Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), de Ted Nash Long Life Foundation, de Jasper L. en Jack Denton Wilson Foundation en het Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Dit dierprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Texas Tech University Health Sciences Center (protocolnummer 07044). Deze studie is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Instituten voor Gezondheid.
1. Bacteriën voorbereiden op muizeninfecties
OPMERKING: Hier beschrijven we het infecteren van muizen alleen met Ps...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Hier beschrijven we protocollen die kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van biofilmdispersiemiddelen te bestuderen. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan gebruik met verschillende soorten dispergeermiddelen, bacteriesoorten of ex vivo monsters, waaronder klinische debridement monsters. Dit protocol biedt ook een klinisch relevant model om gedispergeerde bacteriële cellen te verzamelen en te bestuderen. Het is aangetoond dat de fenotypen van gedispergeerde bacteriële cellen verschillen va...

De toename van antibioticaresistentie wereldwijd leidt tot een gebrek aan antibioticaopties om een verscheidenheid aan bacteriële infecties te behandelen1. Naast antibioticaresistentie kunnen bacteriën antibioticatolerantie krijgen door een biofilm-geassocieerde levensstijl aan te nemen2. Een biofilm is een gemeenschap van micro-organismen die worden beschermd door een matrix van polysachariden, extracellulair DNA, lipiden en eiwitten3, gezamenlijk de extracellulaire polymere stof (EPS) genoemd. Naarmate de antibioticaresistentiecrisis voortduurt, zijn nieuwe strategieën nodig die het gebruik van antibiotica verlengen of de werkzaamheid ervan versterken. Anti-biofilmmiddelen zijn een veelbelovende oplossing4.
Onder de verschillende anti-biofilmstrategieën die zijn voorgesteld, loopt het gebruik van dispergeermiddelen, die zich richten op verschillende componenten van de biofilm EPS, voorop in de therapeutische ontwikkeling5. Glycosidehydrolasen (GH) zijn zo'n klasse van dispergeermiddel. GH zijn een grote klasse enzymen die het decolleté van verschillende bindingen binnen de polysachariden katalyseren die structurele integriteit bieden aan de EPS. Onze groep, evenals anderen, hebben aangetoond dat GH biofilms effectief kan afbreken, dispersie kan induceren en de werkzaamheid van antibiotica kan verbeteren voor een aantal verschillende bacteriesoorten, zowel in vitro als in vivo6,7,8,9,10,11.
Met een groeiende interesse in biofilm dispersie, is het belangrijk om effectieve methoden te ontwikkelen die de dispersie-werkzaamheid beoordelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de behandeling van biofilm-geassocieerde wondinfecties met een dispergeermiddel bij muizen, en de beoordeling van de dispersie-werkzaamheid, in vivo en ex vivo. Het algemene doel is om effectieve methoden te bieden die kunnen worden gebruikt met preklinische modellen om biofilmdispersie effectief en efficiënt te meten.
Een murien chirurgisch excisie infectiemodel werd in deze studies gebruikt om een biofilm-geassocieerde infectie vast te stellen. We gebruiken dit model al meer dan 15 jaar en publiceerden onze observaties uitgebreid7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Over het algemeen is dit een niet-dodelijk infectiemodel waarbij bacteriën gelokaliseerd blijven in het wondbed en biofilm-geassocieerd zijn (bacteriën gezien in aggregaten omringd door EPS), waardoor een chronische infectie wordt opgezet die tot 3 weken duurt. Als muizen echter immuungecompromitteerd zijn (met type 1 diabetes bijvoorbeeld), kunnen ze vatbaarder worden voor het ontwikkelen van een fatale systemische infectie in dit model.
In dit rapport bieden we protocollen voor het beoordelen van de verspreiding van bacteriën uit een wond, zowel in vivo als ex vivo. Beide protocollen kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van een dispergeermiddel te onderzoeken en hebben hun eigen sterke en zwakke punten. Het beoordelen van dispersie in vivo kan bijvoorbeeld belangrijke, realtime informatie opleveren over de verspreiding van bacteriën naar andere delen van het lichaam na dispersie en hoe de gastheer reageert. Aan de andere kant kan het beoordelen van dispersie ex vivo wenselijker zijn voor het screenen van meerdere middelen, doses of formuleringen, omdat het weefsel kan worden onderverdeeld in meerdere secties die afzonderlijk kunnen worden getest, waardoor het aantal benodigde muizen wordt verminderd. Bij het beoordelen van meerdere middelen meten we meestal dispersie eerst in vitro zoals eerder beschreven 6,9,22. Vervolgens testen we de meest effectieve ex vivo en reserveren we in vivo testen voor een beperkt aantal veelbelovende middelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Biofilm-gerelateerde infecties zijn betrokken bij een breed scala aan chronische aandoeningen zoals niet-genezende diabetische voetzweren, chronische sinusitis, terugkerende otitis media en nog veel meer. Microbiële cellen binnen deze infecties worden beschermd door een extracellulaire polymere stof (EPS), die kan voorkomen dat antibiotica en gastheerimmuuncellen de infectie verwijderen. Om dit obstakel te overwinnen, zijn onderzoekers begonnen met het ontwikkelen van dispergeermiddelen als potentiële therapieën. Deze middelen richten zich op verschillende componenten in de biofilm EPS, verzwakken de structuur en initiëren de verspreiding van de bacteriën, wat theoretisch de potentie van antibiotica en immuunklaring kan verbeteren. Om de werkzaamheid van dispersiemiddelen voor wondinfecties te bepalen, hebben we protocollen ontwikkeld die biofilmdispersie zowel ex vivo als in vivo meten. We gebruiken een muis chirurgisch excisiemodel dat goed is beschreven om biofilm-geassocieerde chronische wondinfecties te creëren. Om de dispersie in vivote controleren, infecteren we de wonden met bacteriële stammen die luciferase uitdrukken. Zodra volwassen infecties zijn vastgesteld, irrigeren we de wonden met een oplossing die enzymen bevat die componenten van de biofilm EPS afbreken. Vervolgens monitoren we de locatie en intensiteit van het lichtgevende signaal in de wond en filteren we organen om informatie te geven over het bereikte verspreidingsniveau. Voor ex vivo analyse van biofilmdispersie wordt geïnfecteerd wondweefsel ondergedompeld in biofilmafbrekende enzymoplossing, waarna de bacteriële belasting die in het weefsel achterbleef, versus de bacteriële belasting in oplossing, wordt beoordeeld. Beide protocollen hebben sterke en zwakke punten en kunnen worden geoptimaliseerd om de effectiviteit van dispersiebehandelingen nauwkeurig te bepalen.

In dit experiment werden 8-10 weken oude vrouwelijke Zwitserse Webster muizen geïnfecteerd met 104 KVE van PAO1 met de luminescentie plasmide pQF50-lux. Zoals hierboven beschreven, mocht een infectie gedurende 48 uur worden vastgesteld voordat 3 x 30 minuten behandelingen van PBS (voertuigcontrole) of 10% GH (behandeling) werden toegediend om de biofilm EPS te verteren. Muizen werden voor de behandeling afgebeeld, direct na de behandeling (0 uur) en om 10 uur en 20 uur na de behandeling. ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Hier beschrijven we ex vivo en in vivo methoden voor het beoordelen van bacteriële dispersie van een wondinfectie bij muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de werkzaamheid van topische antimicrobiële en antibiofilmtherapieën te testen, of om de dispersiecapaciteit van verschillende bacteriestammen of soorten te beoordelen.

Beoordeling van biofilmdispersie in muriene wonden

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Microbiologen en artsen van infectieziekten beginnen zich te realiseren hoe belangrijk biofilm-geassocieerde infecties zijn bij chronische ziekten. De NIH heeft zelfs gezegd dat meer dan 80% van de chronische infecties te wijten zijn aan bacteriële biofilms. Dit heeft dus aangedrongen op de nadruk op het aanpakken van biofilm en het ontwikkelen van therapieën die het biofilmprobleem aanpakken.En veel van die therapieën zijn gericht op het verspreiden van bacteriële cellen die zich in biofilms uit de biofilm bevinden, zodat ze gemakkelijker kunnen worden gedood. Maar er zijn momenteel niet veel protocollen in de literatuur die gaan over hoe de effectiviteit van zo'n dispergeermiddel te bepalen. Dus we hebben het gevoel dat dit een goed protocol is om te gebruiken.Het is een soort bacteriële infectie die biofilm-geassocieerd is. En we denken ook dat het vrij eenvoudig kan worden geoptimaliseerd om veel verschillende soorten bacteriële soorten te bestuderen, en hoe ze biofilms vormen en verspreiden, evenals verschillende dispergeermiddelen. En we vinden het belangrijk om dit in een videoformaat te leveren, omdat we hebben gezien dat er nuances zijn in vooral de levering van het middel dat we optimaal werk hebben gevonden bij muizen.Om te beginnen, beoordeel het anesthesievlak per teenknijp en door de ademhalingsfrequentie en inspanning te controleren. Scheer het dorsale oppervlak en breng gedurende 10 minuten of volgens de instructies van het product een ontharingscrème aan op het geschoren gebied. Verwijder voorzichtig de ontharingscrème.En zorg ervoor dat de huid droog is. Teken met behulp van een alcoholbestendige marker een cirkel met een diameter van 1,5 centimeter naar het achterste gebied van de rug. Voor pijnbestrijding, toedienen 0,05 milliliter lidocaïne subcutaan in het te verwijderen gebied.En 0,02 milliliter buprenorfine subcutaan in het nekvel. Wacht 10 minuten om ervoor te zorgen dat de pijnbestrijding wordt bereikt. Desinfecteer voor excisie het dorsale oppervlak met een alcoholdoekje.Houd gedurende de hele procedure een steriel chirurgisch veld aan en gebruik autoclaafinstrumenten en steriele handschoenen om besmetting te beperken. Dien een excisionale huidwond van volledige dikte toe tot het niveau van de panniculusspier, met een chirurgische schaar. Bedek de wond na excisie onmiddellijk met een semipermeabel polyurethaanverband.Scheid de achterkant voorzichtig van het verband met behulp van twee fijn getipte tangen, indien van toepassing. Injecteer ongeveer 10 tot de vierde CFU van bacteriën en 100 microliter PBS onder het verband en op het wondbed om een infectie vast te stellen. Let op, wonden kunnen ook worden geïnfecteerd met meerdere soorten bacteriën en/ of schimmels tegelijkertijd, of door het plaatsen van voorgevormde biofilms of zelfs debridement weefsel geëxtraheerd van patiënten op het wondbed.Plaats na infectie muizen in kooien bovenop papieren handdoeken om te voorkomen dat de muizen verstikking op het strooiselmateriaal veroorzaken. Plaats de kooien op verwarmingskussens en bewaak de muizen totdat ze hun juiste reflex hebben herwonnen. Verwijder de papieren handdoek op dit punt.Laat wondinfecties zich gedurende 48 uur vaststellen. Inspecteer het verband dagelijks op scheuren in gebieden van nonadherence en vervang het indien nodig. Plaats muizen onder isofluraan anesthesie op 3% en een liter per minuut zuurstof, terwijl het toedienen van behandelingen.Injecteer 200 microliters enzymoplossing of PBS-controle op de wond door de huid enigszins voor de wond op te tillen met een tang, de opgetilde huid voorzichtig met de spuit te doorboren en de oplossing langzaam in het gebied tussen het wondbed en het verband te injecteren. Om ervoor te zorgen dat het hele wondbed bedekt is met een oplossing, tilt u het verband voorzichtig op met een tang, trekt u het weg van het wondbed en injecteert u de oplossing langzaam. Plaats de muizen na de behandeling 30 minuten terug in kooien.Na 30 minuten blootstelling aan de behandeling, reanesthetiseer de muizen met isofluraan en aspireer de resterende oplossing met een spuit, doorborend in hetzelfde gebied als voorheen. Merk op dat deze aangezogen oplossing gedispergeerde bacteriële cellen bevat, die kunnen worden opgeslagen voor verschillende downstream-analyses. Dien de tweede en derde irrigatiebehandeling toe zoals voor de eerste keer met een nieuwe spuit.Als een lichtgevende bacteriestam wordt gebruikt om een infectie te initiëren, kan een in-vivo beeldvormingssysteem worden gebruikt om de verspreiding vanuit het wondbed te visualiseren. Open voor analyse de afbeeldingen in de IVIS-software en selecteer het gebied dat moet worden geanalyseerd met het gereedschapspalet. Om rekening te houden met de achtergrond, plaatst u een cirkel op de achtergrond van een afbeelding en plaatst u vervolgens dezelfde cirkel van dezelfde grootte bovenop het wondbed voor elke muis.Selecteer ROIs meten in het gereedschapspalet en upload de tabel met metingen naar een spreadsheet. Trek de achtergrondcirkel af van elk van de wondbedmetingen om de luminescentie voor elk monster te berekenen. Oogst na humane euthanasie het wondbedweefsel door eerst het verband voorzichtig met steriele tang te verwijderen en met een steriele chirurgische schaar rond de omtrek van het wondbed te snijden.Gebruik een tang om het ene uiteinde van het wondbed voorzichtig op te tillen en gebruik vervolgens een schaar om het weefselmonster van de spierlaag af te snijden. Plaats het weefselmonster in een voorgewogen homogenisatiebuis van twee milliliter met één milliliter PBS. Weeg de buis opnieuw na het inbrengen van het monster.Om de milt te oogsten, plaatst u de muis in een liggende anatomische positie en zet u deze vast door de ledematen vast te pinnen op een dissectieoppervlak. Week het te ontleden gebied met 70% ethanol om besmetting te voorkomen. Maak een kleine incisie loodrecht op de middellijn met een chirurgische schaar in de dermis van de onderbuik.Zorg ervoor dat u de huid omhoog en weg trekt van de inwendige organen. Ga door met de incisie langs de middellijn tot het borstbeen is bereikt. Zodra de peritoneale holte is blootgesteld en de inwendige organen zichtbaar zijn, scheidt u de milt van het bindweefsel en plaatst u deze in een afzonderlijke voorgewogen homogenisatiebuis.Weeg de buis opnieuw na het inbrengen van de milt. Homogeniseer de monsters met vijf meter per seconde, gedurende 60 seconden, twee keer. Om CFU op te sommen, verdunnen en spot de gehomogeniseerde monsters serieel.Serieel verdunnen door 100 microliter van het gehomogeniseerde monster in 900 microliter PBS en een centrifugebuis van 1,5 milliliter te gieten. Vortex alvorens de verdunning voort te zetten door 100 microliters van het verdunde monster in een afzonderlijke buis met 900 microliter PBS te gieten. Herhaal deze stappen totdat zes verdunningen zijn bereikt.Pipet 10 microliter van elke verdunning op het aangegeven gebied op een agarplaat zoals afgebeeld. Indien een nauwkeurigere CFU-kwantificering vereist is, verdeelt u 100 microliters van elke verdunning van het monster over afzonderlijke agarplaten. Wond en infecteer muizen met ongeveer 10 tot de vierde CFU van bacteriën, zoals beschreven in het in vivo protocol.Laat de infectie gedurende 48 uur vaststellen en haal vervolgens het wondbed op een vergelijkbare manier als het in-vivo protocol. Begin met het voorzichtig verwijderen van de dressing. Snijden rond de omtrek van de wond.En scheiden van de spierlaag. Het wondbedmonster kan in meerdere secties worden verdeeld om het aantal monsters te verhogen. Plaats vervolgens de verdeelde monsters in afzonderlijke voorgewogen lege homogenisatiebuizen.Weeg de buis opnieuw en bereken het gewicht van het monster door het gewicht van de buis zonder het monster af te trekken van het gewicht van de buis met het monster. Voeg een milliliter PBS toe aan de homogenisatiebuis die het monster bevat en keer de buis een paar keer om om te spoelen. Verwijder de PBS-was en gooi deze weg.Voeg een milliliter GH-behandeling toe, of PBS als negatieve controle, en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius, met schudden bij 80 RPM. Verwijder de gal uit de dispersieoplossing en plaats deze in een aparte centrifugebuis van 1,5 milliliter. Dit bevat de verspreide cellen.Was het resterende weefsel met één milliliter PBS, zoals eerder gedaan, en gooi de PBS-was weg. Voeg een milliliter PBS toe aan het resterende weefsel en homogeniseer met vijf meter per seconde, gedurende 60 seconden. Verdun zowel de oplossing van gedispergeerde cellen als het gehomogeniseerde weefselmonster serieel door 100 microliter van het monster in 900 microliter PBS in een centrifugebuis van 1,5 milliliter te gieten.Draai het verdunde monster om en ga nog vijf keer door met de verdunning voor in totaal zes verdunningen. Spot het monster door 10 microliters van elke verdunning op het aangegeven gebied op een selectieve agarplaat te pipetten. Tel de KVE en bereken de procentuele dispersie door de verspreide KVE te delen door de totale KVE en te vermenigvuldigen met 100.In dit experiment werden acht tot 10 weken oude vrouwelijke Zwitserse Webster muizen besmet met 10 tot de vierde CFU van PA01 met de luminescentie plasmide PQF50-lux. De infectie mocht gedurende 48 uur worden vastgesteld voordat drie behandelingen van 30 minuten van PBS als voertuigcontrole werden beheerd, of 10% GH als experimentele behandeling om de biofilm EPS te verteren. In rubriek A werden muizen direct na de behandeling en na 10 en 20 uur na de behandeling in beeld brengen.Met behulp van IVIS kan een vastgestelde infectie in het wondbed worden gevisualiseerd en een helder bioluminescent signaal genereren. De verspreiding van bacteriën uit het wondbed kan direct na de GH-behandeling worden gevisualiseerd, maar niet na de PBS-behandeling. Bacteriële verspreiding in de organen kan ook worden gezien door de muis op zijn kant te plaatsen voor beeldvorming, zoals te zien is in de onderste panelen.In sectie B toonden beelden van zowel de PBS- als de GH-behandelde muizen een toename van het luminescente signaal na 20 uur na de behandeling, vergeleken met de voorbehandeling. Het is echter nog steeds belangrijk om CFU te kwantificeren vanwege de detectiedrempel van een luminescentie in IVIS. Na 20 uur na de behandeling werden de muizen geëuthanaseerd en werden de wondbedden en milt verzameld om CFU per gram weefsel op te sommen.Sectie C toont de bacteriële belasting in het wondbed, terwijl sectie D de bacteriële belasting in de milt laat zien. Deze gegevens suggereren verspreide verspreiding van de verspreide bacteriën, omdat bacteriën alleen werden gedetecteerd in de milt van de muizen die werden behandeld met de EPS-gerichte GH-oplossing. Hoewel deze protocollen erg handig zijn, zijn er enkele beperkingen.Ten eerste moet worden opgemerkt dat er een detectiebeperking is met het in-vivo beeldvormingssysteem, of IVIS. Een afname van het lichtsignaal is te zien wanneer de bacteriën in de stationaire fase komen. Daarom is het belangrijk om weefsel van belang te verzamelen en de aanwezige CFU te meten, omdat er een ontkoppeling kan zijn tussen de luminescentie en CFU opgesomd.IVIS is echter nuttig voor het visualiseren van de effectiviteit van de behandeling tijdens een studie, zonder het dier daadwerkelijk te hoeven euthanaseren. Een andere beperking om rekening mee te houden is de eis van nauwlettend toezicht op het verband. Het verband is nodig om contractiele genezing te verminderen en de wond steriel te houden tegen andere bacteriën.Verbanden moeten vaak worden vervangen, wat kan leiden tot accidentele debridement van de wond en kans op besmetting. Deze protocollen beschrijven nieuwe methoden om gal uit dispersie te bestuderen, en de evaluatie van therapeutische gal uit dispergeermiddelen. Deze modellen maken de ontwikkeling mogelijk van complexe polymicrobiale biofilm-geassocieerde infecties die klinisch relevante menselijke infecties nabootsen.We hopen dat deze protocollen zullen worden gebruikt en verfijnd om de ontwikkeling van antibiofilmdispersiemiddelen voor therapeutisch gebruik te bevorderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa en Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow cellen

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Aan de kant van licht komen: In Vivo Monitoring van Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecties in chronische wonden in een diabetische haarloze lymfkliertest Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...