Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), della Ted Nash Long Life Foundation, della Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation e del Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Questo protocollo sugli animali è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Texas Tech University Health Sciences Center (protocollo numero 07044). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute.
1. Preparare i batteri per le infezioni del topo
NOTA: Qui descriviamo infettare i topi solo co...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Qui descriviamo protocolli che possono essere utilizzati per studiare l'efficacia degli agenti di dispersione del biofilm. Questi protocolli possono essere facilmente adattati all'uso con diversi tipi di agenti dispersivi, specie batteriche o campioni ex vivo, inclusi campioni clinici di debridement. Questo protocollo fornisce anche un modello clinicamente rilevante per raccogliere e studiare cellule batteriche disperse. I fenotipi delle cellule batteriche disperse si sono dimostrati distinti da quelli delle cel...

L'aumento della resistenza agli antibiotici in tutto il mondo sta portando alla mancanza di opzioni antibiotiche per trattare una varietà di infezioni batteriche1. Oltre alla resistenza agli antibiotici, i batteri possono ottenere tolleranza agli antibiotici adottando uno stile di vita associato al biofilm2. Un biofilm è una comunità di microrganismi che sono protetti da una matrice di polisaccaridi, DNA extracellulare, lipidi e proteine 3 ,collettivamente chiamatasostanza polimerica extracellulare (EPS). Mentre la crisi di resistenza agli antibiotici continua, sono estremamente necessarie nuove strategie che prolungano l'uso o potenziano l'efficacia degli antibiotici. Gli agenti anti-biofilm sono una soluzione promettente4.
Tra le diverse strategie anti-biofilm che sono state proposte, l'utilizzo di agenti di dispersione, che si rivolgono a diversi componenti del biofilm EPS, sono in prima linea nello sviluppo terapeutico5. Le idrolasi glicosidi (GH) sono una di queste classi di agente dispersivo. I GH sono una grande classe di enzimi che catalizzano la scissione di diversi legami all'interno dei polisaccaridi che forniscono integrità strutturale all'EPS. Il nostro gruppo, così come altri, hanno dimostrato che gh può degradare efficacemente i biofilm, indurre dispersione e migliorare l'efficacia antibiotica per una serie di diverse specie batteriche, sia in vitro che in vivo6,7,8,9,10,11.
Con un crescente interesse per la dispersione del biofilm, è importante sviluppare metodi efficaci che valutazioneno l'efficacia della dispersione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il trattamento delle infezioni della ferita associate al biofilm con un agente di dispersione nei topi e la valutazione dell'efficacia della dispersione, in vivo ed ex vivo. L'obiettivo generale è quello di fornire metodi efficaci che possano essere utilizzati con modelli preclinici per misurare la dispersione del biofilm in modo efficace ed efficiente.
Un modello di infezione da escissione chirurgica murina è stato utilizzato in questi studi per stabilire un'infezione associata al biofilm. Abbiamo utilizzato questo modello per oltre 15 anni e pubblicato ampiamente le nostre osservazioni7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. In generale, questo è un modello di infezione non letale in cui i batteri rimangono localizzati nel letto della ferita e sono associati al biofilm (batteri visti in aggregati circondati da EPS), creando un'infezione cronica che dura fino a 3 settimane. Tuttavia, se i topi sono immunocompro compromessi (ad esempio con diabete di tipo 1), possono diventare più suscettibili allo sviluppo di un'infezione sistemica fatale in questo modello.
In questa relazione, forniamo protocolli per valutare la dispersione dei batteri da una ferita, sia in vivo che ex vivo. Entrambi i protocolli possono essere utilizzati per esaminare l'efficacia di un agente di dispersione e avere i propri punti di forza e di debolezza. Ad esempio, valutare la dispersione in vivo può fornire informazioni importanti e in tempo reale sulla diffusione dei batteri in altre parti del corpo dopo la dispersione e su come l'ospite risponde. D'altra parte, valutare la dispersione ex vivo può essere più desiderabile per lo screening di più agenti, dosi o formulazioni, in quanto il tessuto può essere diviso in più sezioni che possono essere testate separatamente, riducendo così il numero di topi richiesti. Quando valutiamo più agenti, in genere misuriamo la dispersione prima in vitro come descritto in precedenza 6,9,22. Testiamo quindi l'ex vivo più efficace e riserviamo test in vivo per un numero limitato di agenti molto promettenti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Le infezioni correlate al biofilm sono implicate in una vasta gamma di condizioni croniche come ulcere del piede diabetiche non curative, sinusite cronica, media di otite che si verificano e molti altri. Le cellule microbiche all'interno di queste infezioni sono protette da una sostanza polimerica extracellulare (EPS), che può impedire agli antibiotici e alle cellule immunitarie ospiti di eliminare l'infezione. Per superare questo ostacolo, gli investigatori hanno iniziato a sviluppare agenti di dispersione come potenziali terapie. Questi agenti prendono di mira vari componenti all'interno del biofilm EPS, indebolendo la struttura e avviando la dispersione dei batteri, che può teoricamente migliorare la potenza antibiotica e la clearance immunitaria. Per determinare l'efficacia degli agenti di dispersione per le infezioni delle ferite, abbiamo sviluppato protocolli che misurano la dispersione del biofilm sia ex vivo che in vivo. Usiamo un modello di escissione chirurgica del topo che è stato ben descritto per creare infezioni croniche delle ferite associate al biofilm. Per monitorare la dispersione in vivo,infettiamo le ferite con ceppi batterici che esprimono luciferasi. Una volta accertate le infezioni mature, irrigamo le ferite con una soluzione contenente enzimi che degradano i componenti del biofilm EPS. Monitoriamo quindi la posizione e l'intensità del segnale luminescente nella ferita e negli organi filtranti per fornire informazioni sul livello di dispersione raggiunto. Per l'analisi ex vivo della dispersione del biofilm, il tessuto della ferita infetta viene immerso in una soluzione enzimatica degradante per biofilm, dopo di che viene valutata la carica batterica rimanente nel tessuto, rispetto alla carica batterica in soluzione. Entrambi i protocolli hanno punti di forza e di debolezza e possono essere ottimizzati per aiutare a determinare con precisione l'efficacia dei trattamenti di dispersione.

In questo esperimento, topi Webster svizzeri di 8-10 settimane sono stati infettati da 104 CFU di PAO1 che trasportavano il pQF50-lux plasmide a luminescenza. Come descritto sopra, è stato permesso di stabilire un'infezione per 48 ore prima di somministrare trattamenti 3 x 30 minuti di PBS (controllo del veicolo) o 10% GH (trattamento) per digerire il biofilm EPS. I topi sono stati fotofazione pre-trattamento, direttamente dopo il trattamento (0 h) e a 10 h e 20 h dopo il trattamento. La ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Qui descriviamo metodi ex vivo e in vivo per valutare la dispersione batterica da un'infezione da ferita nei topi. Questo protocollo può essere utilizzato per testare l'efficacia delle terapie topiche antimicrobiche e anti-biofilm, o per valutare la capacità di dispersione di diversi ceppi batterici o specie.

Valutazione della dispersione del biofilm nelle ferite murine

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Microbiologi e medici delle malattie infettive stanno iniziando a rendersi conto di quanto siano importanti le infezioni associate al biofilm nelle malattie croniche. Il NIH ha persino affermato che oltre l'80% delle infezioni croniche è dovuto a biofilm batterici. Questo ha insistito sull'enfasi posta sull'affrontare il biofilm e sullo sviluppo di terapie che affrontino il problema del biofilm.E una lotta che queste terapie si concentrano sulla dispersione delle cellule batteriche che si trovano nei biofilm dal biofilm in modo che possano essere uccise più facilmente. Ma al momento non ci sono molti protocolli nella letteratura che affrontano come determinare l'efficacia di un tale agente di dispersione. Quindi sentiamo che questo è un buon protocollo da usare.È un tipo di infezione batterica associata al biofilm. E pensiamo anche che possa essere ottimizzato abbastanza facilmente per studiare molti tipi diversi di specie batteriche, e come formano biofilm e si disperdono, così come diversi agenti di dispersione. E pensiamo che sia importante consegnarlo in formato video, perché abbiamo visto che ci sono sfumature soprattutto per la consegna dell'agente che abbiamo trovato lavorare in modo ottimale nei topi.Per iniziare, valutare il piano dell'anestesia con il dito del dito del piedi e monitorando la frequenza respiratoria e lo sforzo. Radere la superficie dorsale e applicare una crema depilatoria sulla regione rasata per 10 minuti o secondo le istruzioni del prodotto. Rimuovere delicatamente la crema depilatoria.E assicurarsi che la pelle sia asciutta. Utilizzando un marcatore a prova di alcol, disegnare un cerchio con un diametro di 1,5 centimetri verso la regione posteriore della schiena. Per la gestione del dolore, somministrare 0,05 millilitri di lidocaina per via sottocutanea nell'area da asportare.E 0,02 millilitri di buprenorfina sottocutaneamente nella collotta del collo. Attendere 10 minuti per garantire che la gestione del dolore sia raggiunta. Prima dell'escissione, disinfettare la superficie dorsale usando un tampone alcolico.Mantenere un campo chirurgico sterile durante tutta la procedura e utilizzare strumenti autoclavati e guanti sterili per limitare la contaminazione. Somministrare una ferita alla pelle incisionale a pieno spessore al livello del muscolo panniculo, con forbici chirurgiche. Dopo l'escissione, coprire immediatamente la ferita con una medicazione semipermeabile in poliuretano.Separare accuratamente il supporto dalla medicazione utilizzando due forcep a punta fine, se applicabile. Iniettare circa 10 al quarto CFU di batteri e 100 microlitri PBS sotto la medicazione e sul letto della ferita per stabilire un'infezione. Si noti che le ferite possono anche essere infettate contemporaneamente da più specie di batteri e / o funghi, o posizionando biofilm preformati o persino tessuti di debridement estratti dai pazienti sul letto della ferita.Dopo l'infezione, mettere i topi in gabbie sopra gli asciugamani di carta per evitare che i topi asfissiino sul materiale da letto. Posizionare le gabbie sulle pastiglie riscaldanti e monitorare i topi fino a quando non hanno riacquistato il riflesso di destra. Rimuovere l'tovagliolo di carta a questo punto.Lasciare che le infezioni della ferita stabiliscano per 48 ore. Ispezionare quotidianamente la medicazione alla ricerca di lacrime in aree di non aderenza e sostituirla se necessario. Posizionare i topi sotto anestesia isoflurana al 3% e un litro al minuto di ossigeno, mentre somministrano trattamenti.Iniettare 200 microlitri di soluzione enzimatica o controllo PBS sulla ferita sollevando la pelle leggermente anteriore della ferita con le flessori, perforando accuratamente la pelle sollevata con la siringa e iniettando lentamente la soluzione nell'area tra il letto della ferita e la medicazione. Per assicurarsi che l'intero letto avvolto sia coperto da soluzione, sollevare delicatamente la medicazione con le forcep, allontanandolo dal letto della ferita, mentre si inietta lentamente la soluzione. Dopo il trattamento, riposizionare i topi in gabbia per 30 minuti.Dopo 30 minuti di esposizione al trattamento, riastetizzare i topi con isoflurane e aspirare la soluzione rimanente con una siringa, forando nella stessa area di prima. Si noti che questa soluzione aspirata contiene cellule batteriche disperse, che possono essere salvate per varie analisi a valle. Somministrare il secondo e il terzo trattamento di irrigazione come è stato fatto per il primo utilizzando ogni volta una nuova siringa.Se un ceppo luminescente di batteri viene utilizzato per avviare l'infezione, un sistema di imaging in vivo può essere utilizzato per visualizzare la dispersione dal letto della ferita. Per l'analisi, aprire le immagini nel software IVIS e selezionare l'area da analizzare con la tavolozza degli strumenti. Per tenere conto dello sfondo, posizionare un cerchio sullo sfondo di un'immagine e quindi posizionare lo stesso cerchio di dimensioni sopra il letto della ferita per ogni mouse.Nella tavolozza degli strumenti selezionare Misura ROM e caricare la tabella delle misure in un foglio di calcolo. Sottrarre la lettura del cerchio di sfondo da ciascuna delle misurazioni del letto della ferita per calcolare la luminescenza per ogni campione. Dopo l'eutanasia umana, raccogliere il tessuto del letto della ferita rimuovendo delicatamente la medicazione con forcelle sterili e tagliando intorno al perimetro del letto della ferita con forbici chirurgiche sterili.Utilizzare le forcelle per sollevare delicatamente un'estremità del letto della ferita, quindi utilizzare le forbici per tagliare il campione di tessuto lontano dallo strato muscolare. Posizionare il campione di tessuto in un tubo di omogeneizzazione pre-pesato da due millilitri contenente un millilitro di PBS. Pesare nuovamente il tubo dopo aver inserito il campione.Per raccogliere la milza, posizionare il mouse in una posizione anatomica supina e fissare fissando le estremità a una superficie di dissezione. Immergere l'area da sezionare con 70% di etanolo per aiutare a prevenire la contaminazione. Fare una piccola incisione perpendicolare alla linea mediana con forbici chirurgiche nel derma dell'addome inferiore.Assicurarsi di tirare la pelle su e lontano dagli organi interni. Continuare l'incisione lungo la linea mediana fino a raggiungere lo sterno. Una volta esposta la cavità peritoneale e visibili gli organi interni, separare la milza dal tessuto connettivo e posizionarla in un tubo di omogeneizzazione prepesato separato.Pesare nuovamente il tubo dopo aver inserito la milza. Omogeneizzare i campioni a cinque metri al secondo, per 60 secondi, due volte. Per enumerare la CFU, diluire e individuare in serie i campioni omogeneizzati.Diluire serialmente con tubi 100 microlitri del campione omogeneizzato in 900 microlitri di PBS e un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Vortice prima di continuare la diluizione con tubi 100 microlitri del campione diluito in un tubo separato contenente 900 microlitri di PBS. Ripetere questi passaggi fino a quando non vengono raggiunte sei diluizioni.Pipetta 10 microlitri di ogni diluizione sull'area indicata su una piastra di agar come mostrato. Se è richiesta una quantificazione CFU più precisa, stendere 100 microlitri di ogni diluizione del campione su piastre di agar separate. Ferire e infettare i topi con circa 10-quarta CFU di batteri, come descritto nel protocollo in vivo.Consentire all'infezione di stabilire per 48 ore, quindi estrarre il letto della ferita in modo simile al protocollo in vivo. Iniziare rimuovendo attentamente la medicazione. Taglio intorno al perimetro della ferita.E separarsi dallo strato muscolare. Il campione del letto della ferita può essere diviso in più sezioni per aumentare il numero di campioni. Quindi posizionare i campioni divisi in tubi di omogeneizzazione vuoti pre pesati separati.Pesare nuovamente il tubo e calcolare il peso del campione sottraendo il peso del tubo senza il campione dal peso del tubo con il campione. Aggiungere un millilitro di PBS al tubo di omogeneizzazione contenente il campione e invertire delicatamente il tubo alcune volte per risciacquare. Rimuovere il lavaggio e lo scarto PBS.Aggiungere un millilitro di trattamento gh, o PBS come controllo negativo, e incubare per due ore a 37 gradi Celsius, con scuotimento a 80 RPM. Rimuovere la bile dalla soluzione di dispersione e posizionarsi in un tubo di centrifuga separato da 1,5 millilitri. Contiene le celle disperse.Lavare il tessuto rimanente con un millilitro di PBS, come fatto in precedenza, e scartare il lavaggio PBS. Aggiungere un millilitro di PBS al tessuto rimanente e omogeneizzare a cinque metri al secondo, per 60 secondi. Diluire in serie sia la soluzione di cellule disperse che il campione di tessuto omogeneizzato con l'intubazione di 100 microlitri del campione in 900 microlitri di PBS in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.Vortice il campione diluito e continuare la diluizione altre cinque volte per un totale di sei diluizioni. Individuare il campione con tubi 10 microlitri di ogni diluizione sull'area indicata su una piastra di agar selettiva. Contare la CFU e calcolare la dispersione percentuale dividendo la CFU dispersa per la CFU totale e moltiplicando per 100.In questo esperimento, da otto a 10 settimane femmine di topi Webster svizzeri sono stati infettati da 10 al quarto CFU di PA01 che trasportava il plasmide luminescenza PQF50-lux. L'infezione è stata autorizzata a stabilire per 48 ore prima di amministrare tre trattamenti di 30 minuti di PBS come controllo del veicolo, o 10%GH come trattamento sperimentale per digerire il biofilm EPS. Mostrato nella sezione A, i topi sono stati foto-pre-trattamento, direttamente dopo il trattamento, e a 10 e 20 ore dopo il trattamento.Utilizzando IVIS, un'infezione accertata può essere visualizzato all'interno del letto della ferita generando un segnale bioluminescente luminoso. La dispersione dei batteri dal letto della ferita può essere visualizzato immediatamente dopo il trattamento con GH, ma non dopo il trattamento PBS. La diffusione batterica negli organi può anche essere vista posizionando il topo su un lato per l'imaging, come mostrato nei pannelli inferiori.Nella sezione B, le immagini dei topi trattati con PBS e GH hanno dimostrato un aumento del segnale luminescente a 20 ore dopo il trattamento, rispetto al pretrattamento. Tuttavia, è ancora importante quantificare la CFU a causa della soglia di rilevamento di una luminescenza in IVIS. A 20 ore dopo il trattamento, i topi sono stati eutanasiati e i letti delle ferite e le milza sono stati raccolti per enumerare cfu per grammo di tessuto.La sezione C mostra la carica batterica nel letto della ferita, mentre la sezione D mostra la carica batterica nelle milza. Questi dati suggeriscono la diffusione diffusa dei batteri dispersi, poiché i batteri sono stati rilevati solo nelle milza dei topi trattati con la soluzione GH mirata all'EPS. Sebbene questi protocolli siano molto utili, ci sono alcune limitazioni.In primo luogo, va notato che c'è una limitazione di rilevamento con il sistema di imaging in vivo, o IVIS. Una diminuzione del segnale luminescente può essere vista quando i batteri entrano in fase stazionaria. Pertanto è importante raccogliere tessuti di interesse e misurare il CFU presente, in quanto può esserci una disconnessione tra la luminescenza e la CFU enumerata.Tuttavia, IVIS è utile per visualizzare l'efficacia del trattamento durante uno studio, senza dover effettivamente eutanasiare l'animale. Un'altra limitazione da prendere in considerazione è l'esigenza di un attento monitoraggio delle bende. Le bende sono necessarie per ridurre la guarigione contrattile e mantenere sterile la ferita da altri batteri.Le bende dovranno essere sostituite spesso, il che può portare a debridement accidentali della ferita e opportunità di contaminazione. Questi protocolli descrivono nuovi metodi per studiare la bile dalla dispersione e la valutazione della bile terapeutica dagli agenti dispersivi. Questi modelli consentono lo sviluppo di complesse infezioni associate al biofilm polimicrobico che imitano infezioni umane clinicamente rilevanti.La nostra speranza è che questi protocolli siano utilizzati e perfezionati per promuovere lo sviluppo di agenti di dispersione anti-biofilm per uso terapeutico.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Valutare mutazione somatica nel Ramos cellule B dopo iperespressione o Knockdown di specifici geni

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...