Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. og Jack Denton Wilson Foundation og Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Denne dyreprotokol blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokolnummer 07044). Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health.
1. Forberedelse af bakterier til museinfektioner
BEMÆRK: Her beskriver vi kun inficere mus med Pseudomonas aeruginosa. Andre bakteriear...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Her beskriver vi protokoller, der kan bruges til at studere effekten af biofilm dispergringsmidler. Disse protokoller kan let tilpasses til brug med forskellige typer spredningsmidler, bakteriearter eller ex vivo-prøver, herunder kliniske debridementprøver. Denne protokol giver også en klinisk relevant model til at indsamle og studere spredte bakterieceller. Det har vist sig, at fænotyperne af spredte bakterieceller adskiller sig fra dem, der findes i enten planktoniske celler eller biofilmceller <sup class=...

Stigningen i antibiotikaresistens på verdensplan fører til mangel på antibiotika muligheder for at behandle en række bakterielle infektioner1. Ud over antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerance ved at vedtage en biofilm-associeret livsstil2. En biofilm er et fællesskab af mikroorganismer, der er beskyttet af en matrix af polysaccharider, ekstracellulært DNA, lipider og proteiner3, kollektivt kaldet det ekstracellulære polymere stof (EPS). Som antibiotikaresistens krisen fortsætter, nye strategier, der forlænger brugen af, eller forstærke effekten af antibiotika er hårdt tiltrængt. Antibiofilmmidler er en lovende løsning4.
Blandt de forskellige antibiofilmstrategier, der er blevet foreslået, er udnyttelsen af spredningsmidler, der er målrettet mod forskellige komponenter i biofilmEN EPS, på forkant med terapeutisk udvikling5. Glycoside hydrolaser (GH) er en sådan klasse af spredningsmiddel. GH er en stor klasse af enzymer, der katalyserer kavalergangen af forskellige bindinger inden for polysaccharider, der giver strukturel integritet til EPS. Vores gruppe, såvel som andre, har vist, at GH effektivt kan nedbryde biofilm, fremkalde spredning og forbedre antibiotikaeffektiviteten for en række forskellige bakteriearter, både in vitro og in vivo6,7,8,9,10,11.
Med en stigende interesse for spredning af biofilm er det vigtigt at udvikle effektive metoder, der vurderer spredningseffektiviteten. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til behandling af biofilmrelaterede sårinfektioner med et spredningsmiddel hos mus og vurdering af spredningseffektivitet, in vivo og ex vivo. Det overordnede mål er at levere effektive metoder, der kan bruges med prækliniske modeller til at måle biofilmspredning effektivt.
En murin kirurgisk excision infektion model blev brugt i disse undersøgelser for at etablere en biofilm-associeret infektion. Vi har brugt denne model i over 15 år og offentliggjort vores observationer i vid udstrækning7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Generelt er dette en ikke-dødelig infektion model, hvor bakterier forbliver lokaliseret til sårbunden og er biofilm-associeret (bakterier ses i aggregater omgivet af EPS), oprettelse af en kronisk infektion, der varer op til 3 uger. Men hvis mus er immunkompromitterede (f.eks. med type 1-diabetes), kan de blive mere modtagelige for at udvikle en dødelig systemisk infektion i denne model.
I denne rapport giver vi protokoller til vurdering af spredningen af bakterier fra et sår, både in vivo og ex vivo. Begge protokoller kan bruges til at undersøge effekten af et spredningsmiddel og have deres egne styrker og svagheder. For eksempel kan vurdering af spredning in vivo give vigtige realtidsoplysninger om spredning af bakterier til andre dele af kroppen efter spredning, og hvordan værten reagerer. På den anden side kan det være mere ønskeligt at vurdere spredningsudsnit til screening af flere agenser, doser eller formuleringer, da vævet kan opdeles i flere sektioner, der kan testes separat, hvilket reducerer antallet af mus, der kræves. Ved vurdering af flere agenter måler vi typisk spredning først in vitro som tidligere beskrevet 6,9,22. Derefter tester vi den mest effektive ex vivo- og reserve in vivo-testning for et begrænset antal meget lovende stoffer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Biofilm-relaterede infektioner er impliceret i en bred vifte af kroniske tilstande såsom ikke-helbredende diabetisk fodsår, kronisk bihulebetændelse, tilbagevendende otitis medier, og mange flere. Mikrobielle celler i disse infektioner er beskyttet af et ekstracellulært polymerstof (EPS), som kan forhindre antibiotika og vært immunceller i at rydde infektionen. For at overvinde denne hindring, efterforskere er begyndt at udvikle spredningsmidler som potentielle terapeutiske. Disse midler målrette forskellige komponenter i biofilm EPS, svække strukturen, og indlede spredning af bakterier, som teoretisk kan forbedre antibiotika potens og immun clearance. For at bestemme effekten af spredningsmidler til sårinfektioner har vi udviklet protokoller, der måler biofilmspredning både ex vivo og in vivo. Vi bruger en musekirurgisk excision model, der er blevet godt beskrevet til at skabe biofilm-associerede kroniske sårinfektioner. For at overvåge spredning in vivoinficerer vi sårene med bakteriestammer, der udtrykker luciferase. Når modne infektioner er etableret, overrisler vi sårene med en opløsning, der indeholder enzymer, der nedbryder komponenter i biofilmen EPS. Vi overvåger derefter placeringen og intensiteten af det selvlysende signal i såret og filtreringsorganerne for at give oplysninger om det opnåede spredningsniveau. Til ex vivo-analyse af biofilmspredning nedsænkes inficeret sårvæv i biofilmnedbrydende enzymopløsning, hvorefter den bakterielle belastning, der er tilbage i vævet, i forhold til bakteriebelastningen i opløsning vurderes. Begge protokoller har styrker og svagheder og kan optimeres til at hjælpe præcist med at bestemme effekten af spredningsbehandlinger.

I dette eksperiment blev 8-10 uger gamle kvindelige schweiziske Webster mus smittet med 104 CFU af PAO1 transporterer luminescens plasmid pQF50-lux. Som beskrevet ovenfor fik en infektion lov til at fastslå for 48 timer før administration af 3 x 30 min behandlinger af enten PBS (køretøjskontrol) eller 10% GH (behandling) for at fordøje biofilm EPS. Mus blev afbildet forbehandling, direkte efter behandling (0 h) og ved 10 timer og 20 timer efter behandlingen. Figur 2A og<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Her beskriver vi ex vivo- og in vivo-metoder til vurdering af bakteriespredning fra en sårinfektion hos mus. Denne protokol kan anvendes til at teste effekten af aktuelle antimikrobielle og antibiofilmbehandlinger eller til at vurdere spredningskapaciteten af forskellige bakteriestammer eller arter.

Vurdering biofilm spredning i Murine Sår

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Mikrobiologer og infektionssygdomme læger er begyndt at indse, hvor vigtigt biofilm-associerede infektioner er i kronisk sygdom. NIH har endda sagt, at over 80% af kroniske infektioner skyldes bakterielle biofilm. Så dette har opfordret til, at der lægges vægt på at løse biofilm, og udvikle terapeutiske, der tager fat på biofilm problem.Og en lotta disse terapeutiske er fokuseret på at sprede bakterieceller, der er i biofilm ud af biofilm, så de lettere kan dræbes. Men der er virkelig ikke mange protokoller i litteraturen i øjeblikket, der omhandler, hvordan man bestemmer effekten af en sådan spredning agent. Så vi føler, at dette er en god protokol at bruge.Det er en type bakteriel infektion, der er biofilm-associeret. Og vi synes også, det kan optimeres ret nemt at studere mange forskellige typer bakteriearter, og hvordan de danner biofilm og spredes, samt forskellige spredningsmidler. Og vi synes, det er vigtigt at levere dette i et videoformat, fordi vi har set, at der er nuancer til især levering af det middel, som vi har fundet arbejde optimalt i mus.Til at begynde med skal du vurdere anæstesiplanet ved tåklem og ved at overvåge åndedrætshastigheden og indsatsen. Barber dorsaloverfladen og påfør en depilatorisk creme på det barberede område i 10 minutter eller i henhold til produktets instruktioner. Fjern forsigtigt depilatorisk creme.Og sørg for, at huden er tør. Brug en alkoholsikker markør til at tegne en cirkel med en diameter på 1,5 centimeter mod bagområdet. Til smertebehandling skal 0,05 milliliter lidocain underkutant ind i det område, der skal afsplites.Og 0,02 milliliter buprenorphin subkutalt i halsen. Vent 10 minutter for at sikre, at smertebehandling er nået. Før udskæring desinficeres den dorsale overflade ved hjælp af en alkoholpind.Opretholde et sterilt kirurgisk felt under hele proceduren, og brug autoklaveret instrumenter og sterile handsker til at begrænse forureningen. Administrere en fuld tykkelse excisional hud sår til niveauet af panniculus muskel, med kirurgisk saks. Efter udskæring skal såret straks dækkes med en semipermeable polyurethandressing.Adskil forsigtigt bagbeklædningen fra bandagen med to tang, hvis det er relevant. Injicere ca 10 til den fjerde CFU af bakterier, og 100 mikroliter PBS under dressing og på såret sengen for at etablere en infektion. Bemærk, sår kan også være inficeret med flere arter af bakterier og / eller svampe samtidigt, eller ved at placere præforme biofilm eller endda debridement væv udvundet fra patienter på sårbunden.Efter infektion skal du placere mus i bure oven på papirhåndklæder for at forhindre musene i at kvæle strøelsesmaterialet. Placer burene på varmepuder og overvåge musene, indtil de har genvundet deres ret til refleks. Fjern køkkenrullen på dette tidspunkt.Lad sårinfektioner etablere sig i 48 timer. Undersøg dressing dagligt for tårer i områder med nonadherence og erstatte det, hvis det er nødvendigt. Placer mus under isoflurane anæstesi ved 3% og en liter i minuttet af ilt, mens administration behandlinger.Der injiceres 200 mikroliter enzymopløsning eller PBS-kontrol på såret ved at løfte huden lidt foran såret med pincet, forsigtigt gennembore den løftede hud med sprøjten og langsomt injicere opløsningen i området mellem sårbunden og dressingen. For at sikre, at hele sårbunden er dækket af opløsning, skal du forsigtigt hæve bandagen med pincet og trække den væk fra sårbunden, mens du langsomt injicerer opløsningen. Efter behandling skal du placere musene tilbage i bure i 30 minutter.Efter 30 minutters udsættelse for behandlingen reanesthetize musene med isoflurane og aspirere den resterende opløsning med en sprøjte, punktering i samme område som før. Bemærk, at denne indsugningsopløsning indeholder spredte bakterieceller, som kan gemmes til forskellige downstream-analyser. Administrere den anden og tredje vanding behandlinger, som blev gjort for den første ved hjælp af en ny sprøjte hver gang.Hvis en selvlysende stamme af bakterier udnyttes til at indlede infektion, en in-vivo billeddannelse system kan bruges til at visualisere spredning fra sårlejet. Til analyse skal du åbne billederne i IVIS-softwaren og vælge det område, der skal analyseres med værktøjspaletten. For at tage højde for baggrunden skal du placere en cirkel på baggrunden af et billede og derefter placere den samme størrelse cirkel oven på såret sengen for hver mus.Vælg Mål ROI'er på værktøjspaletten, og overfør måletabellen til et regneark. Træk baggrundscirklen fra hver af målingerne af sårbunden for at beregne luminescensen for hver prøve. Efter human aktiv dødshjælp, høst såret sengevæv ved først forsigtigt at fjerne dressing med sterile pincet, og skære rundt om omkredsen af såret sengen med steril kirurgisk saks.Brug pincet til forsigtigt at løfte den ene ende af sårsengen, og brug derefter en saks til at skære vævsprøven væk fra muskellaget. Vævsprøven anbringes i et forvejet 2-milliliter homogeniseringsrør, der indeholder en milliliter PBS. Røret vejes igen, når prøven er indsat.For at høste milten skal du placere musen i en liggende anatomisk position og fastgøre ved at fastgøre ekstremiteterne til en dissektionsoverflade. Blødgør det område, der skal dissekeres med 70% ethanol for at hjælpe med at forhindre forurening. Lav et lille snit vinkelret på midterlinjen med kirurgisk saks i underlivets dermis.Sørg for at trække huden op og væk fra de indre organer. Fortsæt snittet langs midterlinjen, indtil brystbenet er nået. Når peritonealhulen er eksponeret, og de indre organer er synlige, adskille milten fra bindevævet og placere i et separat forvejet homogeniseringsrør.Afveje røret igen efter indsættelse af milten. Homogeniser prøverne med fem meter i sekundet i 60 sekunder, to gange. For at optælle CFU fortyndes de homogeniserede prøver serielt og spotpladen.Serielt fortyndes ved at pipetter 100 mikroliter af den homogeniserede prøve til 900 mikroliter PBS og et 1,5 milliliter centrifugerør. Hvirvelstrøm, inden fortyndingen fortsættes ved at pipetter 100 mikroliter af den fortyndede prøve i et separat rør, der indeholder 900 mikroliter PBS. Gentag disse trin, indtil seks fortyndinger er opnået.Pipetter 10 mikroliter af hver fortynding på det angivne område på en agarplade som vist. Hvis der er behov for mere præcis CFU-kvantantitation, spredes 100 mikroliter af hver fortynding af prøven på tværs af separate agarplader. Sår og inficere mus med ca. 10 til den fjerde CFU af bakterier, som beskrevet i in vivo-protokollen.Lad infektionen etablere sig i 48 timer, og ekstrakt derefter sårbunden på samme måde som in-vivo-protokollen. Begynd med forsigtigt at fjerne dressingen. Skærer rundt om sårets omkreds.Og adskille fra muskellaget. Prøven af sårbunden kan opdeles i flere sektioner for at øge antallet af prøver. Derefter placeres de opdelte prøver i separate forvægtede tomme homogeniseringsrør.Røret vejes igen, og prøvens vægt beregnes ved at trække rørets vægt fra, uden at prøven fra rørets vægt trækkes fra prøven. Der tilsættes en milliliter PBS til homogeniseringsrøret, der indeholder prøven, og omvend forsigtigt røret et par gange for at skylle. Fjern PBS vask og kassér.Tilføj en milliliter GH-behandling, eller PBS som en negativ kontrol, og inkuber i to timer ved 37 grader Celsius, med rysten ved 80 RPM. Fjern galden fra spredningsopløsningen og læg den i et separat 1,5 milliliter centrifugerør. Dette indeholder de spredte celler.Vask det resterende væv med en milliliter PBS, som tidligere gjort, og kassér PBS-vask. Tilsæt en milliliter PBS til det resterende væv og homogeniser ved fem meter i sekundet i 60 sekunder. Der fortyndes serielt både opløsningen af spredte celler og den homogeniserede vævsprøve ved at pipetter 100 mikroliter af prøven til 900 mikroliter PBS i et 1,5 milliliter centrifugerør.Hvirvel den fortyndede prøve og fortsæt fortyndingen fem gange mere for i alt seks fortyndinger. Prøven udtages ved at pipetter 10 mikroliter af hver fortynding på det angivne område på en selektiv agarplade. Tæl CFU og beregn procentvis spredning ved at dividere den spredte CFU med den samlede CFU og gange med 100.I dette eksperiment blev otte til 10 uger gamle kvindelige schweiziske Webster mus smittet med 10 til den fjerde CFU af PA01 transporterer luminescens plasmid PQF50-lux. Infektionen fik lov til at etablere i 48 timer før administration af tre 30-minutters behandlinger af enten PBS som et køretøj kontrol, eller 10% GH som en eksperimentel behandling for at fordøje biofilm EPS. Vist i afsnit A blev mus afbildet før behandling, direkte efter behandling og ved 10 og 20 timer efter behandlingen.Ved hjælp af IVIS kan en etableret infektion visualiseres i sårbunden, hvilket genererer et lyst bioluminescerende signal. Spredningen af bakterier ud af sårbunden kan visualiseres umiddelbart efter GH-behandlingen, men ikke efter PBS-behandlingen. Bakteriel formidling i organerne kan også ses ved at placere musen på sin side til billeddannelse, som vist i de nederste paneler.I afsnit B viste billeder fra både PBS- og GH-behandlede mus en stigning i selvlysende signal 20 timer efter behandlingen sammenlignet med forbehandling. Det er dog stadig vigtigt at kvantificere CFU på grund af detektionstærsklen for en luminescens i IVIS. Efter 20 timer efter behandlingen blev musene aflivet, og sårsenge og milt blev indsamlet for at opregne CFU pr. Gram væv.Afsnit C viser bakteriebelastningen i sårbunden, mens afsnit D viser bakteriebelastningen i milten. Disse data tyder på udbredt spredning af de spredte bakterier, da bakterier kun blev påvist i milten hos de mus, der blev behandlet med EPS-målretning GH-opløsningen. Selvom disse protokoller er meget nyttige, er der nogle begrænsninger.For det første skal det bemærkes, at der er en detektionsbegrænsning med in-vivo-billeddannelsessystemet eller IVIS. Et fald i selvlysende signal kan ses, når bakterierne går ind i stationær fase. Derfor er det vigtigt at indsamle væv af interesse og måle CFU til stede, da der kan være en afbrydelse mellem luminescens og CFU opregnet.IVIS er dog nyttigt til at visualisere effekten af behandlingen gennem en undersøgelse uden faktisk at skulle aflive dyret. En anden begrænsning, der skal tages i betragtning, er kravet om nøje overvågning af bandagerne. Bandagerne er nødvendige for at reducere kontraktil heling samt holde såret sterilt fra andre bakterier.Bandager skal udskiftes ofte, hvilket kan føre til utilsigtet debridement af såret og mulighed for forurening. Disse protokoller beskriver nye metoder til at studere galde fra spredning, og evaluering af terapeutisk galde fra spredningsmidler. Disse modeller giver mulighed for udvikling af komplekse polymikrobielle biofilm-associerede infektioner, der efterligner klinisk relevante menneskelige infektioner.Vores håb er, at disse protokoller vil blive udnyttet og raffineret til at fremme udviklingen af anti-biofilm spredningsmidler til terapeutisk brug.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Vurdering af Somatisk Hypermutation i Ramos B-celler efter Overekspression eller Knockdown af specifikke gener

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere udviklingen i murine Plasmacytoid dendritiske celler i Peyer&#39;ske Patches Brug adoptiv overførsel af Hematopoietic Progenitorer

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: In Vivo overvågning af Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniske sår i en diabetisk Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Galde Salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener: teknikker til identifikation og kvantificering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...