Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R21 AI137462-01A1), la Fundación Ted Nash Long Life, la Fundación Jasper L. y Jack Denton Wilson y el Departamento de Defensa (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Este protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech (número de protocolo 07044). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Preparación de bacterias para infecciones de ratón
NOTA: Aquí describimos la infección de...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Aquí se describen los protocolos que se pueden utilizar para estudiar la eficacia de los agentes de dispersión de biopelículas. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para su uso con diferentes tipos de agentes de dispersión, especies bacterianas o muestras ex vivo, incluidas las muestras de desbridamiento clínico. Este protocolo también proporciona un modelo clínicamente relevante para recolectar y estudiar células bacterianas dispersas. Se ha demostrado que los fenotipos de las células bacteri...

El aumento de la resistencia a los antibióticos en todo el mundo está llevando a la falta de opciones de antibióticos para tratar una variedad de infecciones bacterianas1. Además de la resistencia a los antibióticos, las bacterias pueden ganar tolerancia a los antibióticos mediante la adopción de un estilo de vida asociado a labiopelícula 2. Una biopelícula es una comunidad de microorganismos que están protegidos por una matriz de polisacáridos, ADN extracelular, lípidos y proteínas3,denominada colectivamente sustancia polimérica extracelular (EPS). A medida que continúa la crisis de resistencia a los antibióticos, se necesitan urgentemente nuevas estrategias que prolonguen el uso de antibióticos o potencien su eficacia. Los agentes anti-biopelículas son una solución prometedora4.
Entre las diferentes estrategias anti-biopelículas que se han propuesto, la utilización de agentes de dispersión, que se dirigen a diferentes componentes de la EPS de la biopelícula, están a la vanguardia del desarrollo terapéutico5. Las hidrolasas de glucósido (GH) son una de esas clases de agente de dispersión. Gh son una gran clase de enzimas que catalizan la escisión de diferentes enlaces dentro de los polisacáridos que proporcionan integridad estructural a la EPS. Nuestro grupo, así como otros, han demostrado que la GH puede degradar eficazmente las biopelículas, inducir la dispersión y mejorar la eficacia de los antibióticos para una serie de especies bacterianas diferentes, tanto in vitro como in vivo6,7,8,9,10,11.
Con un creciente interés en la dispersión de biopelículas, es importante desarrollar métodos efectivos que evalúen la eficacia de la dispersión. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el tratamiento de las infecciones de heridas asociadas a biopelículas con un agente de dispersión en ratones, y la evaluación de la eficacia de la dispersión, in vivo y ex vivo. El objetivo general es proporcionar métodos efectivos que se puedan utilizar con modelos preclínicos para medir la dispersión de biopelículas de manera efectiva y eficiente.
Un modelo quirúrgico murine de la infección de la supresión fue utilizado en estos estudios para establecer una infección biofilm-asociada. Hemos utilizado este modelo durante más de 15 años y publicado nuestras observaciones ampliamente7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. En general, este es un modelo de infección no letal donde las bacterias permanecen localizadas en el lecho de la herida y están asociadas al biofilm (bacterias que se ven en agregados rodeados de EPS), estableciendo una infección crónica que dura hasta 3 semanas. Sin embargo, si los ratones están inmunodeprimidos (con diabetes tipo 1, por ejemplo), pueden volverse más susceptibles a desarrollar una infección sistémica fatal en este modelo.
En este informe, proporcionamos protocolos para evaluar la dispersión de bacterias de una herida, tanto in vivo como ex vivo. Ambos protocolos se pueden utilizar para examinar la eficacia de un agente de dispersión y tienen sus propias fortalezas y debilidades. Por ejemplo, evaluar la dispersión in vivo puede proporcionar información importante en tiempo real sobre la propagación de bacterias a otras partes del cuerpo después de la dispersión, y cómo responde el huésped. Por otro lado, evaluar la dispersión ex vivo puede ser más deseable para la detección de múltiples agentes, dosis o formulaciones, ya que el tejido se puede dividir en múltiples secciones que se pueden probar por separado, reduciendo así el número de ratones requeridos. Al evaluar múltiples agentes, normalmente medimos la dispersión primero in vitro como se describió anteriormente 6,9,22. Luego probamos el más efectivo ex vivo y reservamos la prueba in vivo para un número limitado de agentes muy prometedores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Las infecciones relacionadas con el biofilm están implicadas en una amplia gama de condiciones crónicas como úlceras del pie diabético no curativas, sinusitis crónica, otitis media recurrente y muchas más. Las células microbianas dentro de estas infecciones están protegidas por una sustancia polimérica extracelular (EPS), que puede evitar que los antibióticos y las células inmunes del huésped despejen la infección. Para superar este obstáculo, los investigadores han comenzado a desarrollar agentes de dispersión como terapia potencial. Estos agentes se dirigen a varios componentes dentro de la EPS de biopelícula, debilitando la estructura e iniciando la dispersión de las bacterias, lo que teóricamente puede mejorar la potencia de los antibióticos y el aclaramiento inmunológico. Para determinar la eficacia de los agentes de dispersión para las infecciones de heridas, hemos desarrollado protocolos que miden la dispersión de biopelículas tanto ex vivo como in vivo. Utilizamos un modelo quirúrgico de la supresión del ratón que se ha descrito bien para crear infecciones crónicas biofilm-asociadas de la herida. Para monitorizar la dispersión in vivo,infectamos las heridas con cepas bacterianas que expresan luciferasa. Una vez establecidas las infecciones maduras, regamos las heridas con una solución que contiene enzimas que degradan los componentes del biofilm EPS. A continuación, supervisamos la ubicación y la intensidad de la señal luminiscente en los órganos de la herida y filtrado para proporcionar información sobre el nivel de dispersión alcanzado. Para el análisis ex vivo de la dispersión de biopelículas, el tejido de la herida infectada se sumerge en una solución enzimática que degrada la biopelícula, después de lo cual se evalúa la carga bacteriana restante en el tejido, frente a la carga bacteriana en solución. Ambos protocolos tienen fortalezas y debilidades y se pueden optimizar para ayudar a determinar con precisión la eficacia de los tratamientos de dispersión.

En este experimento, 8-10 ratones suizos suizos hembra de la semana de edad Webster fueron infectados con10 4 UFC de PAO1 que lleva el plásmido de luminiscencia pQF50-lux. Según lo descrito arriba, una infección fue permitida establecer para 48 h antes de administrar 3 x 30 tratamientos mínimos de PBS (control del vehículo) o del 10% GH (tratamiento) para digerir el biofilm EPS. Los ratones fueron fototratado pretratamiento, directamente después del tratamiento (0 h) y en 10 h y 20 h post-tratamiento. <s...

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Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Aquí, se describen métodos ex vivo e in vivo para evaluar la dispersión bacteriana de una infección de la herida en ratones. Este protocolo se puede utilizar para probar la eficacia de las terapias antimicrobianas y anti-biofilm tópicas, o para evaluar la capacidad de dispersión de diferentes cepas o especies bacterianas.

Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Los microbiólogos y los médicos de enfermedades infecciosas están empezando a darse cuenta de lo importantes que son las infecciones asociadas a biopelículas en las enfermedades crónicas. Los NIH incluso han dicho que más del 80% de las infecciones crónicas se deben a biopelículas bacterianas. Así que esto ha instado al énfasis en abordar el biofilm, y el desarrollo de terapias que aborden el problema del biofilm.Y un lotta esas terapias se centran en la dispersión de las células bacterianas que están en las biopelículas fuera de la biopelícula para que puedan ser más fácilmente asesinados. Pero realmente no hay muchos protocolos en la literatura actual que aborden cómo determinar la eficacia de tal agente de dispersión. Así que sentimos que este es un buen protocolo para usar.Es un tipo de infección bacteriana que está asociada a biopelículas. Y también creemos que se puede optimizar con bastante facilidad para estudiar muchos tipos diferentes de especies bacterianas, y cómo forman biopelículas y se dispersan, así como diferentes agentes de dispersión. Y creemos que es importante entregar esto en un formato de video, porque hemos visto que hay matices, especialmente en la entrega del agente que hemos encontrado que funcionan de manera óptima en ratones.Para comenzar, evalúe el plano de la anestesia por el pellizco del dedo deldo deldo del edo del dólar, y supervisando el ritmo respiratorio y el esfuerzo. Afeitarse la superficie dorsal y aplicar una crema depilatoria a la región afeitada durante 10 minutos, o según las instrucciones del producto. Retire suavemente la crema depilatoria.Y asegúrese de que la piel esté seca. Usando un marcador a prueba de alcohol, dibuje un círculo con un diámetro de 1,5 centímetros hacia la región posterior de la espalda. Para el manejo del dolor, administre 0,05 mililitros de lidocaína por vía subcutánea en el área a extirpar.Y 0,02 mililitros de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello. Espere 10 minutos para asegurarse de que se alcance el manejo del dolor. Antes de la escisión, desinfecte la superficie dorsal con un hisopo de alcohol.Mantenga un campo quirúrgico estéril durante todo el procedimiento y use instrumentos en autoclave y guantes estériles para limitar la contaminación. Administrar una herida cutánea escisional de espesor completo al nivel del músculo panniculus, con tijeras quirúrgicas. Después de la supresión, cubra inmediatamente la herida con un apósito de poliuretano semipermeable.Separe cuidadosamente el respaldo del apósito usando dos pórceps de punta fina, si corresponde. Inyecte aproximadamente 10 a la cuarta UFC de bacterias, y 100 microlitros PBS debajo del apósito y en el lecho de la herida para establecer una infección. Tenga en cuenta que las heridas también pueden infectarse con múltiples especies de bacterias y / u hongos simultáneamente, o colocando biopelículas preformadas o incluso tejido de desbridamiento extraído de los pacientes en el lecho de la herida.Después de la infección, coloque a los ratones en jaulas encima de las toallas de papel para evitar que los ratones se asfixonen en el material de la ropa de cama. Coloque las jaulas en almohadillas de calefacción y supervise a los ratones hasta que hayan recuperado su reflejo derecho. Retire la toalla de papel en este punto.Permita que las infecciones de la herida se establezcan durante 48 horas. Inspeccione el apósito diariamente en busca de desgarros en áreas de no conformidad y reemplácelo si es necesario. Coloque los ratones bajo anestesia con isoflurano al 3% y un litro por minuto de oxígeno, mientras administra los tratamientos.Inyecte 200 microlitros de solución enzimática o control de PBS sobre la herida levantando la piel ligeramente anterior de la herida con las medidas de control, perforando cuidadosamente la piel levantada con la jeringa e inyectando lentamente la solución en el área entre el lecho de la herida y el apósito. Para asegurarse de que todo el lecho de la herida esté cubierto por una solución, levante suavemente el apósito con las fuerzas, alejándolo del lecho de la herida, mientras inyecta lentamente la solución. Después del tratamiento, coloque a los ratones de nuevo en jaulas durante 30 minutos.Después de 30 minutos de exposición al tratamiento, reanesthetize los ratones con isoflurane y aspire la solución restante con una jeringuilla, perforando en la misma área que antes. Tenga en cuenta que esta solución aspirada contiene células bacterianas dispersas, que pueden guardarse para varios análisis posteriores. Administrar el segundo y tercer tratamiento de riego como se hizo para el primero utilizando una jeringa nueva cada vez.Si una tensión luminiscente de bacterias se utiliza para iniciar la infección, un sistema in vivo de la proyección de imagen se puede utilizar para visualizar la dispersión de la cama de la herida. Para el análisis, abra las imágenes en el software IVIS y seleccione el área a analizar con la paleta de herramientas. Para tener en cuenta el fondo, coloque un círculo en el fondo de una imagen y, a continuación, coloque el mismo círculo del tamaño en la parte superior del lecho de la herida para cada ratón.En la paleta de herramientas, seleccione Medir ROIs y cargue la tabla de medidas en una hoja de cálculo. Reste la lectura del círculo de fondo de cada una de las mediciones del lecho de la herida para calcular la luminiscencia de cada muestra. Después de la eutanasia humana, coseche el tejido del lecho de la herida quitando primero suavemente el apósito con fórceps estériles, y cortando alrededor del perímetro de la cama de la herida con tijeras quirúrgicas estériles.Use fórceps para levantar suavemente un extremo del lecho de la herida, luego use tijeras para cortar la muestra de tejido lejos de la capa muscular. Coloque la muestra de tejido en un tubo de homogeneización de dos mililitros prepesado que contenga un mililitro de PBS. Vuelva a pesar el tubo después de insertar la muestra.Para cosechar el bazo, coloque el ratón en una posición anatómica supina y asegure fijando las extremidades a una superficie de disección. Remoje el área a diseccionar con etanol al 70% para ayudar a prevenir la contaminación. Haga una pequeña incisión perpendicular a la línea media con tijeras quirúrgicas en la dermis de la parte inferior del abdomen.Asegúrese de levantar y alejar la piel de los órganos internos. Continúe la incisión a lo largo de la línea media hasta que se alcance el esternón. Una vez que la cavidad peritoneal está expuesta y los órganos internos son visibles, separe el bazo del tejido conectivo y colóque lo coloque en un tubo de homogeneización prepesado separado.Pesar el tubo de nuevo después de insertar el bazo. Homogeneizar las muestras a cinco metros por segundo, durante 60 segundos, dos veces. Para enumerar la UFC, diluya y detecte en serie las muestras homogeneizadas.Diluir en serie pipeteando 100 microlitros de la muestra homogeneizada en 900 microlitros de PBS y un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Vórtice antes de continuar la dilución pipeteando 100 microlitros de la muestra diluida en un tubo separado que contiene 900 microlitros de PBS. Repita estos pasos hasta que se logren seis diluciones.Pipetee 10 microlitros de cada dilución en el área indicada en una placa de agar como se muestra. Si se requiere una cuantificación de UFC más precisa, extienda 100 microlitros de cada dilución de la muestra a través de placas de agar separadas. Hiere e infecta ratones con aproximadamente 10 a la cuarta UFC de bacterias, como se describe en el protocolo in vivo.Deje que la infección se establezca durante 48 horas, luego extraiga el lecho de la herida de una manera similar al protocolo in vivo. Comience por quitar cuidadosamente el apósito. Corte alrededor del perímetro de la herida.Y la separación de la capa muscular. La muestra del lecho de la herida se puede dividir en varias secciones para aumentar el número de muestras. Luego coloque las muestras divididas en tubos de homogeneización vacíos prepesados separados.Pesar el tubo de nuevo y calcular el peso de la muestra restando el peso del tubo sin la muestra del peso del tubo con la muestra. Agregue un mililitro de PBS al tubo de homogeneización que contiene la muestra e invierta suavemente el tubo unas cuantas veces para enjuagar. Retire el pbs lavar y desechar.Añadir un mililitro de tratamiento gh, o PBS como un control negativo, e incubar durante dos horas a 37 grados Centígrados, con agitación a 80 RPM. Retire la bilis de la solución de dispersión y colóquela en un tubo centrífugo separado de 1,5 mililitros. Esto contiene las celdas dispersas.Lave el tejido restante con un mililitro de PBS, como se hizo anteriormente, y deseche el lavado de PBS. Añadir un mililitro de PBS al tejido restante y homogeneizar a cinco metros por segundo, durante 60 segundos. Diluya en serie tanto la solución de células dispersas como la muestra de tejido homogeneizado pipeteando 100 microlitros de la muestra en 900 microlitros de PBS en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Vórtice la muestra diluida y continúe la dilución cinco veces más para un total de seis diluciones. Detecte la muestra pipeteando 10 microlitros de cada dilución sobre el área indicada en una placa de agar selectiva. Cuente la UFC y calcule el porcentaje de dispersión dividiendo la UFC dispersa por la UFC total y multiplicándola por 100.En este experimento, ocho a 10 ratones suizos hembra de la semana de la semana fueron infectados con 10 a la cuarta UFC de PA01 que llevaba el plásmido de la luminiscencia PQF50-lux. La infección fue permitida establecer por 48 horas antes de administrar tres tratamientos de 30 minutos de PBS como control del vehículo, o el 10% GH como tratamiento experimental para digerir el biofilm EPS. Mostrados en la sección A, los ratones fueron fototratado antes del tratamiento, directamente después del tratamiento, y en 10 y 20 horas después del tratamiento.Usando IVIS, una infección establecida se puede visualizar dentro de la cama de la herida que genera una señal bioluminiscente brillante. La dispersión de bacterias fuera de la cama de la herida se puede visualizar inmediatamente después del tratamiento del GH, pero no después del tratamiento de PBS. La diseminación bacteriana en los órganos también se puede ver colocando el ratón en su lado para la toma de imágenes, como se muestra en los paneles inferiores.En la sección B, las imágenes del PBS y de los ratones GH-tratados demostraron un aumento en señal luminiscente en 20 horas del poste-tratamiento, comparado al tratamiento previo. Sin embargo, todavía es importante cuantificar la UFC debido al umbral de detección de una luminiscencia en IVIS. En 20 horas del poste-tratamiento, los ratones fueron euthanized y las camas de la herida y los bazos fueron recogidos para enumerar CFU por el gramo de tejido.La sección C muestra la carga bacteriana en el lecho de la herida, mientras que la sección D muestra la carga bacteriana en el bazo. Estos datos sugieren la extensión diseminada de las bacterias dispersas, puesto que las bacterias fueron detectadas solamente en los bazos de los ratones tratados con la solución EPS-apuntando del GH. Aunque estos protocolos son muy útiles, hay algunas limitaciones.En primer lugar, debe tenerse en cuenta que hay una limitación de detección con el sistema de imágenes in vivo, o IVIS. Una disminución en la señal luminiscente se puede ver cuando las bacterias entran en fase estacionaria. Por lo tanto, es importante recolectar tejido de interés y medir la UFC presente, ya que puede haber una desconexión entre la luminiscencia y la UFC enumerada.Sin embargo, IVIS es útil para visualizar la eficacia del tratamiento a lo largo de un estudio, sin tener que eutanasiar realmente al animal. Otra limitación a tener en cuenta es el requisito de una estrecha vigilancia de los vendajes. Los vendajes son necesarios para reducir la cicatrización contráctil, así como mantener la herida estéril de otras bacterias.Los vendajes tendrán que ser reemplazados a menudo, lo que puede conducir al desbridamiento accidental de la herida y la oportunidad de contaminación. Estos protocolos describen métodos nuevos para estudiar la bilis de la dispersión, y la evaluación de la bilis terapéutica de los agentes de la dispersión. Estos modelos permiten el desarrollo de infecciones complejas asociadas a biopelículas polimicrobianas que imitan infecciones humanas clínicamente relevantes.Nuestra esperanza es que estos protocolos sean utilizados y refinados para promover el desarrollo de agentes de dispersión anti-biopelícula para uso terapéutico.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

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Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Investigación

Inmunología e Infección

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

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En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

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Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

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Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

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Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...