Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
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この研究は、国立衛生研究所(R21 AI137462-01A1)、テッドナッシュロングライフ財団、ジャスパーL.とジャックデントンウィルソン財団、国防総省(DoD MIDRP W0318_19_NM_PP)からの助成金によって支えられました。

この動物プロトコルは、テキサス工科大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって見直され、承認されました(プロトコル番号07044)。この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用ガイドの勧告に厳密に従って行われました。
1. マウス感染のための細菌の準備
注:ここでは、 緑膿菌に感染するマウスについて説明しま?...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

ここでは、バイオフィルム分散剤の有効性を研究するために利用できるプロトコルについて説明する。これらのプロトコルは、さまざまな種類の分散剤、細菌種またはex vivoサンプル(臨床デブリドメントサンプルを含む)で使用するように容易に適応することができる。このプロトコルはまた、分散細菌細胞を収集し、研究するための臨床的に関連するモデルを提供します。分散細菌細?...

世界的な抗生物質耐性の上昇は、細菌感染症の様々な治療するための抗生物質の選択肢の欠如につながっている1.抗生物質耐性に加えて、細菌はバイオフィルム関連のライフスタイル2を採用することによって抗生物質耐性を得ることができる。バイオフィルムは、多糖、細胞外DNA、脂質、タンパク質3のマトリックスによって保護される微生物の集まりであり、細胞外高分子物質(EPS)と総称されます。抗生物質耐性の危機が続く中、抗生物質の使用を延長したり、有効性を増強したりする新しい戦略が必要です。抗バイオフィルム剤は、有望なソリューションの1つです 4.
提案されている異なる抗バイオフィルム戦略の中で、バイオフィルムEPSの異なる成分を標的とする分散剤の利用は、治療開発5の最前線にある。グリコシド水化酵素(GH)は、分散剤のそのようなクラスの一つである。GHは、EPSに構造的完全性を提供する多糖内の異なる結合の切断を触媒する酵素の大規模なクラスである。我々のグループは、他のグループと同様に、GHが効果的にバイオフィルムを分解し、分散を誘導し、インビボ6、7、8、9、10、11の両方の異なる細菌種に対する抗生物質の有効性を改善できることを示している。
バイオフィルム分散への関心が高まる中、分散効果を評価する効果的な方法を開発することが重要です。ここでは、マウスにおける分散剤によるバイオフィルム関連創傷感染症の治療に関する詳細なプロトコルを提示し、生体内およびex vivoにおける 分散効力の評価を行 う。全体的な目標は、バイオフィルム分散を効果的かつ効率的に測定するために前臨床モデルで使用できる効果的な方法を提供することです。
これらの研究では、バイオフィルム関連感染を確立するために、マウスの外科的切除感染モデルが使用された。私たちは15年以上にわたってこのモデルを使用し、私たちの観測を広範囲に発表しました 7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.一般に、これは細菌が創傷床に局在し続け、バイオフィルム関連(EPSに囲まれた凝集体に見られる細菌)である非致死感染モデルであり、最大3週間続く慢性感染を設定する。しかし、マウスが免疫不全(例えば1型糖尿病)であれば、このモデルでは致命的な全身感染を発症しやすくなる可能性があります。
本報告書では、インビボとex vivoの両方で創傷からの細菌の分散を評価するためのプロトコルを提供します。両方のプロトコルは、分散剤の有効性を調べるために使用することができ、独自の長所と短所を持っています。例えば、生体内で分散を評価すると、分散後の身体の他の部分への細菌の拡散に関する重要なリアルタイム情報と、宿主がどのように反応するかが分かるようになる。一方、分散ex vivoの評価は、複数の薬剤、用量、または製剤をスクリーニングするためにより望ましい場合があり、組織が別々に試験することができる複数のセクションに分けることができるので、必要なマウスの数を減らすことができる。複数の薬剤を評価する場合、我々は通常、前に説明した6、9、22のように、最初のインビトロで分散を測定する。 その後、最も効果的なex vivoをテストし、限られた数の非常に有望な薬剤のインビボテストを予約します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

バイオフィルム関連感染症は、非治癒糖尿病性足潰瘍、慢性副腎炎、再発性中耳炎などの慢性疾患の広い配列に関与しています。これらの感染症内の微生物細胞は、抗生物質および宿主免疫細胞が感染をクリアするのを防ぐことができる細胞外ポリマー物質(EPS)によって保護される。この障害を克服するために、研究者は潜在的な治療薬として分散剤の開発を開始しました。これらの薬剤は、バイオフィルムEPS内の様々な成分を標的とし、構造を弱め、細菌の分散を起こし、理論的には抗生物質の効力と免疫クリアランスを改善することができる。創傷感染に対する分散剤の有効性を判断するために、 我々は、ex vivo と in vivoの両方のバイオフィルム分散を測定するプロトコルを開発した。我々は、バイオフィルム関連の慢性創傷感染症を作成するためによく説明されているマウス外科切除モデルを使用する。 生体内の分散を監視するために、ルシファーゼを発現する細菌株で創傷に感染します。成熟した感染症が確立したら、バイオフィルムEPSの成分を分解する酵素を含む溶液で創傷を灌漑します。次に、創傷と臓器の発光信号の位置と強度を監視し、達成した分散レベルに関する情報を提供します。バイオフィルム分散の ex vivo 解析では、感染した創傷組織がバイオフィルム分解酵素溶液中に沈下され、その後、組織に残っている細菌負荷は、溶液中の細菌負荷に対して、評価される。どちらのプロトコルにも長所と短所があり、分散処理の有効性を正確に判断できるように最適化できます。

この実験では、8-10週齢のスイスウェブスターマウスは、pQF50-ルクスの発光プラスミドを運ぶPAO1の104 CFUに感染した。上述したように、感染症は、バイオフィルムEPSを消化するためにPBS(車両制御)または10%GH(処置)の3 x 30分治療を投与する前に48時間の間確立することを許した。マウスは、治療前に、治療後(0時間)および10時間および20時間後に直接、処置前に画像化した。 <strong class="xfig...

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Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

ここでは、マウスにおける創傷感染からの細菌分散を評価するための ex vivo および in vivo 方法について述べた。このプロトコルは、局所抗菌および抗菌性の治療の有効性をテストするために、または異なる細菌株または種の分散能力を評価するために利用することができる。

ネズミの創傷におけるバイオフィルム分散の評価

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

微生物学者や感染症の医師は、慢性疾患におけるバイオフィルム関連感染症がいかに重要であるかを認識し始めています。NIHは、慢性感染症の80%以上が細菌バイオフィルムによるものだとさえ述べています。そこで、バイオフィルムへの取り組みや、バイオフィルム問題に対処する治療薬の開発に重点を置くよう促しています。そして、これらの治療薬は、バイオフィルムからバイオフィルム中にある細菌細胞をより容易に殺すことができるように分散させることに焦点を当てています。しかし、このような分散剤の有効性を決定する方法を取り上げるために現在の文献には、実際に多くのプロトコルはありません。だから、私たちはこれが使用する良いプロトコルであると感じています。これは、バイオフィルムに関連する細菌感染の一種です。また、多くの異なる種類の細菌種を研究し、バイオフィルムを形成し、分散する方法、および異なる分散剤を研究することは非常に簡単に最適化できると考えています。そして、私たちは、特にマウスで最適に仕事を見つけたエージェントの配信にニュアンスがあることを見てきたので、ビデオ形式でこれを提供することが重要だと思います。まず、つま先ピンチで麻酔の平面を評価し、呼吸数と労力を監視します。後ろ面を剃り、剃った領域に脱毛クリームを10分間、または製品の指示に従って塗布します。脱毛クリームをそっと取り除きます。そして、皮膚が乾燥していることを確認してください。アルコール防止マーカーを使用して、背中の後部領域に向かって直径1.5センチメートルの円を描きます。疼痛管理のために、切除される領域に皮下に0.05ミリリットルのリドカインを投与する。そして、首の擦り傷の中で皮下にブプレノルフィンの0.02ミリリットル。痛みの管理に到達するために10分待ちます。切除前に、アルコール綿棒を使用して後面を消毒する。手順全体を通して無菌の外科分野を維持し、汚染を制限するためにオートクレーブされた器械および無菌手袋を使用する。外科用はさみで、皮膚の傷をパンニクル筋のレベルまで完全な厚さの皮膚を投与する。切除後、すぐに半透過性のポリウレタンドレッシングで創傷を覆う。必要に応じて、2つの細かい鉗子を使用してドレッシングから慎重にバッキングを分離します。細菌の第4のCFUに約10を注入し、100マイクロリットルのPBSをドレッシングの下に注入し、創傷床に感染を確立する。注意:創傷はまた、複数の種の細菌および/または真菌に同時に感染すること、または患者から抽出されたプレフォームバイオフィルムまたは脱花組織を創傷床に置くことによっても感染することができる。感染後、マウスが寝具に窒息するのを防ぐために、ペーパータオルの上のケージにマウスを置きます。ケージを加熱パッドに置き、マウスが正しい反射を取り戻すまで監視します。この時点でペーパータオルを取り外します。創傷感染を48時間確立可能にする。不遵守の領域で涙のために毎日ドレッシングを検査し、必要に応じてそれを交換してください。マウスをイオブルラン麻酔下に3%、1リットルの酸素で配置し、治療を行う。200マイクロリットルの酵素溶液またはPBSコントロールを、鉗子で創傷の皮膚をわずかに前に持ち上げ、持ち上げられた皮膚を注射器で慎重に突き刺し、創傷床とドレッシングの間の領域にゆっくりと溶液を注入することによって創傷に注入する。創傷床全体が溶液で覆われていることを確実にするために、ドレッシングを鉗子でそっと上げ、創傷床から引き離し、ゆっくりと溶液を注入する。治療後、マウスをケージに30分間戻します。治療に30分曝露した後、マウスをイオブルランで再麻酔し、残りの溶液を注射器で吸引し、以前と同じ領域で穿刺する。なお、この吸引溶液は分散した細菌細胞を含み、様々な下流解析のために保存することができる。毎回新しい注射器を使用して最初に行われたように第二および第三の灌漑治療を投与する。細菌の発光株が感染を開始するために利用される場合、インビボイメージングシステムを使用して創傷床からの分散を可視化することができる。解析のために、IVIS ソフトウェアでイメージを開き、ツール パレットで解析する領域を選択します。背景を説明するには、画像の背景に円を配置し、各マウスの傷床の上に同じサイズの円を配置します。ツール パレットで[ROI を測定]を選択し、測定値のテーブルをスプレッドシートにアップロードします。各創傷床測定値から背景円の読み取りを引き、各サンプルの発光を計算します。人道的安楽死後、最初に無菌鉗子でドレッシングをそっと取り除き、滅菌手術用ハサミで創傷床の周囲を切断することによって創傷床組織を収穫する。鉗子を使用して傷床の一方の端をそっと持ち上げ、ハサミを使って組織サンプルを筋肉層から切り離します。PBSの1ミリリットルを含む計量済みの2ミリリットル均質化チューブに組織サンプルを入れる。サンプルを挿入した後、チューブの重量をもう一度量ります。脾臓を収穫するには、マウスをサピン解剖学的位置に置き、四肢を解剖表面に固定して固定します。汚染を防ぐために70%エタノールで解剖する領域を浸してください。下腹部の真皮に外科的なはさみで中線に垂直な小さな切開を行います.皮膚を内臓から引き上げ、離してください。胸骨に達するまで、正中線に沿って切開を続けます。腹腔が露出し、内臓が見えるようになったら、脾臓を結合組織から分離し、別の計量済みの均質化チューブに入れる。脾臓を挿入した後、チューブの重量を再測定します。サンプルを毎秒5メートル、60秒間、2回均質化します。CFUを列挙するために、ホモジナイズサンプルを連続して希釈し、スポットプレートを付ける。900マイクロリットルのPBSと1.5ミリリットルの遠心分離管に均質化されたサンプルの100マイクロリットルをピペット化することによって連続的に希釈する。渦は、希釈したサンプルの100マイクロリットルをPBSの900マイクロリットルを含む別のチューブにピペット処理することによって希釈を継続する前に。6つの希釈が達成されるまで、これらのステップを繰り返します。図示のように、各希釈液のピペット10マイクロリットルを寒天板上の示された領域に上に置く。より正確なCFU定量が必要な場合は、サンプルの各希釈液の100マイクロリットルを別々の寒天プレートに広げます。インビボプロトコルに記載されているように、細菌の約10〜第4のCFUを有するマウスを創傷および感染させる。感染を48時間確立させ、インビボプロトコルと同様の方法で創傷床を抽出する。まず、ドレッシングを慎重に取り除きます。傷の周囲を切断します。そして、筋肉層から分離する。創傷床試料は、サンプル数を増やすために複数のセクションに分割することができます。次に、分割したサンプルを別々の計量空の均質化チューブに入れます。チューブを再び計量し、サンプルとチューブの重量からサンプルの重量を差し引くことでサンプルの重量を計算します。サンプルを含む均質化チューブにPBSを1ミリリットル加え、チューブを数回軽く反転してすすいでください。PBSを取り除き、廃棄します。GH治療の1ミリリットル、または陰性対照としてPBSを加え、摂氏37度で2時間インキュベートし、80RPMで振る。分散液から胆汁を取り除き、別の1.5ミリリットル遠心管に入れる。これは、分散した細胞が含まれています。残りの組織をPBSの1ミリリットルで洗浄し、先に行ったように、PBS洗浄を廃棄します。残りの組織にPBSの1ミリリットルを加え、毎秒5メートル、60秒間均質化します。1.5ミリリットルの遠心チューブで900マイクロリットルのPBSにサンプル100マイクロリットルをピペット処理することにより、分散した細胞の溶液と均質化された組織サンプルの両方を連続的に希釈します。希釈したサンプルをボルテックスし、合計6つの希釈のためにさらに5回希釈を続ける。スポットプレートは、各希釈液の10マイクロリットルを選択的寒天板上の示された領域にピペット化することによって試料をプレートする。CFU を数え、分散した CFU を合計 CFU で除算し、100 を掛けて分散率を計算します。この実験では、8〜10週齢のスイスウェブスターマウスが、PQF50-ルクスの発光プラスミドを運ぶPA01の10〜4番目のCFUに感染した。この感染は、車両制御としてPBSの3つの30分間の治療を管理する前に48時間、またはバイオフィルムEPSを消化する実験的治療として10%GHを確立することを許可した。A節に示すように、マウスは、治療前、治療直後、および治療後10時間及び20時間で画像化した。IVISを用いて、創傷床内で確立された感染を可視化し、明るい生物発光シグナルを生成することができる。創傷床から細菌の分散は、GH処理後すぐに可視化することができますが、PBS処理後には可視化されません。下部パネルに示すように、マウスを画像化のためにその側に置くことによって、器官への細菌の播体の普及も見られる。セクションBでは、PBSおよびGH処置マウスの両方からの画像は、前処理と比較して、治療後20時間で発光シグナルの増加を示した。しかし、光の検出閾値がIVISで検出するため、CFUを定量することは依然として重要です。治療後20時間で、マウスを安楽死させ、創傷ベッドと脾臓を採取し、組織の1グラム当たりCFUを列挙した。セクションCは創傷床における細菌負荷を示し、一方、セクションDは脾臓における細菌負荷を示す。これらのデータは、EPS標的GH溶液で処理されたマウスの脾臓において細菌が検出されただけであるため、分散細菌の広がりを広めることが示唆される。これらのプロトコルは非常に便利ですが、いくつかの制限があります。まず、インビボ撮像システム、またはIVISとの検出制限があることに留意すべきである。細菌が静止期に入ると発光シグナルの減少が見られます。したがって、発光とCFU列挙との間に切断が存在する可能性があるため、関心のある組織を収集し、存在するCFUを測定することが重要である。しかし、IVISは、実際に動物を安楽死させることなく、研究全体を通して治療の有効性を視覚化するのに有用である。考慮すべきもう一つの制限は包帯の綿密な監視の要件である。包帯は、収縮治癒を減らすだけでなく、他の細菌から無菌の創傷を維持するために必要とされる。包帯は頻繁に交換する必要があり、創傷の偶発的な脱ブリードメントや汚染の機会につながる可能性があります。これらのプロトコルは、分散から胆汁を研究する新規の方法、および分散剤からの治療胆汁の評価を記述する。これらのモデルは臨床関連の人間の伝染を模倣する複雑な多微生物バイオフィルム関連の伝染の開発を可能にする。私たちの希望は、これらのプロトコルが使用され、治療用の抗バイオフィルム分散剤の開発をさらに進めるために精製されることを望んでいます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

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In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

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8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

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Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

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エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

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光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

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自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...