Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. og Jack Denton Wilson Foundation og Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Denne dyreprotokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokollnummer 07044). Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health.
1. Forbereder bakterier for museinfeksjoner
MERK: Her beskriver vi smittende mus bare med Pseudomonas aeruginosa. Imidlertid kan andre bakteriearter bru...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Her beskriver vi protokoller som kan brukes til å studere effekten av biofilmdispergeringsmidler. Disse protokollene kan enkelt tilpasses for bruk med ulike typer dispergeringsmidler, bakteriearter eller ex vivo-prøver, inkludert kliniske debrideringsprøver. Denne protokollen gir også en klinisk relevant modell for å samle og studere dispergerte bakterieceller. Fenotypene av dispergerte bakterieceller har vist seg å være forskjellige fra de av enten planktoniske eller biofilmceller 5</su...

Fremveksten av antibiotikaresistens over hele verden fører til mangel på antibiotikaalternativer for å behandle en rekke bakterielle infeksjoner1. I tillegg til antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatoleranse ved å vedta en biofilm-assosiert livsstil2. En biofilm er et fellesskap av mikroorganismer som er beskyttet av en matrise av polysakkarider, ekstracellulært DNA, lipider og proteiner3, samlet kalt det ekstracellulære polymere stoffet (EPS). Etter hvert som antibiotikaresistenskrisen fortsetter, er det sårt behov for nye strategier som forlenger bruken av, eller forsterker effekten av antibiotika. Antibiofilmmidler er en lovende løsning4.
Blant de forskjellige antibiofilmstrategiene som er foreslått, er bruken av dispergeringsmidler, som retter seg mot forskjellige komponenter i biofilm-EPS, i forkant av terapeutisk utvikling5. Glykosidhydrolaser (GH) er en slik klasse av dispergeringsmiddel. GH er en stor klasse enzymer som katalyserer spaltingen av forskjellige bindinger i polysakkaridene som gir strukturell integritet til EPS. Vår gruppe, så vel som andre, har vist at GH effektivt kan forringe biofilmer, indusere spredning og forbedre antibiotikaeffekten for en rekke forskjellige bakteriearter, både in vitro og in vivo6,7,8,9,10,11.
Med en økende interesse for biofilmspredning er det viktig å utvikle effektive metoder som vurderer spredningseffekt. Her presenterer vi en detaljert protokoll for behandling av biofilm-assosierte sårinfeksjoner med et dispergeringsmiddel hos mus, og vurdering av spredningseffekt, in vivo og ex vivo. Det overordnede målet er å gi effektive metoder som kan brukes med prekliniske modeller for å måle biofilmspredning effektivt og effektivt.
En murin kirurgisk eksisjonsinfeksjonsmodell ble brukt i disse studiene for å etablere en biofilm-assosiert infeksjon. Vi har brukt denne modellen i over 15 år og publisert våre observasjoner mye7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Generelt er dette en ikke-dødelig infeksjonsmodell der bakterier forblir lokalisert til sårsengen og er biofilmrelaterte (bakterier sett i aggregater omgitt av EPS), og setter opp en kronisk infeksjon som varer opptil 3 uker. Men hvis mus er immunkompromittert (med type 1 diabetes for eksempel), kan de bli mer utsatt for å utvikle en dødelig systemisk infeksjon i denne modellen.
I denne rapporten gir vi protokoller for å vurdere spredning av bakterier fra et sår, både in vivo og ex vivo. Begge protokollene kan brukes til å undersøke effekten av et dispergeringsmiddel og ha sine egne styrker og svakheter. For eksempel kan vurdering av dispergering in vivo gi viktig sanntidsinformasjon om spredning av bakterier til andre deler av kroppen etter spredning, og hvordan verten reagerer. På den annen side kan det være mer ønskelig å vurdere spredning ex vivo for screening av flere midler, doser eller formuleringer, da vevet kan deles inn i flere seksjoner som kan testes separat, og dermed redusere antall mus som kreves. Når vi vurderer flere agenter, måler vi vanligvis spredning første in vitro som tidligere beskrevet 6,9,22. Vi tester deretter den mest effektive ex vivo og reserverer in vivo-testing for et begrenset antall svært lovende midler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Biofilmrelaterte infeksjoner er involvert i et bredt spekter av kroniske tilstander som ikke-helbredende diabetiske fotsår, kronisk bihulebetennelse, tilbakevendende otitis media og mange flere. Mikrobielle celler i disse infeksjonene er beskyttet av et ekstracellulært polymerstoff (EPS), som kan forhindre antibiotika og være vert for immunceller fra å fjerne infeksjonen. For å overvinne dette hinderet har etterforskere begynt å utvikle spredningsmidler som potensielle terapeutiske midler. Disse midlene retter seg mot ulike komponenter i biofilm-EPS, svekker strukturen og initierer spredning av bakteriene, noe som teoretisk kan forbedre antibiotikastyrken og immunclearance. For å bestemme effekten av dispergeringsmidler for sårinfeksjoner, har vi utviklet protokoller som måler biofilm dispergering både ex vivo og in vivo. Vi bruker en musekirurgisk eksisjonsmodell som er godt beskrevet for å skape biofilmrelaterte kroniske sårinfeksjoner. For å overvåke sprednings in vivo, smitter vi sårene med bakteriestammer som uttrykker luciferase. Når modne infeksjoner har etablert seg, irrigerer vi sårene med en løsning som inneholder enzymer som forringer komponenter i biofilm EPS. Vi overvåker deretter plasseringen og intensiteten av lystetthetssignalet i sår- og filtreringsorganene for å gi informasjon om nivået av spredning oppnådd. For ex vivo-analyse av biofilmspredning er infisert sårvev nedsenket i biofilmnedbrytende enzymoppløsning, hvorpå bakteriebelastningen som gjenstår i vevet, kontra bakteriebelastningen i løsningen, vurderes. Begge protokollene har styrker og svakheter og kan optimaliseres for å bidra til å nøyaktig bestemme effekten av spredningsbehandlinger.

I dette eksperimentet ble 8-10 uker gamle kvinnelige sveitsiske Webster-mus smittet med 104 CFU av PAO1 som bærer luminescensplasmid pQF50-lux. Som beskrevet ovenfor fikk en infeksjon lov til å etablere i 48 timer før administrering av 3 x 30 min behandlinger av enten PBS (kjøretøykontroll) eller 10% GH (behandling) for å fordøye biofilm EPS. Mus ble avbildet forbehandling, rett etter behandling (0 h) og ved 10 timer og 20 timer etter behandling. Figur 2A og suppler...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Her beskriver vi ex vivo og in vivo metoder for å vurdere bakteriell spredning fra en sårinfeksjon hos mus. Denne protokollen kan brukes til å teste effekten av aktuelle antimikrobielle og antibiofilmbehandlinger, eller for å vurdere spredningskapasiteten til forskjellige bakteriestammer eller arter.

Vurderer biofilmspredning i murine sår

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Mikrobiologer og smittsomme sykdomsleger begynner å innse hvor viktige biofilmrelaterte infeksjoner er ved kronisk sykdom. NIH har til og med sagt at over 80% av kroniske infeksjoner skyldes bakterielle biofilmer. Så dette har oppfordret til vektlegging av å adressere biofilm, og utvikle terapeutiske behandlinger som adresserer biofilmproblemet.Og mange av disse terapeutiske er fokusert på å spre bakterieceller som er i biofilmer ut av biofilmen slik at de lettere kan drepes. Men det er virkelig ikke mange protokoller i litteraturen for tiden som tar for seg hvordan man bestemmer effekten av et slikt spredningsmiddel. Så vi føler at dette er en god protokoll å bruke.Det er en type bakteriell infeksjon som er biofilm-assosiert. Og vi tror også det kan optimaliseres ganske enkelt for å studere mange forskjellige typer bakteriearter, og hvordan de danner biofilmer og sprer seg, samt forskjellige spredningsmidler. Og vi tror det er viktig å levere dette i et videoformat, fordi vi har sett at det er nyanser spesielt for levering av agenten som vi har funnet fungerer optimalt hos mus.For å begynne med, vurder anestesiplanet ved tåklemme, og ved å overvåke åndedrettsfrekvensen og innsatsen. Barber dorsaloverflaten og påfør en depilatorisk krem på det barberte området i 10 minutter, eller i henhold til produktets instruksjoner. Fjern forsiktig depilatorisk krem.Og sørg for at huden er tørr. Bruk en alkoholsikker markør, tegn en sirkel med en diameter på 1,5 centimeter mot den bakre delen av ryggen. For smertebehandling, administrer 0,05 milliliter lidokain subkutant inn i området som skal utskilles.Og 0,02 milliliter buprenorfin subkutant i nakken. Vent i 10 minutter for å sikre at smertebehandlingen er nådd. Før eksisjon desinfiserer du dorsaloverflaten ved hjelp av en alkoholpinne.Oppretthold et sterilt kirurgisk felt gjennom hele prosedyren, og bruk autoklavede instrumenter og sterile hansker for å begrense forurensning. Administrer en full tykkelse eksisjonell hud sår til nivået av panniculus muskelen, med kirurgisk saks. Etter eksisjon, dekk straks såret med en halverfarlig polyuretan dressing.Separer forsiktig underlaget med to finspisset tang, hvis det er aktuelt. Injiser ca. 10 til fjerde CFU av bakterier, og 100 mikroliter PBS under bandasjen og på sårsengen for å etablere en infeksjon. Merk at sår også kan smittes med flere arter av bakterier og/eller sopp samtidig, eller ved å plassere forhåndsformede biofilmer eller til og med debridementvev ekstrahert fra pasienter på sårsengen.Etter infeksjon, plasser mus i bur på toppen av papirhåndklær for å forhindre at musene kveler på sengetøymaterialet. Plasser burene på varmeputer og overvåk musene til de har gjenvunnet sin høyre refleks. Fjern papirhåndkleet på dette tidspunktet.La sårinfeksjoner etablere i 48 timer. Inspiser dressingen daglig for tårer i områder med ikke-sammenheng og erstatt den om nødvendig. Plasser mus under isofluranbedøvelse ved 3% og en liter per minutt oksygen, mens du administrerer behandlinger.Injiser 200 mikroliter enzymoppløsning eller PBS-kontroll på såret ved å løfte huden litt fremre av såret med tang, forsiktig piercing den løftede huden med sprøyten, og sakte injisere løsningen i området mellom sårsengen og bandasjen. For å sikre at hele sårsengen er dekket av løsning, løft forsiktig dressingen med tang, trekk den bort fra sårsengen, mens du sakte injiserer løsningen. Etter behandling, plasser musene tilbake i bur i 30 minutter.Etter 30 minutters eksponering for behandlingen, reanesthetize musene med isofluran og aspirere den gjenværende løsningen med en sprøyte, punktering i samme område som før. Merk at denne aspirerte løsningen inneholder spredte bakterieceller, som kan lagres for ulike nedstrømsanalyser. Administrer andre og tredje vanningsbehandlinger som ble gjort for den første ved hjelp av en ny sprøyte hver gang.Hvis en luminescerende bakteriestamme brukes til å initiere infeksjon, kan et in-vivo avbildningssystem brukes til å visualisere spredning fra sårsengen. For analyse åpner du bildene i IVIS-programvaren og velger området som skal analyseres med verktøypaletten. Hvis du vil ta hensyn til bakgrunnen, plasserer du en sirkel på bakgrunnen av et bilde, og deretter plasserer du sirkelen i samme størrelse på toppen av sårsengen for hver mus.Velg Mål ROIer på verktøypaletten, og last opp måltabellen til et regneark. Trekk bakgrunnssirkelavlesningen fra hver av sårsengmålingene for å beregne luminescens for hver prøve. Etter human eutanasi, høst sårsengvevet ved først forsiktig å fjerne bandasjen med sterile tang, og kutte rundt omkretsen av sårsengen med steril kirurgisk saks.Bruk tang til å forsiktig løfte den ene enden av sårsengen, og bruk deretter saks til å kutte vevsprøven bort fra muskellaget. Plasser vevsprøven i et forhåndsveid to milliliter homogeniseringsrør som inneholder en milliliter PBS. Vei røret igjen etter at prøven er satt inn.For å høste milten, plasser musen i en supine anatomisk posisjon og sikre ved å feste ekstremitetene til en disseksjonsoverflate. Bløtlegg området som skal dissekeres med 70% etanol for å forhindre forurensning. Lag et lite snitt vinkelrett på midtlinjen med kirurgisk saks i underlivets dermis.Pass på å trekke huden opp og bort fra de indre organene. Fortsett snittet langs midtlinjen til brystbenet er nådd. Når bukhulen er utsatt og de indre organene er synlige, skiller du milten fra bindevevet og plasserer i et eget forhåndsveid homogeniseringsrør.Vei røret igjen etter at du har satt inn milten. Homogeniser prøvene på fem meter per sekund, i 60 sekunder, to ganger. For å liste opp CFU, fortynn og spotplate de homogeniserte prøvene serielt.Fortynn serielt ved å pipettere 100 mikroliter av den homogeniserte prøven til 900 mikroliter PBS og et sentrifugerør på 1,5 milliliter. Virvel før du fortsetter fortynning ved å pipettere 100 mikroliter av den fortynnede prøven i et eget rør som inneholder 900 mikroliter PBS. Gjenta disse trinnene til seks fortynninger er oppnådd.Pipette 10 mikroliter av hver fortynning på det angitte området på en agarplate som vist. Hvis mer presis CFU-kvantasjon er nødvendig, spred 100 mikroliter av hver fortynning av prøven over separate agarplater. Sår og infisere mus med ca. 10 til fjerde CFU av bakterier, som beskrevet i in vivo-protokollen.La infeksjonen etablere i 48 timer, og trekk deretter ut sårsengen på samme måte som in-vivo-protokollen. Begynn med å forsiktig fjerne dressingen. Kutting rundt omkretsen av såret.Og separere fra muskellaget. Sårsengprøven kan deles inn i flere seksjoner for å øke antall prøver. Plasser deretter de delte prøvene i separate forhåndsveide tomme homogeniseringsrør.Vei røret igjen og beregn vekten av prøven ved å trekke vekten av røret uten prøven fra vekten av røret med prøven. Tilsett en milliliter PBS i homogeniseringsrøret som inneholder prøven, og inverter røret forsiktig et par ganger for å skylle. Fjern PBS-vasken og kast den.Tilsett en milliliter GH-behandling, eller PBS som en negativ kontroll, og inkuber i to timer ved 37 grader Celsius, med risting ved 80 RPM. Fjern gallen fra spredningsløsningen og legg den i et separat sentrifugerør på 1,5 milliliter. Denne inneholder de spredte cellene.Vask det gjenværende vevet med en milliliter PBS, som tidligere, og kast PBS-vasken. Tilsett en milliliter PBS til det gjenværende vevet og homogeniser på fem meter per sekund, i 60 sekunder. Fortynn både oppløsningen av dispergerte celler og den homogeniserte vevsprøven ved å pipettere 100 mikroliter av prøven til 900 mikroliter PBS i et 1,5 milliliter sentrifugerør.Virvel den fortynnede prøven og fortsett fortynning fem ganger til for totalt seks fortynninger. Spotplate prøven ved å pipettere 10 mikroliter av hver fortynning på det angitte området på en selektiv agarplate. Tell CFU og beregn prosent spredning ved å dele den spredte CFU med den totale CFU, og multiplisere med 100.I dette eksperimentet ble åtte til ti uker gamle kvinnelige sveitsiske Webster-mus smittet med 10 til den fjerde CFU av PA01 som bærer luminescensplasmid PQF50-lux. Infeksjonen fikk lov til å etablere i 48 timer før administrering av tre 30-minutters behandlinger av enten PBS som kjøretøykontroll, eller 10% GH som en eksperimentell behandling for å fordøye biofilm EPS. Vist i seksjon A ble mus avbildet forbehandling, rett etter behandling, og ved 10 og 20 timer etter behandling.Ved hjelp av IVIS kan en etablert infeksjon visualiseres i sårsengen og generere et lyst bioluminescerende signal. Spredningen av bakterier ut av sårsengen kan visualiseres umiddelbart etter GH-behandlingen, men ikke etter PBS-behandlingen. Bakteriell formidling i organene kan også ses ved å plassere musen på siden for avbildning, som vist i de nedre panelene.I avsnitt B viste bilder fra både PBS- og GH-behandlede mus en økning i lystetthetssignalet ved 20 timer etter behandling, sammenlignet med forbehandling. Det er imidlertid fortsatt viktig å kvantisere CFU på grunn av deteksjonsterskelen for en luminescens i IVIS. Ved 20 timer etter behandling ble musene euthanized og sårsenger og milt ble samlet inn for å liste opp CFU per gram vev.Seksjon C viser bakteriebelastningen i sårsengen, mens seksjon D viser bakteriebelastningen i miltene. Disse dataene antyder spredning av de dispergerte bakteriene, siden bakterier bare ble påvist i miltene til musene som ble behandlet med EPS-målrettede GH-løsningen. Selv om disse protokollene er veldig nyttige, er det noen begrensninger.Først bør det bemerkes at det er en deteksjonsbegrensning med in-vivo-bildesystemet, eller IVIS. En reduksjon i luminescerende signal kan ses når bakteriene går inn i stasjonær fase. Derfor er det viktig å samle vev av interesse og måle CFU til stede, da det kan være en frakobling mellom luminescens og CFU opplistet.Imidlertid er IVIS nyttig for å visualisere effekten av behandlingen gjennom en studie, uten å måtte euthanize dyret. En annen begrensning å ta hensyn til er kravet om nøye overvåking av bandasjene. Bandasjene er pålagt å redusere kontraktil helbredelse samt holde såret sterilt fra andre bakterier.Bandasjer må byttes ofte, noe som kan føre til utilsiktet debridering av såret og mulighet for forurensning. Disse protokollene beskriver nye metoder for å studere galle fra spredning, og evaluering av terapeutisk galle fra dispergeringsmidler. Disse modellene tillater utvikling av komplekse polymikrobielle biofilmrelaterte infeksjoner som etterligner klinisk relevante menneskelige infeksjoner.Vårt håp er at disse protokollene vil bli brukt og raffinert for å fremme utviklingen av antibiofilm dispergeringsmidler for terapeutisk bruk.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Vurdering av Somatiske Hypermutation i Ramos B celler etter Overuttrykte eller knockdown av spesifikke gener

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere utvikling av Murint Plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer sin Patches Bruke Adoptive Overføring av Hematopoietic stamfedre

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Kommer til lys Side: I Vivo overvåking av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infeksjoner i kroniske sår i en diabetiker Hairless Murine modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Galle Salt-indusert Biofilm formasjonen i Enteric patogener: teknikker for identifikasjon og måling

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...