Name: assessing biofilm dispersal in murine wounds
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. ve Jack Denton Wilson Vakfı ve Savunma Bakanlığı'nın (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP) hibeleriyle desteklendi.

Bu hayvan protokolü Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası 07044) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Fare enfeksiyonlarına bakteri hazırlama
NOT: Burada fareleri sadece Pseudomonas aeruginosaile enfekte e...

<ol>
	<li>Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+antibiotic+resistance+crisis.">Update on the antibiotic resistance crisis.</a> Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Tolerance+in+Biofilms.">Antimicrobial Tolerance in Biofilms.</a> Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+well+are+we+translating+biofilm+research+from+bench-side+to+bedside.">How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside.</a> Biofilm. 2 (100028), (2020).</li><li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+dispersion.">Biofilm dispersion.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).</li><li>Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+Hydrolases+Degrade+Polymicrobial+Bacterial+Biofilms+in+Wounds.">Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).</li><li>Fleming, D., Rumbaugh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consequences+of+Biofilm+Dispersal+on+the+Host.">The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).</li><li>Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Efficacy+of+Glycoside+Hydrolases+to+Disperse+Biofilms.">Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoside+hydrolase+DisH+from+Desulfovibrio+vulgaris+degrades+the+N-acetylgalactosamine+component+of+diverse+biofilms.">Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms.</a> Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).</li><li>Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).</li><li>Dalton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+polymicrobial+biofilm+wound+infection+model+to+study+interspecies+interactions.">An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions.</a> PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).</li><li>Wolcott, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+maturity+studies+indicate+sharp+debridement+opens+a+time-+dependent+therapeutic+window.">Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window.</a> Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).</li><li>Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+surveillance+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+during+polymicrobial+infection.">Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).</li><li>Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+Pseudomonas+aeruginosa+acute+burn+and+chronic+surgical+wound+infection.">Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection.</a> PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).</li><li>Harrison, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+1,000-Year-Old+Antimicrobial+Remedy+with+Antistaphylococcal+Activity.">A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity.</a> mBio. 6 (4), 01129 (2015).</li><li>Wolcott, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+is+a+primary+cause+of+pathogenesis+of+chronic+wounds.">Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds.</a> Journal of Wound Care. 25, 33-43 (2016).</li><li>Ibberson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infecting+microorganisms+dramatically+alter+pathogen+gene+essentiality+during+polymicrobial+infection.">Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).</li><li>Fleming, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+Glycoside+Hydrolases+to+Improve+the+Quantification+and+Visualization+of+Biofilm+Bacteria.">Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria.</a> Biofilm. 2, (2020).</li><li>DeLeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interactions+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+in+vitro+wound+model.">Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).</li><li>Darch, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Inhibit+Pathogen+Dissemination+by+Targeting+Bacterial+Migrants+in+a+Chronic+Infection+Model.">Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model.</a> mBio. 8 (2), (2017).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nature Communications. 5, 4462 (2014).</li><li>Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Variation+during+Biofilm+Formation:+Implications+for+Anti-Biofilm+Therapeutic+Design.">Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design.</a> Materials (Basel). 11 (7), (2018).</li><li>Sauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+nutrient-induced+dispersion+in+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1+biofilm.">Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm.</a> J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).</li><li>Kuklin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+bacterial+infection+in+vivo:+development+of+bioluminescent+staphylococcal+foreign-body+and+deep-thigh-wound+mouse+infection+models.">Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo.">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li><li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+biofilms.">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation.">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).</li></ol>

Burada biyofilm dispersiyon ajanlarının etkinliğini incelemek için kullanılabilecek protokolleri açıklıyoruz. Bu protokoller, klinik debridman örnekleri de dahil olmak üzere farklı dispersiyon ajanları, bakteri türleri veya ex vivo örnekleri ile kullanıma kolayca uyarlanabilir. Bu protokol ayrıca dağınık bakteri hücrelerini toplamak ve incelemek için klinik olarak ilgili bir model sağlar. Dağınık bakteri hücrelerinin fenotiplerinin planktonik veya biyofilm hücrelerind...

Dünya çapında antibiyotik direncinin artması, çeşitli bakteriyel enfeksiyonları tedavi etmek için antibiyotik seçeneklerinin eksikliğine yol açar1. Antibiyotik direncine ek olarak, bakteriler biyofilm ile ilişkili bir yaşam tarzı benimseyerek antibiyotik toleransı kazanabilir2. Biyofilm, toplu olarak hücre dışı polimerik madde (EPS) olarak adlandırılan polisakkaritler, hücre dışı DNA, lipitler veproteinler 3matrisi ile korunan bir mikroorganizma topluluğudur. Antibiyotik direnci krizi devam ettikçe, antibiyotiklerin kullanımını uzatan veya etkinliğini etkileyen yeni stratejilere şiddetle ihtiyaç vardır. Anti-biyofilm ajanları umut verici bir çözümdür4.
Önerilen farklı anti-biyofilm stratejileri arasında, biyofilm EPS'nin farklı bileşenlerini hedefleyen dispersal ajanların kullanımı terapötik gelişimin ön saflarında yer almaktadır5. Glikozit hidrolazları (GH) bu tür bir dispersiyon maddesi sınıfıdır. GH, EPS'ye yapısal bütünlük sağlayan polisakkaritler içindeki farklı bağların bölünmesini katalİze eden büyük bir enzim sınıfıdır. Grubumuz ve diğerleri, GH'nin biyofilmleri etkili bir şekilde bozabileceğini, dağılmayı teşvik edebildiği ve hem in vitro hem de in vivo6 , 7 ,8,9,10,11gibi bir dizi farklı bakteri türü için antibiyotik etkinliğini artırabileceğini göstermiştir.
Biyofilm dispersiyona artan bir ilgi ile, dispersiyon etkinliğini değerlendiren etkili yöntemler geliştirmek önemlidir. Burada, farelerde bir dispersiyon ajanı ile biyofilm ilişkili yara enfeksiyonlarının tedavisi ve dağılım etkinliğinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, in vivo ve ex vivo. Genel amaç, biyofilm dağılımını etkili ve verimli bir şekilde ölçmek için preklinik modellerle kullanılabilecek etkili yöntemler sağlamaktır.
Bu çalışmalarda biyofilm ilişkili bir enfeksiyon oluşturmak için bir murine cerrahi eksizyon enfeksiyon modeli kullanılmıştır. Biz 15 yılı aşkın bir süredir bu modeli kullandık ve gözlemlerimizi kapsamlı bir şekilde yayınladık7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Genel olarak, bu, bakterilerin yara yatağına lokalize kaldığı ve biyofilm ile ilişkili olduğu (EPS ile çevrili agregalarda görülen bakteriler), 3 haftaya kadar süren kronik bir enfeksiyon oluşturan ölümcül olmayan bir enfeksiyon modelidir. Bununla birlikte, fareler bağışıklık sistemik olarak (örneğin Tip 1 diyabet ile) bağışıklık kazanırsa, bu modelde ölümcül bir sistemik enfeksiyon geliştirmeye daha duyarlı hale gelebilirler.
Bu raporda, hem in vivo hem de ex vivo bir yaradan bakterilerin dağılımını değerlendirmek için protokoller sunuyoruz. Her iki protokol de bir dağılım ajanının etkinliğini incelemek ve kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahip olmak için kullanılabilir. Örneğin, dağılım in vivo'nun değerlendirilmesi, bakterilerin dağıldıktan sonra vücudun diğer bölgelerine yayılması ve konağın nasıl tepki verdiği hakkında önemli, gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Öte yandan, dispersiyon ex vivo'nun değerlendirilmesi, doku ayrı ayrı test edilebilen birden fazla bölüme ayrılabileceğinden, gerekli fare sayısını azaltabileceğinden, birden fazla ajanın, dozun veya formülasyonun taranması için daha arzu edilebilir. Birden fazla ajanı değerlendirirken, genellikle daha önce açıklandığı gibi dispersiyon ilk in vitro ölçüldü 6,9,22. Daha sonra en etkili ex vivo'yu test ediyoruz ve sınırlı sayıda çok umut verici ajan için in vivo testini ayırıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Use to complete serial dilutions of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 58 in needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td>Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 &#181;L to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100447</td>
			<td>Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>RX216118</td>
			<td>Use as pain mainagement- may use other options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2150583</td>
			<td>Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 &#176;C for 30 min- other dispersal agents can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>287746</td>
			<td>Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps, Serrated Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-460-536</td>
			<td>Can use other forms of forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flasks baffled 125 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>101406</td>
			<td>Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Benchtop Homogenizer</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6VFV9</td>
			<td>Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td>Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15340151</td>
			<td>Used to homogenize samples for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Add 25 g/L and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 2% Injectable</td>
			<td>Diamond Back Drugs</td>
			<td>2468</td>
			<td>Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meropenem</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile cotton gauze sponges</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td>Use to remove the depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAO1 pQF50-lux bacterial strain</td>
			<td>Ref [13]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PHR1772-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3991</td>
			<td>Dilute 10x to 1x prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane dressing</td>
			<td>Mckesson</td>
			<td>66024007</td>
			<td>Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90004-394</td>
			<td>Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh P.M.</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Use on eyes to reduce dryness during procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Delicate Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89515</td>
			<td>Can also use curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>551NCISWWEB</td>
			<td>Other mice strains can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring Slip Tip 1 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14823434</td>
			<td>Used to administer drugs and enzyme treatment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing biofilm dispersal in murine wounds

Biyofilme bağlı enfeksiyonlar, iyileşmeyen diyabetik ayak ülserleri, kronik sinüzit, tekrarlayan otitis media ve daha fazlası gibi çok çeşitli kronik durumlara bulaşmıştır. Bu enfeksiyonların içindeki mikrobiyal hücreler, antibiyotiklerin ve konak bağışıklık hücrelerinin enfeksiyonu temizlemesini önleyebilen hücre dışı polimerik bir madde (EPS) ile korunmaktadır. Bu engeli aşmak için, araştırmacılar potansiyel terapötikler olarak dispersiyon ajanları geliştirmeye başladılar. Bu ajanlar biyofilm EPS içindeki çeşitli bileşenleri hedef alarak yapıyı zayıflatır ve teorik olarak antibiyotik gücünü ve bağışıklık açıklığını artırabilen bakterilerin dağılmasını başlatır. Dispersiyon ajanlarının yara enfeksiyonları için etkinliğini belirlemek için, biyofilm dispersiyonunu ölçen protokoller geliştirdik hem ex vivo hem de in vivo . Biyofilm ile ilişkili kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için iyi tanımlanmış bir fare cerrahi eksizyon modeli kullanıyoruz. Dispersiyon in vivoizlemek için, yaralara luciferaz eksprese bakteriyel suşları bulaştırırız. Olgun enfeksiyonlar ortaya çıktıktan sonra, yaraları biyofilm EPS bileşenlerini bozan enzimler içeren bir çözelti ile sularız. Daha sonra elde edilen dağılım seviyesi hakkında bilgi sağlamak için yara ve filtreleme organlarındaki parlaklık sinyalinin yerini ve yoğunluğunu izliyoruz. Biyofilm dispersiyonunun ex vivo analizi için, enfekte yara dokusu biyofilm bozan enzim çözeltisi içine batırılır, daha sonra dokuda kalan bakteri yükü ile çözeltideki bakteri yükü değerlendirilir. Her iki protokol de güçlü ve zayıf yönleri vardır ve dağılım tedavilerinin etkinliğini doğru bir şekilde belirlemeye yardımcı olmak için optimize edilebilir.

Bu deneyde, 8-10 haftalık dişi İsviçre Webster farelerine lüminesans plazmid pQF50-lux taşıyan10 4 CFU PAO1 ile enfekte edildi. Yukarıda açıklandığı gibi, biyofilm EPS'yi sindirmek için PBS (araç kontrolü) veya% 10 GH (tedavi) 3 x 30 dakikalık tedavileri uygulamadan önce 48 saat boyunca bir enfeksiyon kurulmasına izin verildi. Fareler tedaviden hemen sonra (0 h) ve tedavi sonrası 10 saat 20 saat olarak görüntülendi. Şekil 2A ve Ek Şekil 1, </strong...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds at JoVE.com

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Burada, farelerdeki bir yara enfeksiyonundan bakteriyel dağılımı değerlendirmek için ex vivo ve in vivo yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, topikal antimikrobiyal ve anti-biyofilm tedavilerinin etkinliğini test etmek veya farklı bakteri suşlarının veya türlerinin dağılım kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir.

Murine Yaralarında Biyofilm Dağılımının Değerlendirilmesi

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Mikrobiyologlar ve enfeksiyon hastalıkları hekimleri kronik hastalıkta biyofilm ilişkili enfeksiyonların ne kadar önemli olduğunu fark etmeye başlıyorlar. NIH, kronik enfeksiyonların % 80'inden fazlasının bakteriyel biyofilmlerden kaynaklandığını bile söylemiştir. Bu nedenle, biyofilm'in ele alınmasına ve biyofilm sorununu ele alan terapötiklerin geliştirilmesine vurgu yapmaya yöneliktir.Ve bu terapötiklerin çoğu, biyofilmlerdeki bakteri hücrelerini biyofilmden dağıtmaya odaklanmıştır, böylece daha kolay öldürülebilirler. Ama literatürde şu anda böyle bir dağıtıcı ajanın etkinliğinin nasıl belirleneceklerine dair çok fazla protokol yok. Bu yüzden bunun iyi bir protokol olduğunu hissediyoruz.Biyofilmle ilişkili bir bakteriyel enfeksiyon türü. Ayrıca, birçok farklı bakteri türünü ve biyofilmleri nasıl oluşturduklarını ve dağıldıklarını ve farklı dispersiyon maddelerini incelemek için oldukça kolay bir şekilde optimize edilebileceğini düşünüyoruz. Ve bunu bir video formatında sunmanın önemli olduğunu düşünüyoruz, çünkü özellikle farelerde en iyi şekilde iş bulduğumuz ajanın teslimatının nüansları olduğunu gördük.Başlamak için, anestezi düzlemini parmak sıkışması ile ve solunum hızını ve çabasını izleyerek değerlendirin. Sırt yüzeyini tıraş edin ve tıraş edilen bölgeye 10 dakika boyunca veya ürünün talimatlarına göre bir depilatör krem uygulayın. Depilatör kremi yavaşça çıkarın.Ve cildin kuru olduğundan emin olun. Alkol geçirmez bir işaretleyici kullanarak, sırtın arka bölgesine doğru 1,5 santimetre çapında bir daire çizin. Ağrı yönetimi için, eksize edilecek bölgeye deri altından 0,05 mililitre lidokrin sürün.Ve boynunda deri altından 0.02 mililitre buprenorfin. Ağrı yönetimine ulaşıldığından emin olmak için 10 dakika bekleyin. Eksizyondan önce, bir alkol çubuğu kullanarak sırt yüzeyini dezenfekte edin.İşlem boyunca steril bir cerrahi alan sağlayın ve kontaminasyonu sınırlamak için otomatik kapatılmış aletler ve steril eldivenler kullanın. Cerrahi makasla panniculus kas seviyesine tam kalınlıklı eksizyonel bir cilt yarası sürün. Eksizyondan sonra, yarayı hemen yarı geçirgen bir poliüretan pansuman ile örtün.Varsa, iki ince uçlu mandip kullanarak sırtı pansumandan dikkatlice ayırın. Bir enfeksiyon oluşturmak için dördüncü bakteri CFU'suna yaklaşık 10 ve pansumanın altına ve yara yatağına 100 mikrolitre PBS enjekte edin. Ayrıca, yaralar aynı anda birden fazla bakteri ve/veya mantar türüyle veya hastalardan çıkarılan önceden biçimlendirilmiş biyofilmlerin hatta debridman dokusunun yara yatağına yerleştirilmesiyle de enfekte olabilir.Enfeksiyondan sonra, farelerin yatak malzemesi üzerinde boğulmasını önlemek için fareleri kağıt havluların üstündeki kafeslere yerleştirin. Kafesleri ısıtma pedlerine yerleştirin ve fareleri sağ reflekslerini geri kazanana kadar izleyin. Bu noktada kağıt havluyu çıkarın.Yara enfeksiyonlarının 48 saat boyunca kurulmasına izin verin. Her gün doğal olmayan alanlarda gözyaşı için pansumanı inceleyin ve gerekirse değiştirin. Tedavileri uygularken fareleri% 3 ve dakikada bir litre oksijende izofluran anestezisi altına yerleştirin.Yaranın ön kısmını deriyi forsepsle hafifçe kaldırarak, kaldırılan cildi şırıngayla dikkatlice delerek ve çözeltiyi yavaşça yara yatağı ile pansuman arasındaki bölgeye enjekte ederek yaraya 200 mikrolitre enzim çözeltisi veya PBS kontrolü enjekte edin. Tüm yara yatağının çözelti ile kap olduğundan emin olmak için, çözeltiyi yavaşça enjekte ederken, pansumanı forsepsle hafifçe kaldırın, yara yatağından çekin. Tedaviden sonra, fareleri 30 dakika boyunca kafeslere geri yerleştirin.Tedaviye 30 dakika maruz kaldıktan sonra, fareleri izofluran ile yeniden uyuşturun ve kalan çözeltiyi bir şırınna ile aspire edin, daha önce olduğu gibi aynı bölgede delinir. Bu aspire edilmiş çözeltinin, çeşitli aşağı akış analizleri için kaydedilebilecek dağınık bakteri hücreleri içerdiğini unutmayın. İkinci ve üçüncü sulama arıtmalarını her seferinde yeni bir şırıng kullanarak ilki için yapıldığı gibi yönetin.Enfeksiyonu başlatmak için parlak bir bakteri suşu kullanılırsa, yara yatağından dağılımı görselleştirmek için bir in-vivo görüntüleme sistemi kullanılabilir. Analiz için, görüntüleri IVIS yazılımında açın ve araç paleti ile analiz edilecek alanı seçin. Arka planı hesaba katmak için, görüntünün arka planına bir daire yerleştirin ve ardından her fare için yara yatağının üzerine aynı büyüklükteki daireyi yerleştirin.Araç paletinden RoI'leri ölç'ü seçin ve ölçüm tablosunu bir elektronik tabloya yükleyin. Her numune için lüminesansı hesaplamak için yara yatağı ölçümlerinin her birinden arka plan dairesi okumasını çıkarın. İnsancılı ötenaziden sonra, önce pansumanı steril tokalarla nazikçe çıkararak ve steril cerrahi makasla yara yatağının çevresini keserek yara yatağı dokusunu hasat edin.Yara yatağının bir ucunun hafifçe kaldırılması için önseçim kullanın, ardından doku örneğini kas tabakasından kesmek için makas kullanın. Doku örneğini bir mililitre PBS içeren önceden tartılmış iki mililitrelik homojenizasyon tüpüne yerleştirin. Numuneyi yerleştirdikten sonra tüpü tekrar tartın.Dalağını hasat etmek için, fareyi arka anatomik bir konuma getirin ve ekstremiteleri bir diseksiyon yüzeyine sabitleyerek sabitleyin. Kirlenmeyi önlemeye yardımcı olmak için% 70 etanol ile parçalanacak alanı ıslatın. Alt karın derminde cerrahi makas ile orta çizgiye dik küçük bir kesi yapın.Cildi yukarı ve iç organlardan çektiğinizden emin olun. Sternuma ulaşılana kadar kesiği orta hat boyunca devam ettir. Periton boşluğu açığa çıktıktan ve iç organlar görünür olduğunda, dalağını bağ dokusundan ayırın ve önceden tartılmış ayrı bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.Dalağını taktıktan sonra tüpü tekrar tartın. Örnekleri saniyede beş metrede, 60 saniye boyunca, iki kez homojenize edin. CFU'yu numaralandırmak için homojenize numuneleri seri olarak seyreltin ve tespit edin.Homojenize numunenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS ve 1,5 mililitre santrifüj tüpüne pipetleme ile seri olarak seyreltin. Seyreltilmiş numunenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS içeren ayrı bir tüpe pipetleme ile seyreltme devam etmeden önce girdap. Altı seyreltme elde edilene kadar bu adımları tekrarlayın.Pipet Her seyreltmenin 10 mikrolitresi gösterildiği gibi bir agar plakasında belirtilen alana. Daha hassas CFU nicelasyonu gerekiyorsa, numunenin her seyreltilmesinden 100 mikrolitreyi ayrı agar plakaları boyunca yayın. İn vivo protokolde açıklandığı gibi, fareleri yaklaşık 10 ila dördüncü CFU bakteri ile yaralar ve enfekte eder.Enfeksiyonun 48 saat boyunca kurulmasına izin verin, ardından yara yatağını in-vivo protokole benzer bir şekilde çıkarın. Pansumanı dikkatlice çıkararak başlayın. Yaranın çevresini kesiyor.Ve kas tabakasından ayrılıyor. Yara yatağı örneği, numune sayısını artırmak için birden fazla bölüme ayrılabilir. Daha sonra bölünmüş numuneleri önceden tartılmış ayrı boş homojenizasyon tüplerine yerleştirin.Tüpü tekrar tartın ve numune ile tüpün ağırlığından numune olmadan tüpün ağırlığını çıkararak numunenin ağırlığını hesaplayın. Numuneyi içeren homojenizasyon tüpüne bir mililitre PBS ekleyin ve durulamak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. PBS yıkamayı çıkarın ve atın.Negatif kontrol olarak bir mililitre GH tedavisi veya PBS ekleyin ve 80 RPM'de sallanarak 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Safrayı dispersiyon çözeltisinden çıkarın ve ayrı bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne yerleştirin. Bu dağınık hücreleri içerir.Kalan dokuyu daha önce yapıldığı gibi bir mililitre PBS ile yıkayın ve PBS yıkamayı atın. Kalan dokuya bir mililitre PBS ekleyin ve saniyede beş metrede 60 saniye homojenize edin. 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 100 mikrolitre PBS'ye pipetleme ile hem dağınık hücrelerin çözeltisini hem de homojenize doku örneğini seri olarak seyreltin.Seyreltilmiş numuneyi girdaplayın ve toplam altı seyreltme için seyreltmeye beş kez daha devam edin. Seçici bir agar plakası üzerinde belirtilen alana her seyreltmenin 10 mikrolitresini pipetleme ile numuneyi tespit edin. CFU'yu sayın ve dağınık CFU'yu toplam CFU'ya bölerek ve 100 ile çarparak yüzde dağılımını hesaplayın.Bu deneyde, sekiz ila 10 haftalık dişi İsviçre Webster fareleri, lüminesans plazmid PQF50-lux taşıyan PA01'in dördüncü CFU'suna 10 ile enfekte oldu. Enfeksiyon, PBS'nin araç kontrolü olarak üç adet 30 dakikalık tedavisini veya biyofilm EPS'yi sindirmek için deneysel bir tedavi olarak% 10 GH'yi yönetmeden önce 48 saat boyunca kurulmasına izin verildi. A bölümünde gösterilen fareler, tedaviden hemen sonra ve tedavi sonrası 10 ve 20 saatte ön tedavi olarak görüntülendi.IVIS kullanılarak, yara yatağı içinde parlak bir biyolüminesans sinyali üreten yerleşik bir enfeksiyon görselleştirilebilir. Bakterilerin yara yatağından dağılımı GH tedavisinden hemen sonra görselleştirilebilir, ancak PBS tedavisinden sonra değil. Alt panellerde gösterildiği gibi, fareyi görüntüleme için yanına yerleştirerek organlara bakteri yayılımları da görülebilir.B bölümünde, hem PBS hem de GH ile tedavi edilen farelerden gelen görüntüler, tedavi sonrası 20 saatte, ön tedaviye kıyasla lüminesan sinyalde bir artış olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, IVIS'te bir lüminesans algılama eşiği nedeniyle CFU'nun nicel olması hala önemlidir. Tedaviden 20 saat sonra, fareler ötenaziye tabi tedavüle alındı ve yara yatakları ve dalaklar, CFU'nun gram doku başına numaralandırılması için toplandı.Bölüm C yara yatağındaki bakteri yükünü gösterirken, D bölümü dalaklardaki bakteri yükünü gösterir. Bu veriler, dağınık bakterilerin yayılmasını göstermektedir, çünkü bakteriler sadece EPS hedefli GH çözeltisi ile tedavi edilen farelerin dalaklarında tespit edildi. Bu protokoller çok yararlı olsa da, bazı sınırlamalar vardır.İlk olarak, in-vivo görüntüleme sistemi veya IVIS ile bir algılama sınırlaması olduğu belirtilmelidir. Bakteriler sabit faza girdiğinde lüminesan sinyalde bir azalma görülebilir. Bu nedenle, luminesans ve CFU numaralandırılmış arasında bir kopukluk olabileceği için, ilgi dokusunu toplamak ve mevcut CFU'nun ölçülebilmesi önemlidir.Bununla birlikte, IVIS, hayvanı gerçekten ötenazi yapmak zorunda kalmadan, bir çalışma boyunca tedavinin etkinliğini görselleştirmek için yararlıdır. Dikkate alınması gereken bir diğer sınırlama da bandajların yakından izlenmesi gereksinimidir. Bandajlar, kontnaktil iyileşmeyi azaltmak ve yarayı diğer bakterilerden steril tutmak için gereklidir.Bandajların sık sık değiştirilmesi gerekecektir, bu da yaranın kazara debridmanlanmasına ve kirlenme fırsatına yol açabilir. Bu protokoller, safrayı dağılımdan incelemek için yeni yöntemleri ve dispersiyon ajanlarından terapötik safranın değerlendirilmesini açıklar. Bu modeller, klinik olarak ilgili insan enfeksiyonlarını taklit eden karmaşık polimikrobiyal biyofilm ilişkili enfeksiyonların gelişmesine izin verir.Umudumuz, bu protokollerin terapötik kullanım için anti-biyofilm dispersiyon ajanlarının geliştirilmesi için kullanılması ve rafine edilmesidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...