Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (R21 AI137462-01A1), da Fundação Ted Nash Long Life, da Fundação Jasper L. e Jack Denton Wilson e do Departamento de Defesa (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Este protocolo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Texas Tech University Health Sciences Center (protocolo número 07044). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.
1. Preparação de bactérias para infecções de camundongos
NOTA: Aqui descrevemos ratos infectantes apenas com Pseudomonas aeru...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Aqui descrevemos protocolos que podem ser utilizados para estudar a eficácia dos agentes de dispersão de biofilmes. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados para uso com diferentes tipos de agentes dispersivos, espécies bacterianas ou amostras ex vivo, incluindo amostras de debridamento clínico. Este protocolo também fornece um modelo clinicamente relevante para coletar e estudar células bacterianas dispersas. Os fenótipos de células bacterianas dispersas têm se mostrado distintos dos das célula...

O aumento da resistência a antibióticos em todo o mundo está levando à falta de opções de antibióticos para tratar uma variedade de infecções bacterianas1. Além da resistência a antibióticos, as bactérias podem ganhar tolerância a antibióticos adotando um estilo de vida associado ao biofilme2. Um biofilme é uma comunidade de microrganismos que são protegidos por uma matriz de polissacarídeos, DNA extracelular, lipídios e proteínas3, coletivamente chamada de substância polimérica extracelular (EPS). À medida que a crise de resistência a antibióticos continua, novas estratégias que prolongam o uso ou potencializam a eficácia de antibióticos são extremamente necessárias. Os agentes anti-biofilme são uma solução promissora4.
Entre as diferentes estratégias anti-biofilmes que foram propostas, a utilização de agentes dispersos, que visam diferentes componentes do EPS biofilme, estão na vanguarda do desenvolvimento terapêutico5. As hidrolases glicóvias (GH) são uma dessas classes de agente disperso. GH são uma grande classe de enzimas que catalisam o decote de diferentes laços dentro dos polissacarídeos que fornecem integridade estrutural ao EPS. Nosso grupo, assim como outros, têm demonstrado que o GH pode efetivamente degradar biofilmes, induzir dispersão e melhorar a eficácia de antibióticos para uma série de espécies bacterianas diferentes, tanto in vitro quanto in vivo6,7,8,9,10,11.
Com um crescente interesse pela dispersão de biofilmes, é importante desenvolver métodos eficazes que avaliem a eficácia dispersa. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o tratamento de infecções de feridas associadas a biofilmes com um agente dispersivo em camundongos, e a avaliação da eficácia dispersão, in vivo e ex vivo. O objetivo geral é fornecer métodos eficazes que possam ser usados com modelos pré-clínicos para medir a dispersão de biofilmes de forma eficaz e eficiente.
Um modelo de infecção por excisão cirúrgica de murina foi utilizado nesses estudos para estabelecer uma infecção associada a biofilmes. Utilizamos esse modelo há mais de 15 anos e publicamos nossas observações extensivamente7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Em geral, este é um modelo de infecção não letal onde as bactérias permanecem localizadas no leito da ferida e são associadas ao biofilme (bactérias vistas em agregados cercados por EPS), configurando uma infecção crônica que dura até 3 semanas. No entanto, se os camundongos são imunocomprometidos (com diabetes tipo 1, por exemplo), eles podem se tornar mais suscetíveis ao desenvolvimento de uma infecção sistêmica fatal neste modelo.
Neste relatório, fornecemos protocolos para avaliar a dispersão de bactérias de uma ferida, tanto in vivo quanto ex vivo. Ambos os protocolos podem ser usados para examinar a eficácia de um agente disperso e ter suas próprias forças e fraquezas. Por exemplo, avaliar a dispersão in vivo pode fornecer informações importantes e em tempo real sobre a disseminação de bactérias para outras partes do corpo após a dispersão, e como o host responde. Por outro lado, avaliar a dispersão ex vivo pode ser mais desejável para a triagem de múltiplos agentes, doses ou formulações, pois o tecido pode ser dividido em múltiplas seções que podem ser testadas separadamente, reduzindo assim o número de camundongos necessários. Ao avaliar vários agentes, normalmente medimos a dispersão primeiro in vitro como descrito anteriormente 6,9,22. Testamos então o teste ex vivo e reserva mais eficaz para um número limitado de agentes muito promissores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

As infecções relacionadas ao biofilm estão implicadas em uma ampla gama de condições crônicas, como úlceras diabéticas não curativas, sinusite crônica, otite média recorrente e muito mais. As células microbianas dentro dessas infecções são protegidas por uma substância polimérica extracelular (EPS), que pode impedir que antibióticos e células imunes hospedeiras limpem a infecção. Para superar esse obstáculo, os investigadores começaram a desenvolver agentes dispersos como potenciais terapêuticos. Esses agentes têm como alvo vários componentes dentro do EPS biofilme, enfraquecendo a estrutura e iniciando a dispersão das bactérias, o que pode teoricamente melhorar a potência dos antibióticos e o despejo imunológico. Para determinar a eficácia dos agentes de dispersão para infecções por feridas, desenvolvemos protocolos que medem a dispersão de biofilmes tanto ex vivo quanto in vivo. Usamos um modelo de excisão cirúrgica de camundongos que foi bem descrito para criar infecções de feridas crônicas associadas a biofilmes. Para monitorar a dispersão in vivo,infectamos as feridas com cepas bacterianas que expressam luciferase. Uma vez estabelecidas infecções maduras, irrigamos as feridas com uma solução contendo enzimas que degradam componentes do EPS biofilme. Em seguida, monitoramos a localização e intensidade do sinal luminescente na ferida e órgãos filtrantes para fornecer informações sobre o nível de dispersão alcançado. Para análise ex vivo da dispersão de biofilmes, o tecido da ferida infectada está submerso em solução enzimética degradante de biofilme, após a qual a carga bacteriana restante no tecido, versus a carga bacteriana em solução, é avaliada. Ambos os protocolos têm pontos fortes e fracos e podem ser otimizados para ajudar a determinar com precisão a eficácia dos tratamentos de dispersão.

Neste experimento, camundongos webster suíços de 8 a 10 semanas foram infectados com 104 UFC de PAO1 carregando a luminescence plasmid pQF50-lux. Como descrito acima, foi permitida uma infecção estabelecer-se por 48 horas antes de administrar tratamentos de 3 x 30 min de PBS (controle de veículo) ou 10% GH (tratamento) para digerir o EPS biofilme. Os camundongos foram retratados antes do tratamento, logo após o tratamento (0h) e às 10h e 20h após o tratamento. Figura 2A e<...

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Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Aqui, descrevemos métodos ex vivo e in vivo para avaliar a dispersão bacteriana de uma infecção por ferida em camundongos. Este protocolo pode ser utilizado para testar a eficácia de terapias antimicrobianas e anti-biofilme tópicas, ou para avaliar a capacidade de dispersão de diferentes cepas bacterianas ou espécies.

Avaliação da dispersão de biofilme em feridas de Murine

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Microbiologistas e médicos de doenças infecciosas estão começando a perceber a importância das infecções associadas ao biofilme em doenças crônicas. O NIH chegou a dizer que mais de 80% das infecções crônicas são devido a biofilmes bacterianos. Isso tem insistido na ênfase no enfrentamento do biofilme e no desenvolvimento de terapêuticas que abordam o problema do biofilme.E muitos desses terapêuticos estão focados na dispersão de células bacterianas que estão em biofilmes fora do biofilme para que possam ser mais facilmente mortas. Mas realmente não há muitos protocolos na literatura atualmente que abordam como determinar a eficácia de tal agente disperso. Então achamos que este é um bom protocolo para usar.É um tipo de infecção bacteriana que está associada ao biofilme. E também achamos que pode ser otimizado facilmente para estudar muitos tipos diferentes de espécies bacterianas, e como eles formam biofilmes e dispersão, bem como diferentes agentes dispersos. E achamos importante entregar isso em um formato de vídeo, pois vimos que existem nuances especialmente para a entrega do agente que encontramos funcionando de forma ideal em ratos.Para começar, avalie o plano da anestesia por beliscão do dedo do dedo do sol, e monitorando a taxa respiratória e o esforço. Raspe a superfície dorsal e aplique um creme depilatório na região raspada por 10 minutos, ou de acordo com as instruções do produto. Retire delicadamente o creme depilatório.E certifique-se de que a pele está seca. Usando um marcador à prova de álcool, desenhe um círculo com um diâmetro de 1,5 centímetros em direção à região posterior da parte traseira. Para o tratamento da dor, administre 0,05 mililitros de lidocaína subcutânea na área a ser extirpada.E 0,02 mililitros de buprenorfina subcutânea no pescoço. Aguarde 10 minutos para garantir que o tratamento da dor seja alcançado. Antes da excisão, desinfete a superfície dorsal usando um cotonete de álcool.Mantenha um campo cirúrgico estéril durante todo o procedimento e use instrumentos autoclavados e luvas estéreis para limitar a contaminação. Administre uma ferida excisional de espessura completa ao nível do músculo panniculus, com uma tesoura cirúrgica. Após a excisão, cubra imediatamente a ferida com um curativo de poliuretano semipermeável.Separe cuidadosamente o apoio do curativo usando dois fórceps finos, se aplicável. Injete aproximadamente 10 para a quarta UFC de bactérias, e 100 microliters PBS sob o curativo e no leito da ferida para estabelecer uma infecção. Note que as feridas também podem ser infectadas com várias espécies de bactérias e/ou fungos simultaneamente, ou colocando biofilmes pré-formados ou mesmo tecido de desbridamento extraído de pacientes no leito da ferida.Após a infecção, coloque os ratos em gaiolas em cima de toalhas de papel para evitar que os ratos asfixiem no material de cama. Coloque as gaiolas em almofadas de aquecimento e monitore os ratos até que eles recuperem seu reflexo de direita. Remova a toalha de papel neste momento.Permita que infecções de feridas se estabeleçam por 48 horas. Inspecione o curativo diariamente para obter lágrimas em áreas de não adesão e substitua-o se necessário. Coloque os camundongos sob anestesia isoflurane a 3% e um litro por minuto de oxigênio, enquanto administra os tratamentos.Injete 200 microliters de solução enzimática ou controle de PBS sobre a ferida, levantando a pele ligeiramente anterior da ferida com fórceps, perfurando cuidadosamente a pele levantada com a seringa, e injetando lentamente a solução na área entre o leito da ferida e o curativo. Para garantir que toda a cama da ferida esteja coberta por solução, levante suavemente o curativo com fórceps, afastando-o lentamente da cama da ferida, enquanto injeta lentamente a solução. Após o tratamento, coloque os ratos de volta em gaiolas por 30 minutos.Após 30 minutos de exposição ao tratamento, reanesthetize os camundongos com isoflurane e aspire a solução restante com uma seringa, perfurando na mesma área de antes. Note que esta solução aspirada contém células bacterianas dispersas, que podem ser salvas para várias análises a jusante. Administrar o segundo e terceiro tratamentos de irrigação, como foi feito para o primeiro usando uma nova seringa cada vez.Se uma cepa luminescente de bactérias for utilizada para iniciar a infecção, um sistema de imagem in vivo pode ser usado para visualizar a dispersão do leito da ferida. Para análise, abra as imagens no software IVIS e selecione a área a ser analisada com a paleta de ferramentas. Para explicar o fundo, coloque um círculo no fundo de uma imagem e, em seguida, coloque o mesmo círculo de tamanho em cima da cama de ferida para cada rato.Na paleta de ferramentas, selecione Medir ROIs e carregue a tabela de medições em uma planilha. Subtraia a leitura do círculo de fundo de cada uma das medidas do leito da ferida para calcular a luminescência de cada amostra. Após a eutanásia humana, colhia o tecido do leito da ferida removendo primeiro suavemente o curativo com fórceps estéreis, e cortando ao redor do perímetro do leito da ferida com uma tesoura cirúrgica estéril.Use fórceps para levantar suavemente uma extremidade do leito da ferida e, em seguida, use uma tesoura para cortar a amostra de tecido longe da camada muscular. Coloque a amostra de tecido em um tubo de homogeneização pré-pesado de dois mililitros contendo um mililitro de PBS. Pesar novamente o tubo depois de inserir a amostra.Para colher o baço, coloque o rato em uma posição anatômica supina e fixe fixando as extremidades em uma superfície de dissecção. Mergulhe a área a ser dissecada com 70% de etanol para ajudar a evitar a contaminação. Faça uma pequena incisão perpendicular à linha média com uma tesoura cirúrgica na dermes do abdômen inferior.Certifique-se de puxar a pele para cima e para longe dos órgãos internos. Continue a incisão ao longo da linha média até que o esterno seja atingido. Uma vez que a cavidade peritoneal é exposta e os órgãos internos são visíveis, separe o baço do tecido conjuntivo e coloque em um tubo de homogeneização pré-pesado separado.Pesar novamente o tubo depois de inserir o baço. Homogeneize as amostras a cinco metros por segundo, durante 60 segundos, duas vezes. Para enumerar a UFC, diluir e detectar em série as amostras homogeneizadas.Diluído em série por pipetar 100 microliters da amostra homogeneizada em 900 microliters de PBS e um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Vórtice antes de continuar a diluição, pipetando 100 microliters da amostra diluída em um tubo separado contendo 900 microliters de PBS. Repita estas etapas até que seis diluições sejam alcançadas.Pipeta 10 microliters de cada diluição na área indicada em uma placa de ágar, como mostrado. Se for necessária uma quantitação mais precisa da UFC, espalhe 100 microlitres de cada diluição da amostra através de placas de ágar separadas. Ferir e infectar camundongos com aproximadamente 10 a 4ª UFC de bactérias, conforme descrito no protocolo in vivo.Permita que a infecção se estabeleça por 48 horas e, em seguida, extraia a cama da ferida de forma semelhante ao protocolo in vivo. Comece removendo cuidadosamente o curativo. Cortando o perímetro da ferida.E separando-se da camada muscular. A amostra do leito da ferida pode ser dividida em várias seções para aumentar o número de amostras. Em seguida, coloque as amostras divididas em tubos de homogeneização vazios pré-pesados separados.Pesar novamente o tubo e calcular o peso da amostra subtraindo o peso do tubo sem a amostra do peso do tubo com a amostra. Adicione um mililitro de PBS ao tubo de homogeneização contendo a amostra, e inverta suavemente o tubo algumas vezes para enxaguar. Remova a lavagem e descarte do PBS.Adicione um mililitro de tratamento GH, ou PBS como controle negativo, e incubar por duas horas a 37 graus Celsius, com agitação a 80 RPM. Remova a bile da solução dispersa e coloque em um tubo de centrífuga separado de 1,5 mililitro. Isto contém as células dispersas.Lave o tecido restante com um mililitro de PBS, como feito anteriormente, e descarte a lavagem pbs. Adicione um mililitro de PBS ao tecido restante e homogeneize a cinco metros por segundo, durante 60 segundos. Diluir em série tanto a solução de células dispersas quanto a amostra de tecido homogeneizado, pipetando 100 microliters da amostra em 900 microliters de PBS em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Vórtice a amostra diluída e continuar a diluição mais cinco vezes para um total de seis diluições. Coloque a amostra tubondo 10 microliters de cada diluição na área indicada em uma placa de ágar seletiva. Conte a UFC e calcule por cento de dispersão dividindo a UFC dispersa pelo total da UFC, e multiplicando por 100.Neste experimento, camundongos webster suíços de oito a 10 semanas foram infectados com 10 a a quarta UFC de PA01 carregando a luminescence plasmid PQF50-lux. A infecção foi autorizada a estabelecer-se por 48 horas antes de administrar três tratamentos de 30 minutos de PBS como controle de veículo, ou 10% GH como um tratamento experimental para digerir o EPS biofilme. Mostrados na seção A, os camundongos foram imagedos pré-tratamento, logo após o tratamento, e às 10 e 20 horas após o tratamento.Usando o IVIS, uma infecção estabelecida pode ser visualizada dentro do leito da ferida gerando um sinal bioluminescente brilhante. A dispersão de bactérias para fora do leito da ferida pode ser visualizada imediatamente após o tratamento de GH, mas não após o tratamento da PBS. A disseminação bacteriana nos órgãos também pode ser vista colocando o rato de lado para a imagem, como mostrado nos painéis inferiores.Na seção B, imagens dos camundongos tratados com PBS e GH demonstraram um aumento no sinal luminescente em 20 horas após o tratamento, em comparação com o pré-tratamento. No entanto, ainda é importante quantificar a UFC devido ao limiar de detecção de uma luminescência no IVIS. Às 20 horas após o tratamento, os camundongos foram eutanizados e os leitos e baços foram coletados para enumerar a UFC por grama de tecido.A seção C mostra a carga bacteriana no leito da ferida, enquanto a seção D mostra a carga bacteriana nos baços. Esses dados sugerem disseminação disseminada das bactérias dispersas, uma vez que as bactérias só foram detectadas nos baços dos camundongos tratados com a solução GH direcionada ao EPS. Embora esses protocolos sejam muito úteis, existem algumas limitações.Em primeiro lugar, deve-se notar que há uma limitação de detecção com o sistema de imagem in vivo, ou IVIS. Uma diminuição no sinal luminescente pode ser vista quando as bactérias entram em fase estacionária. Por isso, é importante coletar tecidos de interesse e medir a UFC presente, pois pode haver uma desconexão entre a luminescência e a UFC enumeradas.No entanto, o IVIS é útil para visualizar a eficácia do tratamento ao longo de um estudo, sem ter que realmente eutanásia o animal. Outra limitação a ser considerada é a exigência de um monitoramento próximo das ataduras. As ataduras são necessárias para reduzir a cicatrização contratil, bem como manter a ferida estéril de outras bactérias.As ataduras precisarão ser substituídas com frequência, o que pode levar ao desbridamento acidental da ferida e oportunidade de contaminação. Esses protocolos descrevem novos métodos para estudar a bile da dispersão, e a avaliação da bile terapêutica dos agentes dispersos. Esses modelos permitem o desenvolvimento de infecções complexas associadas a biofilmes polimicrobianos que imitam infecções humanas clinicamente relevantes.Nossa esperança é que esses protocolos sejam utilizados e refinados para promover o desenvolvimento de agentes de dispersão anti-biofilme para uso terapêutico.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Imunologia e Infecção

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In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

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This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

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Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

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Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

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Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

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Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...