Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. och Jack Denton Wilson Foundation och Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Detta djurprotokoll granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokollnummer 07044). Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid De nationella hälsoinstituten.
1. Förbereda bakterier för musinfektioner
OBS: Här beskriver vi att infektera möss endast med Pseudomonas aeruginosa. ...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Här beskriver vi protokoll som kan användas för att studera effekten av biofilmsdispersionsmedel. Dessa protokoll kan enkelt anpassas för användning med olika typer av dispergeringsmedel, bakteriearter eller ex vivo-prover, inklusive kliniska debridementprover. Detta protokoll ger också en kliniskt relevant modell för att samla in och studera spridda bakterieceller. Fenotyperna av spridda bakterieceller har visat sig vara åtskilda från de av antingen planktoniska eller biofilmsceller 5...

Ökningen av antibiotikaresistens över hela världen leder till brist på antibiotikaalternativ för att behandla en mängd bakteriella infektioner1. Förutom antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerans genom att anta en biofilmsrelaterade livsstil2. En biofilm är en gemenskap av mikroorganismer som skyddas av en matris av polysackarider, extracellulärt DNA, lipider ochproteiner 3, kollektivt kallad den extracellulära polymera substansen (EPS). När antibiotikaresistenskrisen fortsätter behövs det i hög kvalitet nya strategier som förlänger användningen av eller förstärker effekten av antibiotika. Antibiofilmsmedel är en lovande lösning4.
Bland de olika antibiofilmsstrategier som har föreslagits ligger användningen av spridningsmedel, som riktar sig till olika komponenter i biofilmen EPS, i framkant av terapeutisk utveckling5. Glykosidhydrolaser (GH) är en sådan klass av spridningsmedel. GH är en stor klass av enzymer som katalyserar klyvningen av olika bindningar inom polysackariderna som ger eps strukturell integritet. Vår grupp, liksom andra, har visat att GH effektivt kan bryta ner biofilmer, inducera spridning och förbättra antibiotikaeffekten för ett antal olika bakteriearter, både in vitro och in vivo6,7,8,9,10,11.
Med ett växande intresse för biofilmsspridning är det viktigt att utveckla effektiva metoder som bedömer spridningseffektiviteten. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för behandling av biofilm-associerade sårinfektioner med ett spridningsmedel hos möss, och bedömning av dispersiv effekt, in vivo och ex vivo. Det övergripande målet är att tillhandahålla effektiva metoder som kan användas med prekliniska modeller för att mäta biofilmsspridning effektivt och effektivt.
En murin kirurgiska excision infektion modell användes i dessa studier för att fastställa en biofilm-associerade infektion. Vi har använt denna modell i över 15 år och publicerat våra observationer omfattande7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. I allmänhet är detta en icke-dödlig infektionsmodell där bakterier förblir lokaliserade till sårbädden och är biofilmsrelaterade (bakterier som ses i aggregat omgivna av EPS), vilket sätter upp en kronisk infektion som varar upp till 3 veckor. Men om möss är immunkomprometterade (med typ 1-diabetes till exempel) kan de bli mer mottagliga för att utveckla en dödlig systemisk infektion i denna modell.
I denna rapport tillhandahåller vi protokoll för att bedöma spridningen av bakterier från ett sår, både in vivo och ex vivo. Båda protokollen kan användas för att undersöka effekten av ett spridningsmedel och ha sina egna styrkor och svagheter. Att bedöma spridning in vivo kan till exempel ge viktig realtidsinformation om spridningen av bakterier till andra delar av kroppen efter spridning och hur värden svarar. Å andra sidan kan bedömning av dispersion ex vivo vara mer önskvärt för screening av flera medel, doser eller formuleringar, eftersom vävnaden kan delas in i flera sektioner som kan testas separat, vilket minskar antalet möss som krävs. Vid bedömning av flera agenter mäter vi vanligtvis spridning första in vitro som tidigare beskrivits 6,9,22. Vi testar sedan de mest effektiva ex vivo- och reservtestningen in vivo för ett begränsat antal mycket lovande agenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Biofilm-relaterade infektioner är inblandade i ett brett spektrum av kroniska tillstånd såsom icke-helande diabetiker fotsår, kronisk bihåleinflammation, återkommande öroninflammationer media, och många fler. Mikrobiella celler i dessa infektioner skyddas av en extracellulär polymera substans (EPS), som kan förhindra antibiotika och vara värd för immunceller från att rensa infektionen. För att övervinna detta hinder har utredarna börjat utveckla spridningsmedel som potentiella terapier. Dessa medel riktar sig till olika komponenter inom biofilmen EPS, försvagar strukturen och initierar spridning av bakterierna, vilket teoretiskt kan förbättra antibiotikapotens och immunfrihet. För att bestämma effekten av spridningsmedel för sårinfektioner har vi utvecklat protokoll som mäter biofilmsspridning både ex vivo och in vivo. Vi använder en mus kirurgiska excision modell som har beskrivits väl för att skapa biofilm-associerade kroniska sår infektioner. För att övervaka spridning in vivoinfekterar vi såren med bakteriestammar som uttrycker luciferas. När mogna infektioner har etablerats bevattnar vi såren med en lösning som innehåller enzymer som försämrar komponenter i biofilmen EPS. Vi övervakar sedan platsen och intensiteten hos den självlysande signalen i såret och filtreringsorganen för att ge information om den spridningsnivå som uppnåtts. För ex vivo-analys av biofilmsdispersion är infekterad sårvävnad nedsänkt i biofilmsnedbrytande enzymlösning, varefter bakteriebelastningen som finns kvar i vävnaden, jämfört med bakteriebelastningen i lösningen, bedöms. Båda protokollen har styrkor och svagheter och kan optimeras för att noggrant bestämma effekten av spridningsbehandlingar.

I detta experiment smittades 8-10 veckor gamla kvinnliga schweiziska Webster möss med 104 CFU av PAO1 som bär luminiscensen plasmid pQF50-lux. Som beskrivits ovan tilläts en infektion att etablera 48 h innan 3 x 30 min behandlingar av antingen PBS (fordonskontroll) eller 10% GH (behandling) för att smälta biofilmen EPS. Mössen avbildades före behandlingen, direkt efter behandling (0 h) och vid 10 h och 20 h efter behandlingen. Figur 2A och kompletterande figur 1 vi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Här beskriver vi ex vivo- och in vivo-metoder för att bedöma bakteriell spridning från en sårinfektion hos möss. Detta protokoll kan användas för att testa effekten av aktuella antimikrobiella och antibiofilmsbehandlingar, eller för att bedöma spridningskapaciteten hos olika bakteriestammar eller arter.

Bedömning av biofilmsspridning i murinsår

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Mikrobiologer och infektionsläkare börjar inse hur viktiga biofilmsrelaterade infektioner är vid kronisk sjukdom. NIH har till och med sagt att över 80% av kroniska infektioner beror på bakteriella biofilmer. Detta har därför uppmanat till betoning på att ta itu med biofilm och utveckla terapier som tar itu med biofilmproblemet.Och mycket dessa terapier är inriktade på att sprida bakterieceller som finns i biofilmer ur biofilmen så att de lättare kan dödas. Men det finns verkligen inte många protokoll i litteraturen för närvarande som tar upp hur man bestämmer effektiviteten hos ett sådant spridningsmedel. Så vi känner att detta är ett bra protokoll att använda.Det är en typ av bakteriell infektion som är biofilms-associerad. Och vi tror också att det ganska enkelt kan optimeras för att studera många olika typer av bakteriearter, och hur de bildar biofilmer och sprider sig, liksom olika spridningsmedel. Och vi tycker att det är viktigt att leverera detta i ett videoformat, eftersom vi har sett att det finns nyanser för att särskilt leveransen av agenten som vi har hittat fungerar optimalt hos möss.För att börja, bedöma anestesiplanet genom tå nypa, och genom att övervaka andningshastigheten och ansträngningen. Raka dorsalytan och applicera en depilatory cream på det rakade området i 10 minuter, eller enligt produktens instruktioner. Ta försiktigt bort den depilatoriska grädden.Och se till att huden är torr. Använd en alkoholsäker markör och rita en cirkel med en diameter på 1,5 centimeter mot ryggens bakre region. För smärtlindring, administrera 0,05 milliliter lidokain subkutant i det område som ska strukas.Och 0,02 milliliter buprenorfin subkutant i nacken. Vänta 10 minuter för att säkerställa att smärtlindring uppnås. Före excision, desinficera dorsala ytan med en alkoholpinne.Håll ett sterilt kirurgiskt fält under hela proceduren och använd autoklaverade instrument och sterila handskar för att begränsa kontamineringen. Administrera en full tjocklek excisional huden sår till nivån av panniculus muskeln, med kirurgiska sax. Efter excision, täck omedelbart såret med en halvpermeabel polyuretandressing.Separera försiktigt baksidan från förbandet med två finspetsade tångar, om tillämpligt. Injicera cirka 10 till den fjärde CFU av bakterier och 100 mikroliter PBS under förbandet och på sårbädden för att fastställa en infektion. Observera att sår också kan infekteras med flera arter av bakterier och/eller svampar samtidigt, eller genom att placera förformade biofilmer eller till och med debridementvävnad extraherad från patienter på sårbädden.Efter infektion, placera möss i burar ovanpå pappershanddukar för att förhindra att mössen kväver på sängkläderna. Placera burarna på värmekuddar och övervaka mössen tills de har återfått sin högerreflex. Ta bort pappershandduken vid denna tidpunkt.Låt sårinfektioner etableras i 48 timmar. Inspektera förbandet dagligen för tårar i områden med nonadherence och byt ut det om det behövs. Placera möss under isofluranbedövning vid 3% och en liter syre per minut, samtidigt som behandlingarna administreras.Injicera 200 mikroliter enzymlösning eller PBS-kontroll på såret genom att lyfta huden något främre av såret med tång, försiktigt genomborra den upplyfta huden med sprutan och långsamt injicera lösningen i området mellan sårbädden och förbandet. För att säkerställa att hela sårbädden är täckt av lösning, höj försiktigt förbandet med tång, dra bort det från sårbädden medan du långsamt injicerar lösningen. Efter behandlingen, placera mössen tillbaka i burar i 30 minuter.Efter 30 minuters exponering för behandlingen, reantetetisera mössen med isofluran och aspirera den återstående lösningen med en spruta och punktera i samma område som tidigare. Observera att denna aspirerade lösning innehåller spridda bakterieceller, som kan sparas för olika nedströmsanalyser. Administrera den andra och tredje bevattningsbehandlingen som gjordes för den första med en ny spruta varje gång.Om en självlysande bakteriestam används för att initiera infektion kan ett in vivo-bildsystem användas för att visualisera spridning från sårbädden. För analys öppnar du bilderna i IVIS-programvaran och väljer det område som ska analyseras med verktygspaletten. För att ta hänsyn till bakgrunden placerar du en cirkel på bakgrunden av en bild och placerar sedan samma storlekscirkel ovanpå sårbädden för varje mus.Välj Mät ROI på verktygspaletten och ladda upp måtttabellen till ett kalkylblad. Subtrahera bakgrundscirkelavläsningen från var och en av sårbäddsmätningarna för att beräkna luminescence för varje prov. Efter human dödshjälp, skörda sårbäddsvävnaden genom att först försiktigt ta bort förbandet med sterila tångar och skära runt sårbäddens omkrets med steril kirurgisk sax.Använd tång för att försiktigt lyfta ena änden av sårbädden och använd sedan saxen för att skära bort vävnadsprovet från muskelskiktet. Placera vävnadsprovet i ett förvägt homogeniseringsrör på två milliliter som innehåller en milliliter PBS. Väg röret igen efter att provet har förts in.För att skörda mjälten, placera musen i en smidig anatomisk position och säkra genom att fästa extremiteterna på en dissekeringsyta. Blötlägg området som ska dissekeras med 70% etanol för att förhindra förorening. Gör ett litet snitt vinkelrätt mot mittlinjen med kirurgisk sax i nedre bukens dermis.Se till att dra huden upp och bort från de inre organen. Fortsätt snittet längs mittlinjen tills bröstbenet har uppnåtts. När peritonealhålan exponeras och de inre organen är synliga, separera mjälten från bindväven och placera i ett separat förvägt homogeniseringsrör.Väg röret igen efter att mjälten har förts in. Homogenisera proverna med fem meter per sekund, i 60 sekunder, två gånger. För att räkna upp CFU, seriespäd och punktplatta de homogeniserade proverna.Späds seriellt genom att pipetting 100 mikroliter av det homogeniserade provet till 900 mikroliter PBS och ett 1,5 milliliter centrifugerör. Vortex innan utspädningen fortsätter genom att pipetting 100 mikroliter av det utspädda provet till ett separat rör som innehåller 900 mikroliter PBS. Upprepa dessa steg tills sex utspädningar har uppnåtts.Pipett 10 mikroliter av varje utspädning på det angivna området på en agarplatta enligt bilden. Om mer exakt CFU-kvantifiering krävs, sprid 100 mikroliter av varje utspädning av provet över separata agarplattor. Såra och infektera möss med cirka 10 till den fjärde CFU av bakterier, enligt beskrivningen i in vivo-protokollet.Låt infektionen etablera sig i 48 timmar och extrahera sedan sårbädden på ett liknande sätt som in vivo-protokollet. Börja med att försiktigt ta bort förbandet. Skär runt sårets omkrets.Och separerar från muskelskiktet. Sårbäddsprovet kan delas in i flera sektioner för att öka antalet prover. Placera sedan de uppdelade proverna i separata förvägda tomma homogeniseringsrör.Väg röret igen och beräkna provets vikt genom att subtrahera rörens vikt utan provet från rörets vikt med provet. Tillsätt en milliliter PBS till homogeniseringsröret som innehåller provet och vänd försiktigt röret några gånger för att skölja. Ta bort PBS-tvätten och kassera den.Tillsätt en milliliter GH-behandling, eller PBS som en negativ kontroll, och inkubera i två timmar vid 37 grader Celsius, med skakningar vid 80 RPM. Ta bort gallan från spridningslösningen och placera den i ett separat centrifugeringsrör på 1,5 milliliter. Detta innehåller de spridda cellerna.Tvätta den återstående vävnaden med en milliliter PBS, som tidigare gjorts, och kassera PBS-tvätten. Tillsätt en milliliter PBS till den återstående vävnaden och homogenisera med fem meter per sekund i 60 sekunder. Späd både lösningen av dispergerade celler och det homogeniserade vävnadsprovet genom att pipetting 100 mikroliter av provet till 900 mikroliter PBS i ett 1,5 milliliter centrifugerör.Virvel det utspädda provet och fortsätt utspädningen ytterligare fem gånger för totalt sex utspädningar. Punktplatta provet genom att pipetting 10 mikroliter av varje utspädning på det angivna området på en selektiv agarplatta. Räkna CFU och beräkna procentspridning genom att dividera den spridda CFU med den totala CFU och multiplicera med 100.I detta experiment smittades åtta till 10 veckor gamla kvinnliga schweiziska Webster möss med 10 till den fjärde CFU av PA01 bär luminescence plasmid PQF50-lux. Infektionen tilläts etablera i 48 timmar innan administrera tre 30-minuters behandlingar av antingen PBS som en fordonskontroll, eller 10% GH som en experimentell behandling för att smälta biofilm EPS. Visas i avsnitt A, möss var avbildade före behandling, direkt efter behandling, och vid 10 och 20 timmar efter behandling.Med hjälp av IVIS kan en etablerad infektion visualiseras i sårbädden som genererar en ljus bioluminescerande signal. Spridningen av bakterier ur sårbädden kan visualiseras omedelbart efter GH-behandlingen, men inte efter PBS-behandlingen. Bakteriell spridning till organen kan också ses genom att placera musen på sidan för avbildning, vilket visas i de nedre panelerna.I avsnitt B visade bilder från både PBS- och GH- behandlade möss en ökning av luminescent signalen vid 20 timmar efter behandlingen, jämfört med förbehandling. Det är dock fortfarande viktigt att kvantifiera CFU på grund av detektionströskeln för en luminescence i IVIS. Vid 20 timmar efter behandling avlivades mössen och sårbäddarna och mjältarna samlades in för att räkna upp CFU per gram vävnad.Avsnitt C visar bakteriebelastningen i sårbädden, medan avsnitt D visar bakteriebelastningen i mjälten. Dessa data tyder på spridd spridning av de spridda bakterierna, eftersom bakterier upptäcktes endast i mjälten hos möss som behandlats med EPS-inriktade GH-lösningen. Även om dessa protokoll är mycket användbara finns det vissa begränsningar.För det första bör det noteras att det finns en detektionsbegränsning med in vivo-bildsystemet, eller IVIS. En minskning av luminescent signal kan ses när bakterierna går in i stationär fas. Därför är det viktigt att samla in vävnad av intresse och mäta CFU närvarande, eftersom det kan finnas en koppling mellan luminescence och CFU uppräknad.IVIS är dock användbart för att visualisera effekten av behandlingen under en studie, utan att faktiskt behöva avliva djuret. En annan begränsning att ta hänsyn till är kravet på noggrann övervakning av bandagen. Bandagen krävs för att minska kontraktil läkning samt hålla såret sterilt från andra bakterier.Bandage måste bytas ut ofta, vilket kan leda till oavsiktlig debridement av såret och möjlighet till förorening. Dessa protokoll beskriver nya metoder för att studera galla från spridning och utvärdering av terapeutisk galla från spridningsmedel. Dessa modeller möjliggör utveckling av komplexa polymikrobiella biofilm-associerade infektioner som efterliknar kliniskt relevanta mänskliga infektioner.Vår förhoppning är att dessa protokoll kommer att användas och förfinas för att främja utvecklingen av antibiofilmsdispersionsmedel för terapeutisk användning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Mikroteststrips Dish biofilm bildning analys

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Bedöma Somatisk Hypermutation i Ramos B-celler efter överuttryck eller Knockdown av specifika gener

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Bedöma utvecklingen av murina plasmacytoid dendritiska celler i Peyers Patches Använda adoptiv överföring av hematopoetiska stamfäder

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Komma till den ljus sidan: In Vivo övervakning av Pseudomonas aeruginosa Biofilm infektioner i kroniska sår i en diabetiker hårlösa murina modell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Bile Salt-inducerad Biofilm bildning i enteriska patogener: tekniker för identifiering och kvantifiering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...