Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), de la Ted Nash Long Life Foundation, de la Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation et du Département de la Défense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Ce protocole animal a été examiné et approuvé par le Institutional Animal Care and Use Committee du Texas Tech University Health Sciences Center (numéro de protocole 07044). Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.
1. Préparation des bactéries pour les infections de souris
REMARQUE: Ici, nous décrivons infecter les souri...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Nous décrivons ici les protocoles qui peuvent être utilisés pour étudier l’efficacité des agents de dispersion du biofilm. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour être utilisés avec différents types d’agents de dispersion, d’espèces bactériennes ou d’échantillons ex vivo, y compris des échantillons de débridement clinique. Ce protocole fournit également un modèle cliniquement pertinent pour collecter et étudier les cellules bactériennes dispersées. Il a été démontré qu...

L’augmentation de la résistance aux antibiotiques dans le monde entier conduit à un manque d’options antibiotiques pour traiter une variété d’infections bactériennes1. En plus de la résistance aux antibiotiques, les bactéries peuvent gagner en tolérance aux antibiotiques en adoptant un mode de vie associé au biofilm2. Un biofilm est une communauté de micro-organismes qui sont protégés par une matrice de polysaccharides, d’ADN extracellulaire, de lipides et de protéines3,collectivement appelée substance polymère extracellulaire (EPS). Alors que la crise de la résistance aux antibiotiques se poursuit, de nouvelles stratégies qui prolongent l’utilisation des antibiotiques ou renforcent leur efficacité font cruellement défaut. Les agents anti-biofilm sont une solution prometteuse4.
Parmi les différentes stratégies anti-biofilm qui ont été proposées, l’utilisation d’agents de dispersion, qui ciblent différents composants de l’EPS du biofilm, est à la pointe du développement thérapeutique5. Les hydrolases glycosides (GH) sont l’une de ces classes d’agents de dispersion. GH sont une grande classe d’enzymes qui catalysent le clivage de différentes liaisons dans les polysaccharides qui fournissent l’intégrité structurelle à l’EPS. Notre groupe, ainsi que d’autres, ont montré que gh peut dégrader efficacement les biofilms, induire la dispersion et améliorer l’efficacité antibiotique pour un certain nombre d’espèces bactériennes différentes, à la fois in vitro et in vivo6,7,8,9,10,11.
Compte fait l’intérêt croissant pour la dispersion du biofilm, il est important de mettre au point des méthodes efficaces pour évaluer l’efficacité de la dispersion. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour le traitement des infections des plaies associées au biofilm avec un agent de dispersion chez la souris, et l’évaluation de l’efficacité de la dispersion, in vivo et ex vivo. L’objectif global est de fournir des méthodes efficaces qui peuvent être utilisées avec des modèles précliniques pour mesurer la dispersion du biofilm de manière efficace et efficiente.
Un modèle murin d’infection chirurgicale d’excision a été employé dans ces études pour établir une infection biofilm-associée. Nous avons utilisé ce modèle pendant plus de 15 ans et publié nos observationsabondamment 7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. En général, il s’agit d’un modèle d’infection non létale où les bactéries restent localisées au lit de la plaie et sont associées au biofilm (bactéries observées dans des agrégats entourés d’EPS), mettant en place une infection chronique qui dure jusqu’à 3 semaines. Cependant, si les souris sont immunodéprimées (avec le diabète de type 1 par exemple), elles peuvent devenir plus susceptibles de développer une infection systémique mortelle dans ce modèle.
Dans ce rapport, nous fournissons des protocoles pour évaluer la dispersion des bactéries d’une blessure, in vivo et ex vivo. Les deux protocoles peuvent être utilisés pour examiner l’efficacité d’un agent de dispersion et ont leurs propres forces et faiblesses. Par exemple, l’évaluation de la dispersion in vivo peut fournir des renseignements importants et en temps réel sur la propagation des bactéries à d’autres parties du corps après la dispersion et sur la façon dont l’hôte réagit. D’autre part, l’évaluation de la dispersion ex vivo peut être plus souhaitable pour le dépistage de plusieurs agents, doses ou formulations, car le tissu peut être divisé en plusieurs sections qui peuvent être testées séparément, réduisant ainsi le nombre de souris requis. Lors de l’évaluation de plusieurs agents, nous mesurons généralement la dispersion d’abord in vitro comme décrit précédemment 6,9,22. Nous testons ensuite les tests ex vivo les plus efficaces et réservons les tests in vivo pour un nombre limité d’agents très prometteurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Les infections liées au biofilm sont impliquées dans un large éventail de maladies chroniques telles que les ulcères du pied diabétique non cicatrisants, la sinusite chronique, l’otite moyenne récurrente et bien d’autres. Les cellules microbiennes de ces infections sont protégées par une substance polymère extracellulaire (EPS), qui peut empêcher les antibiotiques et les cellules immunitaires hôtes d’éliminer l’infection. Pour surmonter cet obstacle, les chercheurs ont commencé à développer des agents de dispersion en tant que thérapies potentielles. Ces agents ciblent divers composants dans l’EPS du biofilm, affaiblissant la structure et initiant la dispersion des bactéries, ce qui peut théoriquement améliorer la puissance antibiotique et la clairance immunitaire. Pour déterminer l’efficacité des agents de dispersion pour les infections des plaies, nous avons développé des protocoles qui mesurent la dispersion du biofilm ex vivo et in vivo. Nous employons un modèle chirurgical d’excision de souris qui a été bien-décrit pour créer des infections chroniques biofilm-associées de blessure. Pour surveiller la dispersion in vivo,nous infectons les plaies avec des souches bactériennes qui expriment la luciférase. Une fois que les infections matures se sont établies, nous irrigueons les plaies avec une solution contenant des enzymes qui dégradent les composants de l’EPS du biofilm. Nous surveillons ensuite l’emplacement et l’intensité du signal luminescent dans les organes filtrants et filtrants pour fournir des informations sur le niveau de dispersion atteint. Pour l’analyse ex vivo de la dispersion du biofilm, le tissu de la plaie infectée est immergé dans une solution enzymatique dégradant le biofilm, après quoi la charge bactérienne restant dans le tissu, par rapport à la charge bactérienne en solution, est évaluée. Les deux protocoles ont des forces et des faiblesses et peuvent être optimisés pour aider à déterminer avec précision l’efficacité des traitements de dispersion.

Dans cette expérience, des souris femelles de Webster suisses âgées de 8 à 10 semaines ont été infectées par 10à 4 UFC de PAO1 portant le plasmide de luminescence pQF50-lux. Comme décrit ci-dessus, on a permis à une infection d’établir pendant 48 h avant d’administrer 3 x 30 traitements de minute de PBS (contrôle du véhicule) ou de GH à 10 % (traitement) pour digérer l’EPS du biofilm. Des souris ont été idés prétraitement, directement après traitement (0 h) et à 10 h et 20 h après l...

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Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Ici, nous décrivons des méthodes ex vivo et in vivo pour évaluer la dispersion bactérienne d’une infection de blessure chez la souris. Ce protocole peut être utilisé pour tester l’efficacité des thérapies topiques antimicrobiennes et anti-biofilm, ou pour évaluer la capacité de dispersion de différentes souches ou espèces bactériennes.

Évaluation de la dispersion du biofilm dans les plaies murines

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Les microbiologistes et les infectiologues commencent à réaliser à quel point les infections associées au biofilm sont importantes dans les maladies chroniques. Les NIH ont même déclaré que plus de 80% des infections chroniques sont dues à des biofilms bactériens. Cela a donc incité à mettre l’accent sur le biofilm et à développer des thérapies qui s’attaquent au problème du biofilm.Et beaucoup de ces thérapies sont axées sur la dispersion des cellules bactériennes qui sont dans les biofilms hors du biofilm afin qu’elles puissent être plus facilement tuées. Mais il n’y a vraiment pas beaucoup de protocoles dans la littérature actuellement qui traitent de la façon de déterminer l’efficacité d’un tel agent de dispersion. Nous pensons donc que c’est un bon protocole à utiliser.C’est un type d’infection bactérienne qui est associé au biofilm. Et nous pensons aussi qu’il peut être optimisé assez facilement pour étudier de nombreux types différents d’espèces bactériennes, et comment ils forment des biofilms et se dispersent, ainsi que différents agents de dispersion. Et nous pensons qu’il est important de fournir cela dans un format vidéo, parce que nous avons vu qu’il y a des nuances à la livraison de l’agent que nous avons trouvé de travail optimal chez la souris.Pour commencer, évaluez le plan d’anesthésie par pincement des pincements aux yeux et en surveillant la fréquence respiratoire et l’effort. Rasez la surface dorsale et appliquez une crème dépilatoire sur la région rasée pendant 10 minutes, ou selon les instructions du produit. Retirez doucement la crème dépilatoire.Et assurez-vous que la peau est sèche. À l’aide d’un marqueur anti-alcool, dessinez un cercle d’un diamètre de 1,5 centimètre vers la région postérieure du dos. Pour la gestion de la douleur, administrer 0,05 millilitres de lidocaïne par voie sous-cutanée dans la zone à exciser.Et 0,02 millilitres de buprénorphine par voie sous-cutanée dans la peau du cou. Attendez 10 minutes pour vous assurer que la gestion de la douleur est atteinte. Avant l’excision, désinfectez la surface dorsale à l’aide d’un écouvillon d’alcool.Maintenez un champ chirurgical stérile tout au long de la procédure et utilisez des instruments autoclavés et des gants stériles pour limiter la contamination. Administrer une plaie de peau excisionnelle de pleine épaisseur au niveau du muscle panniculus, avec des ciseaux chirurgicaux. Après l’excision, couvrir immédiatement la plaie avec un pansement en polyuréthane semi-perméable.Séparez soigneusement le support du pansement à l’aide de deux pinces à pointe fine, le cas échéant. Injecter environ 10 à la quatrième UFC de bactéries, et 100 microlitres PBS sous le pansement et sur le lit de la plaie pour établir une infection. Notez que les plaies peuvent également être infectées par plusieurs espèces de bactéries et /ou de champignons simultanément, ou en plaçant des biofilms préformés ou même du tissu de débridement extrait des patients sur le lit de la plaie.Après l’infection, placez les souris dans des cages sur des serviettes en papier pour empêcher les souris de s’asphyxie sur le matériau de la literie. Placez les cages sur des coussins chauffants et surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles aient retrouvé leur réflexe de redressement. Retirez l’essuie-tout à ce stade.Laisser les infections des plaies s’établir pendant 48 heures. Inspectez quotidiennement le pansement pour les déchirures dans les zones de nonadherence et remplacez-le si nécessaire. Placez les souris sous anesthésie isoflurane à 3% et un litre par minute d’oxygène, tout en administrant des traitements.Injectez 200 microlitres de solution enzymatique ou de contrôle PBS sur la plaie en soulevant la peau légèrement antérieure de la plaie avec une pince, en perçant soigneusement la peau soulevée avec la seringue et en injectant lentement la solution dans la zone située entre le lit de la plaie et le pansement. Pour vous assurer que tout le lit de la plaie est recouvert d’une solution, soulevez doucement le pansement avec une pince, en l’éloignant du lit de la plaie, tout en injectant lentement la solution. Après le traitement, replacez les souris dans des cages pendant 30 minutes.Après 30 minutes d’exposition au traitement, réanesthétiser les souris avec de l’isoflurane et aspirer la solution restante avec une seringue, en perforant dans la même zone qu’auparavant. Notez que cette solution aspirée contient des cellules bactériennes dispersées, qui peuvent être conservées pour diverses analyses en aval. Administrer les deuxième et troisième traitements d’irrigation comme cela a été fait pour le premier à l’aide d’une nouvelle seringue à chaque fois.Si une souche luminescente de bactéries est utilisée pour initier l’infection, un système d’imagerie in vivo peut être utilisé pour visualiser la dispersion du lit de la plaie. Pour l’analyse, ouvrez les images dans le logiciel IVIS et sélectionnez la zone à analyser avec la palette d’outils. Pour tenir compte de l’arrière-plan, placez un cercle sur l’arrière-plan d’une image, puis placez le même cercle de taille sur le lit de plaie pour chaque souris.Dans la palette d’outils, sélectionnez Mesurer les ROIs et téléchargez la table des mesures dans une feuille de calcul. Soustrayez la lecture du cercle de fond de chacune des mesures du lit de plaie pour calculer la luminescence pour chaque échantillon. Après une euthanasie sans cruauté, récoltez le tissu du lit de la plaie en enlevant d’abord doucement le pansement avec une pince stérile et en coupant autour du périmètre du lit de la plaie avec des ciseaux chirurgicaux stériles.Utilisez une pince pour soulever doucement une extrémité du lit de la plaie, puis utilisez des ciseaux pour couper l’échantillon de tissu loin de la couche musculaire. Placer l’échantillon de tissu dans un tube d’homogénéisation de deux millilitres pré-pesé contenant un millilitre de PBS. Peser à nouveau le tube après avoir inséré l’échantillon.Pour récolter la rate, placez la souris dans une position anatomique couchée sur le décubitus dorsal et fixez-la en épinglant les extrémités à une surface de dissection. Faites tremper la zone à disséquer avec de l’éthanol à 70% pour aider à prévenir la contamination. Faire une petite incision perpendiculaire à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux dans le derme du bas-ventre.Assurez-vous de tirer la peau vers le haut et loin des organes internes. Continuer l’incision le long de la ligne médiane jusqu’à ce que le sternum soit atteint. Une fois que la cavité péritonéale est exposée et que les organes internes sont visibles, séparez la rate du tissu conjonctif et placez-la dans un tube d’homogénéisation pré-pesé séparé.Peser à nouveau le tube après avoir inséré la rate. Homogénéiser les échantillons à cinq mètres par seconde, pendant 60 secondes, deux fois. Pour énumérer l’UFC, diluer en série et plaque ponctuelle les échantillons homogénéisés.Diluer en série par pipetage 100 microlitres de l’échantillon homogénéisé en 900 microlitres de PBS et un tube centrifugeur de 1,5 millilitre. Vortex avant de poursuivre la dilution par canalisation de 100 microlitres de l’échantillon dilué dans un tube séparé contenant 900 microlitres de PBS. Répétez ces étapes jusqu’à ce que six dilutions soient atteintes.Pipetter 10 microlitres de chaque dilution sur la zone indiquée sur une plaque de gélose comme indiqué. Si une quantification plus précise de l’UFC est nécessaire, étaler 100 microlitres de chaque dilution de l’échantillon sur des plaques de gélose distinctes. Enroulé et infecter des souris avec environ 10 à la quatrième UFC de bactéries, comme décrit dans le protocole in vivo.Laissez l’infection s’établir pendant 48 heures, puis extrayez le lit de la plaie de la même manière que le protocole in vivo. Commencez par retirer soigneusement le pansement. Coupe autour du périmètre de la plaie.Et se séparer de la couche musculaire. L’échantillon de lit de plaie peut être divisé en plusieurs sections pour augmenter le nombre d’échantillons. Placez ensuite les échantillons divisés dans des tubes d’homogénéisation vides pré-pesés séparés.Peser à nouveau le tube et calculer le poids de l’échantillon en soustrayant le poids du tube sans l’échantillon du poids du tube avec l’échantillon. Ajouter un millilitre de PBS au tube d’homogénéisation contenant l’échantillon et inverser doucement le tube plusieurs fois pour le rincer. Retirez le lavage pbs et jetez-le.Ajouter un millilitre de traitement GH, ou PBS comme un contrôle négatif, et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius, avec secouer à 80 RPM. Retirer la bile de la solution de dispersion et la placer dans un tube de centrifugation séparé de 1,5 millilitre. Celui-ci contient les cellules dispersées.Laver le tissu restant avec un millilitre de PBS, comme cela a été fait précédemment, et jeter le lavage PBS. Ajouter un millilitre de PBS au tissu restant et homogénéiser à cinq mètres par seconde, pendant 60 secondes. Diluer en série à la fois la solution de cellules dispersées et l’échantillon de tissu homogénéisé en piper 100 microlitres de l’échantillon dans 900 microlitres de PBS dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.Vortex de l’échantillon dilué et poursuivre la dilution cinq fois de plus pour un total de six dilutions. Plaque spot l’échantillon en piper 10 microlitres de chaque dilution sur la zone indiquée sur une plaque de gélose sélective. Comptez l’UFC et calculez le pourcentage de dispersion en divisant l’UFC dispersée par l’UFC totale et en multipliant par 100.Dans cette expérience, huit à 10 souris femelles de Webster suisses de semaine ont été infectées par 10 à la quatrième UFC de PA01 portant le plasmide de luminescence PQF50-lux. On a permis à l’infection d’établir pendant 48 heures avant d’administrer trois traitements de 30 minutes de PBS comme contrôle de véhicule, ou de 10% GH comme traitement expérimental pour digérer l’EPS de biofilm. Dans la section A, les souris ont été essées avant le traitement, directement après le traitement et 10 et 20 heures après le traitement.En utilisant IVIS, une infection établie peut être visualisée dans le lit de la plaie générant un signal bioluminescent lumineux. La dispersion des bactéries hors du lit de blessure peut être visualisée immédiatement après le traitement de GH, mais pas après le traitement de PBS. La dissémination bactérienne dans les organes peut également être vue en plaçant la souris sur le côté pour l’imagerie, comme indiqué dans les panneaux inférieurs.Dans la section B, des images de souris traitées au PBS et au GH ont démontré une augmentation du signal luminescent 20 heures après le traitement, par rapport au prétraitement. Cependant, il est toujours important de quantifier l’UFC en raison du seuil de détection d’une luminescence dans IVIS. À 20 heures après le traitement, les souris ont été euthanasiées et les lits de plaies et les rates ont été recueillis pour dénombrer l’UFC par gramme de tissu.La section C montre la charge bactérienne dans le lit de la plaie, tandis que la section D montre la charge bactérienne dans la rate. Ces données suggèrent une propagation disséminée des bactéries dispersées, puisque les bactéries n’ont été détectées que dans la rate des souris traitées avec la solution GH ciblant l’EPS. Bien que ces protocoles soient très utiles, il existe certaines limitations.Tout d’abord, il convient de noter qu’il existe une limitation de détection avec le système d’imagerie in vivo, ou IVIS. Une diminution du signal luminescent peut être observée lorsque les bactéries entrent en phase stationnaire. Par conséquent, il est important de recueillir les tissus d’intérêt et de mesurer l’UFC présente, car il peut y avoir un décalage entre la luminescence et l’UFC énumérées.Cependant, IVIS est utile pour visualiser l’efficacité du traitement tout au long d’une étude, sans avoir à euthanasier réellement l’animal. Une autre limite à prendre en considération est l’exigence d’une surveillance étroite des bandages. Les bandages sont nécessaires pour réduire la cicatrisation contractile ainsi que pour garder la plaie stérile des autres bactéries.Les bandages devront être remplacés souvent, ce qui peut entraîner un débridement accidentel de la plaie et une possibilité de contamination. Ces protocoles décrivent des méthodes nouvelles pour étudier la bile de la dispersion, et l’évaluation de la bile thérapeutique des agents de dispersion. Ces modèles permettent le développement d’infections complexes associées au biofilm polymicrobial qui imitent les infections humaines cliniquement pertinentes.Nous espérons que ces protocoles seront utilisés et affinés pour poursuivre le développement d’agents de dispersion anti-biofilm à usage thérapeutique.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Recherche

Immunologie et infection

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