Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

يستحق الشكر جريج سيلي وألان كونتي لمساعدتهما التقنية الممتازة. وقد دعمت المفوضية الأوروبية هذا العمل في سياق البرنامج الإطاري السابع، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم، ومؤسسة شميدر - بوريش. تلقى Z.I. التمويل من مجلس البحوث الأوروبي، ERC المتقدمة [ERC-2011-ADG 294742] وB.M.W. من منحة فولبرايت للبحوث ومنحة التميز الحكومية السويسرية.

وقد نفذ البروتوكولات التي شاركت فيها الحيوانات أفراد معتمدون وبعد إذن من إدارة المقاطعة الكانتونية في جنيف، سويسرا، ووفقا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في بحوث العيون والرؤية (الموافقة رقم). جنرال إلكتريك/94/17). الكبار صحية الفئران براون النرويج, C57BL/6 الفئران, والأرانب البيضاء نيوزيلندا تم ا...

وجود طرق موحدة لعزل وزراعة خلايا PE أمر أساسي في تطوير نهج العلاج الجديدة للأمراض التنكسية الشبكية. مع البروتوكولات المعروضة هنا، يمكن عزل خلايا PE بنجاح من الأنواع المختلفة ومثقفة لفترات طويلة (حتى الآن، تم الحفاظ على أطول ثقافة لمدة 2 سنة1،38)؛ لوحظت نموذجية ...

تركز مجموعتنا على تطوير أساليب تجديدية لعلاج الانحطاط العصبي الشبكي ، أي AMD ، من خلال العلاج الجيني غير الفيروسي القائم على RPE و IPE. إن إنشاء هذه العلاجات قبل السريرية يستلزم نماذج في المختبر قابلة للنقل إلى البشر. وبالتالي، فإن الهدف من الدراسة المعروضة هنا هو تقديم بروتوكولات لعزل الخلايا الأولية RPE و IPE وثقافتها وهندستها الوراثية. والأساس المنطقي لإنشاء عزل خلايا ال PE عن أنواع متعددة هو التأكيد بقوة على سلامة وكفاءة النهج وزيادة قابليته للاستنساخ والنقل. يختلف خط الخلية البشرية المتاحة ARPE-19 عن الخلايا الأولية (على سبيل المثال، فهي أقل صبغة) وبالتالي، فهي ذات قيمة محدودة فقط للتحليلات ما قبل السريرية1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن شراء خلايا الثدييات غير البشرية بتكلفة أقل وبكميات أكبر؛ يمكن الحصول على الأنسجة المانحة الإنسان من مختلف البنوك العين، ولكن توافر محدودة ومكلفة. وأخيرا، يجب تطبيق المنتجات الطبية الجديدة للعلاج المتقدم (ATMP، أي الخلايا أو الأنسجة أو المنتجات الطبية للعلاج الجيني) في نوعين مختلفين على الأقل قبل اختبارها في المرضى، وهذه الدراسات في الجسم الحي تطلب إعداد عمليات زرع الخلايا المسببة للحساسية.
أمراض الشبكية العصبية هي السبب الرئيسي للعمى في البلدان الصناعية، والتي تشمل الأمراض الشائعة مثل AMD، فضلا عن أمراض نادرة مثل التهاب الشبكية الصباغي، الذي يؤدي موت خلايا الشبكية في نهاية المطاف إلى العمى. يمكن إبطاء خلايا RPE ، المستقبل الضوئي ، وخلايا العقدة الشبكية (RGC) في بعض الحالات ، ولكن لا توجد حاليا علاجات علاجية متاحة. توفر أجهزة الصراف الآلي إمكانية تصحيح العيوب الجينية أو دمج الجينات العلاجية أو استبدال الخلايا المنحطة ، وبالتالي تمكين تطوير علاجات تجديدية وعلاجية لأمراض مثل AMD ؛ 13 العلاجات الجينية حصلت بالفعل على موافقة التسويق بما في ذلك العلاج لعلاج RPE65 الطفرات المرتبطة انحطاط الشبكية2,3. بين كبار السن (>60 سنة)، ~ 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم تتأثر إما الأوعية الدموية الجديدة (nvAMD) أو الأوعية الدموية (AAMD) AMD4. يتم تحريض كلا الشكلين من قبل مشغلات المرتبطة بالعمر بما في ذلك الضرر التأكسدي، وضعف وظيفة وفقدان خلايا RPE تليها تدهور مستقبلات ضوئية، من بين أمور أخرى (مثل أليليس الخطر الوراثي، والتدخين، وارتفاع ضغط الدم)5،6. في nvAMD ، يتفاقم الإمراض بسبب عدم توازن العوامل الوعائية والمضاادة للأوعية الدموية لصالح عامل النمو البطاني الوعائي الوعائي (VEGF) الذي يحفز الأوعية الدموية الجديدة المشيمية (CNV). حتى الآن، nvAMD فقط يمكن علاجها عن طريق الحقن الشهري داخلفيتريال من مثبطات البروتين VEGF لقمع CNV. لا يوجد علاج فعال متاح حتى الآن لAMD6،7.
قيمت العديد من الدراسات العلاجات القائمة على الخلايا لتحل محل العلاج المضاد ل VEGF: أظهرت الدراسات التي أجراها Binder وآخرون ، والتي تم فيها زرع خلايا RPE ذاتية الحصاد الطازجة في المرضى الذين يعانون من nAMD8و9و10، تحسنا بصريا معتدلا ، ولكن مجموعة صغيرة فقط من المرضى وصلوا إلى حدة بصرية نهائية عالية بما يكفي لتمكين القراءة. في الآونة الأخيرة، استخدمت دراسة سريرية المرحلة الأولى التصحيح RPE المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية لعلاج AMD مع نتائج واعدة. أي فعالية واستقرار وسلامة تصحيح RPE لمدة تصل إلى 12 شهرا في 2 من المرضى العشرة الذين عولجوا11. بالإضافة إلى ذلك، نشرت عدة مجموعات دراسات تم فيها حصاد بقع الغشاء المشيمي الذاتية RPE-Bruch من شبكية العين الطرفية وزرعها في البقعة12و13و14؛ والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المستمدة من بقع RPE تم إنشاؤها لزرع15. بالنسبة ل aAMD ، تم اختبار الأجسام المضادة التي تستهدف المسار التكميلي في التجارب السريرية6و16 ودراسة المرحلة الأولى باستخدام حقنة واحدة داخل الجسم لنواقل فيروسية مرتبطة بالأدينو (AAV) ترميز الجين لعامل CD59 (AAVCAGsCD59) في المرضى الذين يعانون من ضمور جغرافي (GA) تم الانتهاءمن 17؛ بدأت دراسة المرحلة الثانية مؤخرا وتهدف إلى توظيف 132 مريضا يعانون من AAMD المتقدمة وتقييم النتيجة في 2 سنوات بعد التدخل18. وأخيرا، بدأت مجموعة دراسة فوكوس المرحلة الأولى / الثانية تجربة سريرية متعددة المراكز تقييم سلامة واستجابة الجرعة وفعالية ناقلات AAV غير المستنسخة المؤتلف ترميز عامل مكمل الإنسان19.
في المقام الأول ، فإن الهدف من العلاج AMD التجديدي هو زرع خلايا RPE الوظيفية ، والتي تضررت أو فقدت. ومع ذلك، تشترك خلايا IPE و RPE في العديد من أوجه التشابه الوظيفية والوراثية (على سبيل المثال، البلعوس واستقلاب الريتينول)، ولأن خلايا IPE يتم حصادها بشكل أكثر جدوى، فقد تم اقتراحها كبديل RPE20. على الرغم من أنه قد ثبت سابقا أن زرع الخلية IPE يؤخر انحطاط مستقبلات ضوئية في النماذج الحيوانية21،22 ويستقر الوظيفة البصرية في المرضى الذين يعانون من nvAMD المرحلة النهائية ، لم يلاحظ أي تحسن كبير في هؤلاء المرضى23. قد يكون عدم فعالية بسبب انخفاض عدد الخلايا المزروعة، و / أو عدم توازن العوامل العصبية الوقائية الشبكية. وثمة نهج بديل هو زرع الخلايا الظهارية الصباغية المصابة التي تفرط في التعبير عن العوامل العصبية لاستعادة التوازن الشبكي، والحفاظ على خلايا RPE المتبقية، وحماية المستقبلات الضوئية وRGCs من الانحطاط. وبالتالي، نقترح علاجا جديدا يتضمن زرع خلايا RPE أو IPE الوظيفية التي خضعت للهندسة الوراثية لإفراز البروتينات العصبية المضادة للأعائيات، مثل PEDF أو GM-CSF أو عوامل النمو الشبيهة بالإنسولين (IGFs). ميزة تطوير وتحليل هذا النهج في عدة أنواع بدلا من استخدام خط الخلية، نوع واحد فقط، أو الأنسجة البشرية هي: 1) زيادة استنساخ ونقل النتائج كما هو مبين في العديد من الدراسات التي تحققت في مختبرات مستقلة والأنواع المختلفة1،24،25؛ 2) خلايا الخنازير أو الأبقار هي عمليا المتاح دون التضحية من الحيوانات إضافية؛ 3) توافر خلايا الخنازير والأبقار خاصة يسمح سلسلة اختبار كبيرة لتحقيق نتائج قوية؛ 4) المعرفة لعزل وزراعة وتعديل وراثيا الخلايا من النماذج المستخدمة في الغالب تمكن في تحليلات الجسم الحي في أنواع متعددة24،25،26 ، وبالتالي يقدم نسبة محسنة من المخاطر إلى الفائدة للمرضى الذين عولجوا لأول مرة ؛ 5) مرونة البروتوكول المقدم يسمح استخدامه في مختلف النماذج والتجريبية انشاءات وجميع العلاجات القائمة على الخلايا العينية مع وبدون الهندسة الوراثية. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقنيات البديلة كخطوط خلايا أو أنسجة بشرية ليست سوى قدرة محدودة على النقل و/أو قابلية محدودة للتخلص منها. خطوط الخلية مثل ARPE-19 مثالية للتجارب الأولية. ومع ذلك، تصبغ منخفض وانتشار عالية تختلف اختلافا كبيرا عن الخلايا الأولية1. وتوفر خلايا RPE و IPE، المعزولة عن الأنسجة المانحة البشرية، مصدرا ثمينا للتجارب المختبرية القابلة للتحويل؛ ومع ذلك، نحصل على الأنسجة البشرية من بنك العيون الأمريكي الأمريكي مما يعني أن عمر الأنسجة لا يقل عن يومين (بعد التلقيح) ويتطلب نقلا طويلا ومكلفا، ولكن الأنسجة المانحة المحلية غير متوفرة بكميات كافية لإجراء بحث منتج. يتم تأكيد ميزة استخدام الخلايا الأولية من خلال دراسات متعددة من مجموعات أخرى27،28.
لتطوير العلاج الجيني غير الفيروسي القائم على الخلية باستخدام نظام SB100X transposon لتجريب الخلايا الأولية RPE و IPE مع ترميز الجينات لPEDF و / أو GM-CSF لعلاج nvAMD وamD ، على التوالي29،30،31،32، أنشأنا لأول مرة العدوى من خلايا ARPE-191 . وبعد ذلك، تم وضع بروتوكولات العزل والإصابة في الخلايا الأولية للأبقار والبورسين التي يمكن الوصول إليها بسهولة. الآن، تم إنشاء عزل وتوريث خلايا RPE و IPE الأولية من خمسة أنواع مختلفة، من الصغيرة (كفأر) إلى الثدييات الكبيرة (كالماشية). تم تأكيد ذلك في خلايا RPE و IPE الأولية المشتقة من عيون المتبرعين البشريين30. تم التحقق من صحة الإنتاج المتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) من ATMP باستخدام الأنسجة المانحة البشرية وكذلك33. وأخيرا، تم تقييم سلامة وكفاءة النهج في الجسم الحي في ثلاثة أنواع مختلفة تم تكييف البروتوكول لها: الفأر والفأر والأرنب. في الإعداد السريري ، سيتم حصاد خزعة القزحية من المريض وسيتم عزل خلايا IPE وترجمتها في الغرفة النظيفة ، قبل أن يتم زرع الخلايا دون المستوى مرة أخرى إلى نفس المريض. وستجري العملية بأكملها خلال جلسة جراحية واحدة تستغرق حوالي 60 دقيقة. تطلب تطوير نهج العلاج وتقييم كفاءته نماذج ممتازة في المختبر وفيفو السابق لتنفيذ طرق توصيل الجينات القوية والفعالة ، لتحليل كفاءة تسليم الجينات وإنتاج البروتين العلاجي والآثار العصبية ، وإنتاج عمليات زرع الخلايا لاختبار النهج في الجسم الحي1،24،25،29،30 . ومن الجدير بالذكر أن العلاج لديه الموافقة الأخلاقية على تجربة المرحلة السريرية Ib/IIa من اللجنة الأخلاقية لأبحاث كانتون جنيف (رقم 2019-00250) ويتم حاليا جمع آخر بيانات ما قبل السريرية المطلوبة للحصول على إذن من السلطات التنظيمية السويسرية باستخدام البروتوكول المقدم. في هذا الصدد، أظهرت بيانات ما قبل السريرية في الجسم الحي انخفاضا كبيرا في CNV وسلامة ممتازة24،25،31.
هنا ، يتم وصف عزل وثقافة خلايا RPE / IPE من الأبقار والخنازير والأرنب والفأر والفأر ، واستخدام نظام الإرسال والاستقبال SB100X التكاملي جنبا إلى جنب مع الكهربوجين كوسيلة فعالة لتسليم الجينات. وعلى وجه الخصوص، تم تحويل خلايا PE الأولية إلى فرط التعبير عن PEDF و GM-CSF. جمع هذه البروتوكولات تمكن من إجراء الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي في جميع مراحل ما قبل السريرية من تطوير ATMP. وعلاوة على ذلك، فإن الإعداد لديه القدرة على التكيف مع الجينات الأخرى ذات الاهتمام والأمراض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو السبب الأكثر شيوعا للعمى لدى المرضى >60 عاما ، مما يؤثر على ~ 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. AMD هو مرض متعدد العوامل يتأثر بالعوامل البيئية والجينية ، مما يؤدي إلى ضعف وظيفي في شبكية العين بسبب انحطاط الخلايا الظهارية صبغة الشبكية (RPE) يليه تدهور المستقبل الضوئي. ومن شأن العلاج المثالي أن تشمل زرع خلايا RPE صحية تفرز العوامل العصبية لمنع موت الخلية RPE وانحطاط مستقبلات ضوئية. نظرا لأوجه التشابه الوظيفية والوراثية وإمكانية أخذ خزعة أقل توغلا ، تم اقتراح زرع خلايا ظهارية صبغة القزحية (IPE) كبديل ل RPE المنحطة. يمكن تحقيق إفراز العوامل العصبية الوقائية من خلال عدد قليل من الخلايا المزروعة تحت الشبكية عن طريق الجمال النائم (SB100X)transposon بوساطة transfection مع ترميز الجينات لعامل الظهارة المشتق من الصباغ (PEDF) و / أو عامل تحفيز مستعمرة الضامة الحبيبية (GM-CSF). أنشأنا العزلة والثقافة، وSB100X-بوساطة transfection من خلايا RPE و IPE من مختلف الأنواع بما في ذلك القوارض والخنازير والماشية. يتم استئصال الكرة الأرضية وإزالة القرنية والعدسة للوصول إلى القزحية والشبكية. باستخدام ملعقة مصنوعة خصيصا، تتم إزالة خلايا IPE من القزحية المعزولة. لحصاد خلايا RPE، قد تكون هناك حاجة إلى حضانة التريبسين، اعتمادا على الأنواع. ثم، باستخدام ملعقة مخصصة RPE، يتم تعليق الخلايا في المتوسط. بعد البذر ، يتم مراقبة الخلايا مرتين في الأسبوع ، وبعد الوصول إلى التقاء ، يتم تحويلها عن طريق الكهرومporation. تم تأكيد التكامل الجيني والتعبير وإفراز البروتين والوظيفة من قبل qPCR وWB و ELISA و immunofluorescence والمقايسات الوظيفية. اعتمادا على هذا النوع، يمكن عزل 30،000-5 مليون (RPE) و 10،000-1.5 مليون (IPE) الخلايا لكل عين. تظهر الخلايا المعدلة وراثيا فرط التعبير الكبير PEDF/GM-CSF مع القدرة على تقليل الإجهاد التأكسدي وتوفر نظاما مرنا لتحليلات الجسم الحي السابق وفي دراسات الجسم الحي القابلة للنقل إلى البشر لتطوير نهج العلاج الجيني البصري.

عزل PE من أنواع الثدييات المختلفة وباستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، تم بنجاح عزل خلايا IPE وRPE واستزراعها من خمسة أنواع مختلفة. يعتمد عدد الخلايا التي يتم الحصول عليها من كل إجراء على نوع العين وحجمها (الجدول 1). كما هو مبين في الشكل 1، تظهر الخلايا مور...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

هنا، يتم تقديم بروتوكول لعزل وترانسفيكت القزحية الأولية والخلايا الظهارية صبغة الشبكية من الثدييات المختلفة (الفئران والجرذ والأرنب والخنازير والأبقار). هذه الطريقة مناسبة بشكل مثالي لدراسة نهج العلاج الجيني البصري في مختلف ال تشكيلات لتحليلات الجسم الحي السابق وفي دراسات الجسم الحي القابلة للنقل إلى البشر.

العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

البروتوكول مهم لأنه يظهر عزلة واختزال الخلايا الظهارية الصباغية من خمسة ثدييات كنظام مثالي لدراسة العلاج الجيني البصري في مختلف الاجهزة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي مرونتها وقابليتها للنقل وارتفاع غلة الخلية وقابليتها للحياة ومعدل العدوى بسبب الأنواع الخمسة ونظام الإرسال والاستقبال SB100X غير الفيروسي المستخدم. وقد تم تطوير هذه التقنيات لدراسة نهج العلاج الجيني التي تستهدف الشبكية والقزحية الصباغ الظهاري، والتي هي معزولة ومصابة في البروتوكول الحالي، ولكن قابلة للاستخدام لأي أبحاث العين.إثبات الإجراء سيكون جريج سيلي، فني من المختبر. بعد القتل الرحيم للحيوان، استخدم مقص منحني وملقط Colibri لتعميم العينين، ثم تنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين. جمع العينين في أنبوب 50 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني غير معقم ونقل الأنبوب إلى غطاء محرك السيارة تدفق صفح.تطهيرها عن طريق الغمر في محلول اليود القائم لمدة دقيقتين، ثم نقل العينين إلى أنبوب 50 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني معقمة. ضع عين واحدة على ضغط شاش معقم واحمل العين بقوة بالقرب من العصب البصري. ثم قطع بالقرب من الحد الأقصى للقزحية مع عدد 11 مشرط.باستخدام مقص، وقطع حول القزحية وإزالة الجزء الأمامي ووضعها في طبق بيتري، وترك لمبة مع الزجاجي حتى يتم عزل الظهارية صبغة الشبكية، أو خلايا RPE. لعزل الظهارية صبغة القزحية، أو خلايا IPE، وإزالة العدسة مع ملقط غرامة وسحب بدقة القزحية التي تحتوي على خلايا IPE. ضع القزحية في طبق بيتري واغسلها مع برنامج تلفزيوني معقم.إضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. إزالة التريبسين، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة كاملة، وكشط IPE بدقة مع شقة، مصقول النار باستور ماصة. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر.عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور، والبذور 0.2 مليون خلية لكل بئر في لوحة بئر 24 مع ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة. ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لعزل خلايا RPE، قم بإزالة الفكاهة الزجاجية وشبكية العين من الجزء الخلفي مع ملقط رقيق.وضع المصابيح في لوحة بئر 24 وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل عين واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. إزالة التريبسين، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة كاملة في العالم وكشط خلايا RPE بدقة مع ماصة باستور منحنية، مصقول النار. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر.عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور وبذور الخلايا كما هو موضح سابقا. ضع الصحن في الحاضنة. تنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين وتطهير العينين في محلول اليود القائم وشطفها مع برنامج تلفزيوني.لعزل خلايا IPE، قم بإزالة العدسة وسحب القزحية كما هو موضح سابقا. بعد إعداد اثنين من القزحيات، إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة وعزل الخلايا عن طريق الخدش مع شقة، ماصة باستور مصقول النار، ثم عد والبذور الخلايا. ضع الصحن في الحاضنة.لعزل خلايا RPE، قم بإزالة الزجاجية والشبكية من الجزء الخلفي ووضع المصباح في طبق بيتري. ملء المصباح مع وسيطة كاملة ملليلتر واحد. باستخدام ماصة باستور منحنية ومصقولة بالنار ، قم بإزالة خلايا RPE.جمع تعليق الخلية داخل لمبة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لإعادة الإنفاق. ثم عد الخلايا وبذور واحتضان لوحة كما هو موضح سابقا. بعد التنظيف، افتح العين وقطع حول القزحية لإزالة الجزء الأمامي، ثم وضع في طبق بيتري.اترك المصباح مع الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE. لعزل خلايا IPE ، إذا كانت العدسة تأتي مع الجزء الأمامي ، قم بإزالة العدسة واستخدم ملقط ناعم لسحب القزحية التي تحتوي على خلايا IPE بدقة. ضع القزحية في طبق بيتري واغسلها مع برنامج تلفزيوني معقم.قطع الجسم السيلاري مع مشرط رقم 10. بعد إعداد القزحية، واحتضانها مع اثنين من ملليلتر من 0.25٪ تريبسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة التريبسين وإضافة اثنين من ملليلتر من المتوسطة كاملة، ثم عزل الخلايا عن طريق الخدش مع شقة، ماصة باستور مصقول النار.نقل تعليق الخلية إلى أنبوب ملليلتر اثنين والطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 120 مرة G.Discard الناطقة وإعادة إنفاق الخلايا في اثنين من ملليلتر من المتوسطة كاملة. البذور 0.32 مليون خلية لكل بئر في لوحة بئر ستة في ثلاثة ملليلتر من المتوسطة كاملة. ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.لعزل خلايا RPE، قم بإزالة الفكاهة الزجاجية وشبكية العين من الجزء الخلفي باستخدام ملقط. تجنب إتلاف ظهارة صبغة الشبكية. غسل المصباح مع برنامج تلفزيوني.بعد إعداد كلتا العينين، وملء لمبة حوالي ثلاثة أرباع كامل مع تريبسين، واحتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية مع غطاء طبق بيتري على رأس العين لمبة. إزالة التريبسين وإضافة ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة. باستخدام ماصة باستور منحنية ومصقولة بالنار ، قم بإزالة خلايا RPE.جمع تعليق الخلية داخل لمبة ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لإعادة الإنفاق. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 120 مرة G.Seed 0.32 مليون خلية لكل بئر في لوحة بئر ستة في ثلاثة ملليلتر من المتوسطة كاملة. ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة رطبة. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، ماصة صعودا وهبوطا لجمع الخلايا غير المضاد ووضع نصف حجم في بئر آخر. ملء البئر إلى ملليلتر واحد مع وسيطة كاملة.بعد ثلاثة إلى أربعة أيام أخرى، كرر مجموعة الخلايا، وهذه المرة تجميع الخلايا غير المضاد من بئرين في واحد. إضافة متوسطة إلى جميع الآبار. مراقبة الخلايا وتغيير المتوسط مرتين في الأسبوع.عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بالتبديل إلى وسيط كامل مع 1٪FBS. وباستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، تم بنجاح عزل خلايا IPE وRPE واستزراعها من خمسة أنواع مختلفة. تم تأكيد نمط التعبير RPE في خلايا IPE البقرية الأولية عن طريق الفلورة المناعية ل RPE65.تمت دراسة صلاحية الخلية لاستبعاد سمية محتملة لحاجز الكهربوهات باستخدام مجموعة فحص السمية الخلوية المتاحة تجاريا والتحكم بالكهرباء بعقدة. ولم يلاحظ أي أثر على صلاحية الخلية. تم تحويل الخلايا الظهارية الصباغية المستبقة من أنواع مختلفة مع بروتين الزهرة الفلوري الأصفر.تم استخدام خلايا RPE19 المصابة كعنصر تحكم إيجابي. يظهر هنا التحديد الكمي لكفاءة العدوى في RPE الخنزير المستثناة مسبقا. تم تحويل الخلايا الظهارية الصباغية المعزولة حديثا بالبروتين الفلوري الأصفر فينوس وتم رصدها عن طريق المجهر.تم تحويل الخلايا الظهارية الصباغية مع عامل مشتق من الظهارة الصباغية وتم رصد إفراز البروتين بواسطة لطخة غربية. وكانت الإشارة للخلايا المصابة أعلى مقارنة بالخلايا غير المصابة لجميع الأنواع والأيام التي تمت دراستها، ولم يلاحظ أي انخفاض في إفراز البروتين في غضون هذا الوقت. من المهم تجنب كشط الخلايا بأدوات حادة.هنا، وتستخدم ماصة باستور مصقول النار، إلا في عيون الماوس الصغيرة، حيث يجب استخدام مشرط جولة. يمكن استخدام الخلايا الظهارية الصباغية لتطوير نهج العلاج الجيني ومحاكاة الحالات المرضية ، على سبيل المثال ، تلف الإجهاد التأكسدي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه النماذج لاختبار الأدوية العلاجية.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...