粘胶平衡和功能2，3，4的关键。
各种动物模型被用来研究与肠道上皮屏障损伤相关的基本分子机制。化学诱发结肠炎的成熟和易于应用的模型被广泛使用，特别是在与炎症损伤相关的研究（如IBD）中。一种常见的、可重复的和可靠的粘膜结肠炎模型采用脱硫酸钠（DSS）调解结肠损伤和炎症。疾病的严重程度因小鼠菌株、DSS剂量、DSS给药时间长短和DSS5、6、7的分子量而异。
DSS结肠炎期间的肠道粘膜损伤通常使用疾病活动指数（DAI）进行评估，该指数是由体重减轻、粪便血液含量和粪便一致性决定的综合评分。粪便血液含量可以是微观的（使用粪便瓜亚酸测试检测）或宏观的：粪便一致性分为硬、软或液体（即腹泻）5，8。这些临床参数的评分可能是主观的，可能因用户的经验和偏差而异，尽管总体而言，这些数据提供了可靠的信息，因此IBD研究人员广泛使用。相比之下，没有普遍接受的粘膜损伤的病理学评估方法。最常见的情况是，结肠的选定区域由训练有素的病理学家检查，并根据几个参数进行评分，这些参数通常包括隐性损伤和白细胞渗透9、10、11。但是，由于被调查参数的数量和分析的组织数量在单个报告之间差异很大，因此许多已发表的研究的可比性有限。为了减少观察者偏见和增强相互学习的和谐，理想的组织学评分协议应：1） 包括结肠的整个长度，因为肠道粘膜炎症通常是可变的，跳过病变是常见的，2） 将分析限制在特定的关键和易于解释的参数，以降低主观性： 3） 促进快速、一致地处理大量样本;4） 使用广泛可用且负担得起的工具进行数据采集、分析和演示。
在这里，我们描述了一种技术，以"瑞士卷"配置处理小肠的整个结肠或长段，以及使用免费的计算机辅助评分系统来分析肠道粘膜炎症和损伤，因为DSS引起的结肠炎。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aperio AT2 &#8211; High Volume, Digital Whole Slide Scanning</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Aperio AT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>56616-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg</td>
			<td>GT Midwest</td>
			<td>TL5837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Strabismus Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Strabismus Scissors - ToughCut</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>14084-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501640-19L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep 70% Ea</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>70% denatured ethyl alcohol</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageScope</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>Version 12.3.3.5039</td>
			<td>http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeakBuster Specimen Containers: Sterile</td>
			<td>Starplex Scientific</td>
			<td>B120210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffere Saline, without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in</td>
			<td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml</td>
			<td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Tissue Cassettes</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M505-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systematic scoring analysis for intestinal inflammation in a murine dextran sodium sulfate-induced colitis model

Murine结肠炎模型是广泛应用于研究的工具，专注于了解炎症性肠道疾病的病理生物学。然而，对疾病严重程度进行客观和可重复量化的有力标准仍有待确定。大多数结肠炎分析方法依赖于对小段肠道的有限组织学评分，导致部分或偏置分析。在这里，我们结合了高分辨率图像采集和纵向分析整个结肠，以量化肠道损伤和溃疡在脱硫酸钠（DSS）诱导模型的穆林结肠炎。此协议允许在没有广泛的用户培训的情况下生成客观和可重复的结果。在这里，我们使用DSS诱导结肠炎的数据示例提供样品制备和图像分析的全面详细信息。这种方法可以很容易地适应其他模式的穆林结肠炎，有与粘膜损伤相关的重大炎症。我们证明，与结肠的完整长度相比，发炎/受伤和侵蚀/溃疡粘膜的分数与临床发现（如DSS引起的疾病进展中的体重减轻）密切相关。该组织学协议为DSS结肠炎实验中公正地标准化疾病活动分析提供了可靠的时间和具有成本效益的帮助。

为了说明这种组虫结肠炎评分分析在DSS挑战和随后从结肠炎中恢复的粘膜损伤背景下的可靠性，我们在8只10周大的雄性C57BL6野生型小鼠的饮用水中施用了2.5%的DSS，为期5天，然后是常规水的恢复期为5天。在DSS的急性给用期间，体重没有变化，从第0天到第5天（图4A）。第5天之后，当老鼠开始喝普通的自来水时，体重急剧下降。血液和软凳子出现后，3?...

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Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

使用免费计算机辅助系统系统地对肠道炎症进行评分，是定量比较以溃疡和炎症变化为特征的结肠炎模型组织病理变化的有力工具。病理结肠炎评分评估加强临床观察，便于数据解释。

穆林·德克斯特兰硫酸钠诱导结肠炎模型中肠道炎症的系统评分分析

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...

系统评分分析是一种评估粘膜损伤的技术，有助于组织学解释，由训练有素的研究人员进行。这种方法的主要优点是它是免费的，易于使用。它允许对从结肠炎小鼠肠道获得的病理学数据进行定量分析。该协议提供了一个快速和可重复的方式来解释整个结肠的疾病严重程度，这是比较来自不同遗传背景的动物疾病所必需的。对于组织准备，组织所有试剂和材料非常重要。首先将安乐死的鼠标放在一个超平位置的解剖垫上，然后用 20 个 1.5 英寸的针头固定小鼠的四肢。使用钳子和剪刀，在腹部皮肤上做一个小切口，并拉到一边，以暴露腹腔，然后打开腹腔与腹膜的中线切口从阴骨到腹部的两侧。小心地去除组织和器官，直到大肠被可视化。切开结肠两侧的骨盆骨，使器官完全可视化，从肛门延伸到粪坑。轻轻去除附着在结肠上的脂肪、小静脉和动脉，同时仔细解剖器官，切开靠近肛门和切除的粪坑。使用插入肛门的柔性塑料加瓦奇针小心地用 PBS 冲洗结肠，以去除粪便内含物。将结肠放在一条直线上，沿着中性动脉纵向打开。从解剖纵向到近端纵向分割结肠。将一半的组织用于组织学分析，另一半用于西式污点、PCR 或卷入第二个瑞士卷，用于新鲜冷冻免疫荧光显微镜。用剃须刀刀片从近结肠修剪额外的组织，直到沿整个结肠长度获得大致相同的宽度。对齐结肠，用柔性气孔针暴露流明并完全压平组织。如果需要，添加更多 PBS 以在整个过程中保持组织湿润。使用纸巾去除多余的 PBS。用注射器和气孔针，加入10%中性缓冲形式素溶液两到三分钟，以修复和扁平组织，然后使用直钳抓住末端的结肠，将结肠从离结肠到近端扭成同心圆。插入一个27号针针，将结肠固定在中间，并保持其瑞士卷形，然后将瑞士卷放入组织标本容器内嵌入的盒式磁带中，将组织与盒式磁带平行定位。在4摄氏度的夜间将组织固定在10%中性缓冲形式素溶液中。隔夜固定后，用 PBS 清洗组织三次。在石蜡嵌入过程之前加入 70% 乙醇，并在继续之前从瑞士卷中取出针头。组织可以在室温下储存在乙醇中，直到石蜡嵌入。打开图像处理软件中的扫描图像后，验证整个冒号是否可见，并且样品中没有缺失区域。通过单击标签成像器激活标签成像器和比例尺工具，以正确识别扫描的幻灯片。通过单击注释打开注释工具，通过单击新层创建三个不同的层，以量化瑞士卷的总长度、炎症或损伤以及侵蚀或溃疡。单击图层颜色，为每一层选择不同的颜色。通过单击笔工具在肌肉粘膜之后绘制一条线来测量每个图层或类别的长度，根据需要移动指点以可视化相邻区域进行分析。以 400 微米变焦查看图像，以便于对肌肉粘膜进行充分可视化。每次停止笔时，都会生成一个小的新层区域。它可以与层区域选项卡一起可视化和编辑。回顾总长度，炎症或伤害，侵蚀或溃疡测量使用肌肉粘膜作为参考。定义所有图层后，使用导出网格导出数据，以在图层区域选项中文本文件按钮。打开文本文件并将数据复制到电子表格软件。将每个区域的所有段总计，并计算总长度的损伤和溃疡百分比。考虑三个主要特征来计算结肠炎的评分，并评估疾病的严重程度。检查健康的肠道粘膜，其特点是有组织的上皮细胞在隐秘的发光轴，拉米纳丙原与免疫细胞很少和亚贾森肌肉粘膜。接下来，检查炎症或损伤，其特征是上皮隐士衰减或部分缺失上皮细胞和粘膜炎症与中性粒细胞渗透到墓穴。最后，检查是否有侵蚀或溃疡，其特征是没有表面上皮的区域或完全缺乏有或没有相关白细胞的上皮隐秘的区域。为了说明这种组织的结肠炎评分分析在粘膜损伤背景下的可靠性，在8只C57BL6野生型小鼠的饮用水中施用了2.5%DSS，为期5天，随后是5天的正常水的恢复期。在DSS的急性管理期间，体重保持不变，但当小鼠开始饮用常规自来水时，体重急剧下降。血液和软凳子出现在DSS管理三天后，一直持续到实验的第八天。这些观察表明，在第五天至第八天的恢复期内，观察到了接触DSS的最有害影响。第10天结肠长度的测量证实实验结束时结肠长度显著缩短。结肠在零、二、五、七、八和十日收获，使石蜡瑞士卷。组织沾染了H&E，并分析了高清扫描，以计算组织结肠炎的分数和受伤和溃疡的百分比。在未经处理的小鼠中观察到正常的墓穴结构。经过两天的DSS管理，免疫细胞招募被观察到。第五天，上皮细胞出现损伤，中性粒细胞渗透到上皮损伤相关的上皮。从第五天到第八天，观察到炎症和溃疡的上皮损失区域。第10天，上皮细胞开始再生和重新填充溃疡区，慢慢恢复结肠粘膜。在尝试此协议时，重要的是创建一个正确定位和保存完好的瑞士卷，以及正确识别粘膜炎症或损伤、溃疡或侵蚀。这种方法可用于定量评估其他结肠炎模型（如 TMS 或 T 细胞转移模型）中结肠粘膜整个长度的损伤。

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