Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (R21 AI137462-01A1), קרן טד נאש לונג לייף, קרן ג'ספר ל' וג'ק דנטון וילסון ומשרד ההגנה (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

פרוטוקול זה של בעלי חיים נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (פרוטוקול מספר 07044). מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.
1. הכנת חיידקים לזיהומים בעכבר
<p class="...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

כאן אנו מתארים פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את היעילות של סוכני פיזור biofilm. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לשימוש עם סוגים שונים של חומרי פיזור, מינים חיידקיים או דגימות ex vivo, כולל דגימות פסולת קלינית. פרוטוקול זה מספק גם מודל רלוונטי קלינית לאיסוף וחקר תאים חיידקי...

עליית עמידות לאנטיביוטיקה ברחבי העולם מובילה לחוסר אפשרויות אנטיביוטיות לטיפול במגוון זיהומים חיידקיים1. בנוסף לעמידות לאנטיביוטיקה, חיידקים יכולים להשיג סובלנות אנטיביוטית על ידי אימוץ אורח חיים הקשור לביופילם2. ביופילם היא קהילה של מיקרואורגניזמים המוגנים על ידי מטריצה של פוליסכרידים, דנ"א חוץ תאי, שומנים וחלבונים3, הנקראים באופן קולקטיבי החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS). ככל שמשבר ההתנגדות לאנטיביוטיקה נמשך, אסטרטגיות חדשות המאריכות את השימוש, או מחזקות את היעילות של, אנטיביוטיקה נחוצות מאוד. סוכני אנטי-ביופילם הם פתרון מבטיח אחד4.
בין אסטרטגיות אנטי-ביופילם שונות שהוצעו, ניצול סוכני פיזור, אשר למקד רכיבים שונים של EPS biofilm, נמצאים בחזית הפיתוח הטיפולי5. גליקוסייד הידרולאס (GH) הם סוג אחד כזה של חומר פיזור. GH הם סוג גדול של אנזימים לזרז את המחשוף של קשרים שונים בתוך פוליסכרידים המספקים שלמות מבנית EPS. הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, הראו כי GH יכול ביעילות להשפיל biofilms, לגרום לפיזור ולשפר את היעילות האנטיביוטית עבור מספר מינים חיידקיים שונים, הן במבחנה והן vivo6,7,8,9,10,11.
עם עניין גובר פיזור biofilm,חשוב לפתח שיטות יעילות להעריך את יעילות הפיזור. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לטיפול בדלקות פצע הקשורות biofilm עם סוכן פיזור בעכברים, ואת ההערכה של יעילות פיזור, ב vivo ו ex vivo. המטרה הכוללת היא לספק שיטות יעילות שניתן להשתמש בהן עם מודלים פרה-קוליניים למדידת פיזור ביופילם ביעילות וביעילות.
מודל זיהום כריתה כירורגית מורין שימש במחקרים אלה כדי להקים זיהום הקשורים biofilm. השתמשנו במודל זה למעלה מ-15 שנה ופרסמנו את התצפיות שלנו בהרחבה7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. באופן כללי, זהו מודל זיהום לא קטלני שבו חיידקים נשארים מקומיים למיטת הפצע והם הקשורים לביופילם (חיידקים הנראים בצבירות המוקפות ב- EPS), ומגדירים זיהום כרוני שנמשך עד 3 שבועות. עם זאת, אם עכברים הם immunocompromised (עם סוכרת מסוג 1 למשל), הם יכולים להיות רגישים יותר לפתח זיהום מערכתי קטלני במודל זה.
בדו"ח זה, אנו מספקים פרוטוקולים להערכת פיזור של חיידקים מפצע, הן vivo ו ex vivo. שני הפרוטוקולים יכולים לשמש כדי לבחון את היעילות של סוכן פיזור ויש להם נקודות החוזק והחולשה שלהם. לדוגמה, הערכת פיזור ב vivo יכול לספק חשוב, מידע בזמן אמת על התפשטות חיידקים לחלקים אחרים של הגוף לאחר פיזור, וכיצד המארח מגיב. מצד שני, הערכת ex vivo פיזור עשוי להיות רצוי יותר עבור סינון סוכנים מרובים, מינונים, או ניסוחים, כמו הרקמה ניתן לחלק סעיפים מרובים שניתן לבדוק בנפרד, ובכך להפחית את מספר העכברים הנדרש. בעת הערכת סוכנים מרובים, אנו בדרך כלל למדוד פיזור הראשון במבחנה כפי שתואר קודם לכן 6,9,22. לאחר מכן אנו בודקים את ex vivo היעיל ביותר ומילואים בדיקות vivo עבור מספר מוגבל של סוכנים מבטיחים מאוד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

זיהומים הקשורים Biofilm מעורבים במגוון רחב של מצבים כרוניים כגון כיבים ברגל סוכרתית שאינם ריפוי, סינוסיטיס כרונית, מדיה דלקת אוזניים חוזרת, ועוד רבים. תאים מיקרוביאליים בתוך זיהומים אלה מוגנים על ידי חומר פולימרי חוץ תאי (EPS), אשר יכול למנוע אנטיביוטיקה ולארח תאים חיסוניים מפני ניקוי הזיהום. כדי להתגבר על מכשול זה, חוקרים החלו לפתח סוכני פיזור כטיפולים פוטנציאליים. סוכנים אלה מתמקדים ברכיבים שונים בתוך ה- EPS של הביופילם, מחלישים את המבנה ויוזמים פיזור של החיידקים, אשר תיאורטית יכול לשפר את העוצמה האנטיביוטית ואת הסיווג החיסוני. כדי לקבוע את היעילות של סוכני פיזור עבור זיהומים פצע, פיתחנו פרוטוקולים המודדים פיזור biofilm הן ex vivo ו in vivo. אנו משתמשים במודל כריתה כירורגית של עכבר שתואר היטב כדי ליצור זיהומים כרוניים הקשורים לביופילם. כדי לפקח על פיזור vivo, אנו מדביקים את הפצעים עם זנים חיידקיים המבטאים לוציפראז. לאחר זיהומים בוגרים הוקמו, אנו להשקות את הפצעים עם פתרון המכיל אנזימים להשפיל רכיבים של EPS biofilm. לאחר מכן אנו עוקבים אחר המיקום והעוצמה של האות הזוהר בפצע ואיברים מסננים כדי לספק מידע על רמת הפיזור שהושגה. לניתוח ex vivo של פיזור biofilm, רקמת פצע נגוע שקוע בתמיסת אנזים משפיל biofilm, ולאחר מכן עומס חיידקי שנותר ברקמה, לעומת עומס חיידקי בתמיסה, מוערך. שני הפרוטוקולים יש חוזקות וחולשות והוא יכול להיות אופטימיזציה כדי לעזור לקבוע במדויק את היעילות של טיפולים פיזור.

בניסוי זה, עכברי וובסטר שוויצריים בני 8-10 שבועות נדבקוב-10 4 CFU של PAO1 הנושאים את פלסמיד הזוהר pQF50-lux. כפי שתואר לעיל, זיהום הורשה להקים במשך 48 שעות לפני מתן 3 x 30 דקות טיפולים של PBS (בקרת רכב) או 10% GH (טיפול) לעכל את EPS biofilm. עכברים צולמו טרום טיפול, מיד לאחר הטיפול (0 שעות) וב 10 שעות ו 20 שעות לאחר הט?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

כאן, אנו מתארים אקס ויוו ושיטות vivo להערכת פיזור חיידקים מזיהום פצע בעכברים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי לבדוק את היעילות של טיפולים אנטי מיקרוביאלית אקטואלי אנטי ביופילם, או כדי להעריך את יכולת הפיזור של זנים חיידקיים שונים או מינים שונים.

הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

מיקרוביולוגים ורופאים למחלות זיהומיות מתחילים להבין עד כמה חשובים זיהומים הקשורים לביופילם במחלות כרוניות. NIH אפילו אמר כי מעל 80% של זיהומים כרוניים נובעים biofilms חיידקי. אז זה דחק בדגש על טיפול בביופילם, ופיתוח טיפולים המטפלים בבעיית הביופילם.והרבה טיפולים אלה מתמקדים בפיזור תאים חיידקיים שנמצאים בביופילמים מתוך הביופילם, כך שהם יכולים להיהרג בקלות רבה יותר. אבל באמת אין הרבה פרוטוקולים בספרות כרגע שמטפלים כיצד לקבוע את היעילות של סוכן פיזור כזה. אז אנחנו מרגישים שזה פרוטוקול טוב לשימוש.זהו סוג אחד של זיהום חיידקי הקשור לביופילם. ואנחנו גם חושבים שזה יכול להיות אופטימיזציה די בקלות ללמוד סוגים רבים ושונים של מינים חיידקיים, וכיצד הם יוצרים biofilms ולפזר, כמו גם סוכני פיזור שונים. ואנחנו חושבים שזה חשוב לספק את זה בפורמט וידאו, כי ראינו שיש ניואנסים במיוחד את המסירה של הסוכן שמצאנו עבודה אופטימלית בעכברים.כדי להתחיל, להעריך את המישור של הרדמה על ידי צביטה בוהן, ועל ידי ניטור קצב הנשימה ומאמץ. גילחו את משטח הגב והחילו קרם דפילטורי על האזור המגולח למשך 10 דקות, או לפי הוראות המוצר. מוציאים בעדינות את קרם ההשפלה.ולוודא שהעור יבש. באמצעות סמן עמיד בפני אלכוהול, לצייר עיגול בקוטר של 1.5 ס"מ לכיוון האזור האחורי של הגב. לטיפול בכאב, לנהל 0.05 מיליליטר של לידוקאין תת עורית לתוך האזור כדי להיות מגורש.ו-0.02 מיליליטר של בופרנורפין תת עורית בעורף. המתן 10 דקות כדי להבטיח הגעה לטיפול בכאב. לפני כריתה, לחטא את משטח הגב באמצעות ספוגית אלכוהול.לשמור על שדה כירורגי סטרילי לאורך כל ההליך, ולהשתמש במכשירים autoclaved וכפפות סטריליות כדי להגביל את הזיהום. לנהל פצע עור כריתה בעובי מלא לרמה של שריר panniculus, עם מספריים כירורגיים. לאחר כריתה, מיד לכסות את הפצע עם רוטב פוליאוריתן למחצה.בזהירות להפריד את הגיבוי מן ההלבשה באמצעות שני מלקחיים עדינים, אם רלוונטי. להזריק כ 10 ל CFU הרביעי של חיידקים, ו 100 מיקרוליטר PBS מתחת להלבשה על מיטת הפצע כדי ליצור זיהום. הערה, פצעים יכולים גם להיות נגועים במינים מרובים של חיידקים ו / או פטריות בו זמנית, או על ידי הצבת biofilms מעוצב מראש או אפילו רקמת debridement שחולצו מחולים על מיטת הפצע.לאחר ההדבקה, מניחים עכברים בכלובים על גבי מגבות נייר כדי למנוע מהעכברים להיחנק מחומר המצעים. מניחים את הכלובים על רפידות חימום ומנטרים את העכברים עד שהם חוזרים לרפלקס הימני שלהם. הסר את מגבת הנייר בשלב זה.אפשר זיהומים פצע להקים במשך 48 שעות. בדוק את ההלבשה מדי יום עבור דמעות באזורים של חוסר כבוד ולהחליף אותו במידת הצורך. מניחים עכברים תחת הרדמה isoflurane ב 3%וליטר אחד לדקה של חמצן, תוך מתן טיפולים.להזריק 200 microliters של פתרון אנזים או בקרת PBS על הפצע על ידי הרמת העור מעט לפני הפצע עם מלקחיים, בזהירות פירסינג העור הרים עם המזרק, ולאט לאט מזריק את הפתרון לאזור בין מיטת הפצע ואת ההלבשה. כדי להבטיח כי מיטת הפצע כולו מכוסה בתמיסה, בעדינות להעלות את ההלבשה עם מלקחיים, מושך אותו ממיטת הפצע, תוך הזרקת הפתרון לאט. לאחר הטיפול, מניחים את העכברים בחזרה בכלובים במשך 30 דקות.לאחר 30 דקות של חשיפה לטיפול, reanesthetize העכברים עם איזופלורן לשאוף את הפתרון הנותר עם מזרק, ניקוב באותו אזור כמו קודם. הערה, פתרון שאיפה זה מכיל תאים חיידקיים מפוזרים, אשר ניתן לשמור עבור ניתוחים שונים במורד הזרם. לנהל את טיפולי ההשקיה השני והשלישי כפי שנעשה עבור הראשון באמצעות מזרק חדש בכל פעם.אם זן זוהר של חיידקים מנוצל כדי ליזום זיהום, מערכת הדמיה in-vivo יכול לשמש כדי לדמיין פיזור ממיטת הפצע. לצורך ניתוח, פתח את התמונות בתוכנת IVIS ובחר את האזור שיש לנתח באמצעות לוח הכלים. כדי להסביר את הרקע, הנח עיגול על רקע תמונה ולאחר מכן הניח את אותו עיגול בגודל על גבי מיטת הפצע עבור כל עכבר.מתוך לוח הכלים, בחרו 'מדידת החזרי ROIs' והעלו את טבלת המידות לגיליון אלקטרוני. הפחת את קריאת מעגל הרקע מכל אחת ממדידות מיטת הפצע כדי לחשב זוהר עבור כל דגימה. לאחר המתת חסד אנושית, לקצור את רקמת מיטת הפצע על ידי הסרת ההלבשה בעדינות עם מלקחיים סטריליים, וחיתוך סביב היקף מיטת הפצע עם מספריים כירורגיים סטריליים.השתמש מלקחיים בעדינות להרים קצה אחד של מיטת הפצע, ולאחר מכן להשתמש במספריים כדי לחתוך את דגימת הרקמה משכבה השריר. מניחים את דגימת הרקמה בצינור הומוגניזציה שני מיליליטר שקל מראש המכיל מיליליטר אחד של PBS. לשקול את הצינור שוב לאחר החדרת המדגם.כדי לקצור את הטחול, מניחים את העכבר בעמדה אנטומית על-חושית ומאובטחים על-ידי הצמדת הגפיים למשטח ניתוח. משרים את האזור כדי להיות מנותח עם 70% אתנול כדי לסייע במניעת זיהום. הפוך חתך קטן בניצב לקו האמצע עם מספריים כירורגיים בדרמיס של הבטן התחתונה.הקפידו למשוך את העור למעלה והתרחקות מהאיברים הפנימיים. המשך את החתך לאורך קו האמצע עד עצם החזה הוא הגיע. לאחר חלל הצפק נחשף ואת האיברים הפנימיים גלויים, להפריד את הטחול מרקמת החיבור ומניחים בצינור הומוגניזציה נפרד שקל מראש.לשקול את הצינור שוב לאחר החדרת הטחול. הומוגניזציה הדגימות בחמישה מטרים לשנייה, במשך 60 שניות, פעמיים. כדי למנות CFU, לדלל באופן סדרתי צלחת נקודה דגימות הומוגניות.לדלל באופן סדרתי על ידי pipetting 100 microliters של מדגם הומוגני לתוך 900 microliters של PBS וצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. וורטקס לפני המשך הדילול על ידי pipetting 100 microliters של מדגם מדולל לתוך צינור נפרד המכיל 900 microliters של PBS. חזור על שלבים אלה עד שישה דילולים מושגים.פיפטה 10 מיקרוליטרים של כל דילול על האזור המצוין על צלחת אגר כפי שמוצג. אם נדרשת כמות CFU מדויקת יותר, מורחים 100 מיקרוליטרים של כל דילול של המדגם על פני לוחות אגר נפרדים. פצע ולהדביק עכברים עם כ 10 כדי CFU הרביעי של חיידקים, כמתואר בפרוטוקול in vivo.אפשר לזיהום להקים במשך 48 שעות, ולאחר מכן לחלץ את מיטת הפצע באופן דומה לפרוטוקול in-vivo. התחל על ידי הסרת ההלבשה בזהירות. חותך סביב היקף הפצע.ונפרד משכבה השריר. ניתן לחלק את דגימת מיטת הפצע למספר חלקים כדי להגדיל את מספר הדגימות. לאחר מכן מניחים את הדגימות המחולקות לצינורות הומוגניזציה ריקים נפרדים ששוקל מראש.לשקול את הצינור שוב ולחשב את המשקל של המדגם על ידי חיסור המשקל של הצינור ללא המדגם ממשקל הצינור עם המדגם. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לצינור הומוגניזציה המכיל את המדגם, בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לשטוף. הסר את שטיפת PBS והשליך.הוסף מיליליטר אחד של טיפול GH, או PBS כפקד שלילי, ואת הדגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס, עם רועד ב 80 סל"ד. מוציאים את המרה מתמיסת הפיזור ומניחים בצינור צנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר. זה מכיל את התאים המפוזרים.לשטוף את הרקמה הנותרת עם מיליליטר אחד של PBS, כפי שנעשה בעבר, ולהשליך את לשטוף PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לרקמה הנותרת והומוגניים בחמישה מטרים לשנייה, למשך 60 שניות. לדלל באופן סדרתי הן את הפתרון של תאים מפוזרים מדגם רקמה הומוגנית על ידי pipetting 100 microliters של המדגם לתוך 900 microliters של PBS בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.וורטקס המדגם מדולל ולהמשיך את הדילול חמש פעמים נוספות עבור סך של שישה דילולים. צלחת ספוט המדגם על ידי pipetting 10 microliters של כל דילול על האזור המצוין על צלחת אגר סלקטיבית. ספור את ה- CFU וחשב פיזור באחוזים על-ידי חלוקת ה- CFU המפוזר ב- CFU הכולל והכפלה ב- 100.בניסוי זה, שמונה עד 10 שבועות נקבה עכברי וובסטר שוויצרי נדבקו 10 עד CFU הרביעי של PA01 נושאת את הזוהר pQF50-lux. הזיהום הורשה להקים במשך 48 שעות לפני ניהול שלושה טיפולים של 30 דקות של או PBS כבקרת רכב, או 10%GH כטיפול ניסיוני לעכל את EPS biofilm. מוצג בסעיף A, עכברים צולמו טרום טיפול, מיד לאחר הטיפול, וב 10 ו 20 שעות לאחר הטיפול.באמצעות IVIS, זיהום מבוסס ניתן לדמיין בתוך מיטת הפצע יצירת אות bioluminescent בהיר. פיזור של חיידקים מתוך מיטת הפצע ניתן לדמיין מיד לאחר הטיפול GH, אבל לא לאחר הטיפול PBS. הפצה חיידקית לתוך האיברים ניתן לראות גם על ידי הנחת העכבר על צידו להדמיה, כפי שמוצג בלוחות התחתונים.בסעיף B, תמונות הן של PBS והן של עכברים שטופלו ב-GH הראו עלייה באות הזוהר ב-20 שעות לאחר הטיפול, בהשוואה לטיפול מקדים. עם זאת, עדיין חשוב לכמת CFU בשל סף הזיהוי של זוהר ב- IVIS. בשעה 20 שעות לאחר הטיפול, העכברים היו מורדמים ומיטות הפצע והטחול נאספו כדי למנות CFU לגרם של רקמה.סעיף C מראה את העומס החיידקי במיטת הפצע, בעוד סעיף D מראה את העומס החיידקי בטחול. נתונים אלה מצביעים על התפשטות מופצת של החיידקים המפוזרים, שכן חיידקים זוהו רק בטחול של העכברים שטופלו בתמיסת EPS-מיקוד GH. למרות פרוטוקולים אלה הם מאוד שימושי, יש כמה מגבלות.ראשית, יש לציין כי קיימת מגבלת זיהוי עם מערכת ההדמיה in-vivo, או IVIS. ירידה באות הזוהר ניתן לראות כאשר החיידקים נכנסים לשלב נייח. לכן חשוב לאסוף רקמה של עניין ולמדוד את ה- CFU הנוכחי, שכן יכול להיות נתק בין הזוהר לבין CFU הממוין.עם זאת, IVIS שימושי עבור לדמיין את היעילות של הטיפול לאורך כל המחקר, מבלי באמת להרדים את החיה. מגבלה נוספת שיש לקחת בחשבון היא הדרישה לפיקוח הדוק על התחבושות. התחבושות נדרשות כדי להפחית ריפוי התכווצות, כמו גם לשמור על הפצע סטרילי מחיידקים אחרים.תחבושות יצטרכו להיות מוחלפות לעתים קרובות, אשר יכול להוביל לפסולת מקרית של הפצע והזדמנות לזיהום. פרוטוקולים אלה מתארים שיטות חדשניות לחקר מרה מפיזור, והערכת מרה טיפולית מסוכני פיזור. מודלים אלה מאפשרים פיתוח של זיהומים מורכבים הקשורים לביופילם פולימיקרוביאלי המחקים זיהומים אנושיים רלוונטיים קלינית.תקוותנו היא כי פרוטוקולים אלה ינוצלו ומעודנים כדי לקדם את הפיתוח של סוכני פיזור אנטי ביופילם לשימוש טיפולי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

הערכת Hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס B לאחר Overexpression או מציאה של גנים ספציפיים

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...