Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
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感谢Gregg Sealy和Alain Conti的出色技术援助。这项工作得到了欧盟委员会在第七框架计划，瑞士国家科学基金会和Schmieder-Bohrisch基金会的背景下的支持。Z.I.获得了欧洲研究委员会，ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742]和B.M.W.的资助，获得了富布赖特研究资助和瑞士政府卓越奖学金。

涉及动物的协议由经过认证的人员执行，并经瑞士日内瓦州安全，安全和健康省（DSES），Domaine de l'expérimentation animale授权，并根据ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明（批准号：GE/94/17）。成年健康的布朗挪威大鼠，C57BL / 6小鼠和新西兰白兔通过过量的戊巴比妥（150mg / kg）稀释在0.9%NaCl腹腔内注射安乐死，并在牺牲后立即对眼睛进行去核。猪眼和牛眼在牺牲后6小时内从当地屠宰场获得，?...

拥有分离和培养PE细胞的标准化方法是开发视网膜退行性疾病新治疗方法的基础。通过这里提出的方案，PE细胞可以从不同物种中成功分离并长期培养（到目前为止，最长的培养物维持了2年1，38）;观察到典型的PE细胞形态、色素沉着和功能（图1、图2）。请注意，特别是对于纯RPE培养物，重要的是完全提取视?...

我们小组正专注于开发再生方法，通过基于RPE和IPE的非病毒基因疗法来治疗神经视网膜变性，即AMD。这种疗法的临床前建立需要可移植给人类的 体外 模型。因此，这里介绍的研究目标是为原代RPE和IPE细胞的分离，培养和基因工程提供方案。建立从多个物种中分离PE细胞的基本原理是有力地确认该方法的安全性和有效性，并提高其可重复性和可转移性。可用的人RPE细胞系ARPE-19与原代细胞不同（例如，它们的色素较少），因此对于临床前分析的价值有限1。此外，非人类哺乳动物细胞可以以更低的成本和更大的数量购买;人类供体组织可以从各种眼库获得，但可用性有限且昂贵。最后，新的高级治疗药物产品（ATMP，即细胞，组织或基因治疗药物产品）需要在患者中测试之前至少应用于两种不同的物种，并且这些 体内 研究要求制备同种异体细胞移植。
视网膜神经退行性疾病是工业化国家失明的主要原因，包括AMD等常见疾病，以及视网膜色素变性等罕见疾病，其中视网膜细胞死亡最终导致失明。在某些情况下，RPE细胞，光感受器和视网膜神经节细胞（RGC）损伤可以减慢，但目前没有治愈性疗法可用。ATMPs具有纠正基因缺陷，整合治疗基因或替代退化细胞的潜力，从而能够开发针对AMD等疾病的再生和治愈疗法;13种基因疗法已经获得上市批准，包括治疗RPE65突变相关视网膜变性的疗法2，3。在老年人（>60岁）中，全世界约有3000万人受到新生血管（nvAMD）或无血管（aAMD）AMD4的影响。这两种形式都是由年龄相关的触发因素诱导的，包括氧化损伤，功能障碍和RPE细胞的丧失，然后是光感受器降解，除其他外（例如遗传风险等位基因，吸烟，高血压）5，6。在 nvAMD 中，血管生成和抗血管生成因子的不平衡会加重发病机制，而血管生成血管内皮生长因子 （VEGF） 可诱导脉络膜新生血管形成 （CNV）。迄今为止，只有nvAMD可以通过每月玻璃体内注射VEGF蛋白抑制剂来抑制CNV来治疗;尚无有效的治疗方法可用于aAMD6，7。
几项研究评估了基于细胞的疗法来取代抗VEGF疗法：Binder等人进行的研究表明，新鲜收获的自体RPE细胞被移植到nAMD8，9，10的患者中，显示出适度的视力改善，但只有一小部分患者达到了最终的视力，足以使阅读成为可能。最近，一项I期临床研究使用胚胎干细胞衍生的RPE贴片治疗AMD，结果很有希望;即，在接受治疗的 10 名患者中，有 2 名患者的 RPE 贴片疗效、稳定性和安全性长达12 个月 11。此外，一些小组已经发表了一些研究，其中自体RPE-Bruch的膜脉络膜贴片从外周视网膜中收获并移植到黄斑12，13，14;并生成诱导多能干细胞（iPSC）衍生的RPE贴片用于移植15。对于aAMD，靶向补体途径的抗体已经在临床试验6，16中进行了测试，并且使用单次玻璃体内注射腺相关病毒（AAV）载体的I期研究，编码地理萎缩（GA）患者中CD59因子（AAVCAGsCD59）的基因17;II期研究最近开始，旨在招募132名晚期aAMD患者，并在干预后2年评估结果18。最后，FocuS研究小组已开始进行I / II期多中心临床试验，评估编码人补体因子19的重组非复制AAV载体的安全性，剂量反应和有效性。
首先，再生AMD治疗的目标是移植功能性RPE细胞，这些细胞受损或丢失。然而，IPE和RPE细胞具有许多功能和遗传相似性（例如，吞噬作用和视黄醇代谢），并且由于IPE细胞更可行，因此它们已被提议作为RPE替代品20。尽管先前已经证明IPE细胞移植延迟了动物模型21，22中的光感受器变性并稳定了终末期nvAMD患者的视觉功能，但这些患者23没有观察到显着改善。缺乏疗效可能是由于移植细胞数量少和/或神经保护性视网膜因子失衡。另一种方法是移植转染的色素上皮细胞，这些细胞过度表达神经保护因子以恢复视网膜稳态，维持剩余的RPE细胞，并保护光感受器和RGC免受变性。因此，我们提出了一种新疗法，包括移植经过基因工程的功能性RPE或IPE细胞，以分泌神经保护和抗血管生成蛋白，如PEDF，GM-CSF或胰岛素样生长因子（IGF）。在多个物种中开发和分析这种方法的优点是，而不是使用一个细胞系，仅一个物种或人体组织：1）增加结果的可重复性和可转移性，如在独立实验室和不同物种中实现的许多研究所证明的那样1，24，25;2）猪或牛的细胞是可行的一次性的，无需牺牲额外的动物;3）特别是猪和牛细胞的可用性允许大型测试系列产生可靠的结果;4）从最常用的模型中分离，培养和遗传修饰细胞的知识使得能够在多个物种24，25，26中进行体内分析，从而为第一批接受治疗的患者提供更高的风险 - 收益比;5）所提出的方案的灵活性允许其用于各种模型和实验设置以及所有基于眼细胞的治疗，有和没有基因工程。相反，细胞系或人体组织等替代技术仅具有有限的可转移性和/或有限的可处置性。ARPE-19等细胞系是初步实验的理想选择。然而，低色素沉着和高增殖与原代细胞1显着不同。从人类供体组织中分离的RPE和IPE细胞为可移植的体外实验提供了宝贵的来源;然而，我们从美国眼库获得人体组织，这意味着该组织至少有两天大（去核后），需要漫长而昂贵的运输，但当地供体组织没有足够的量进行生产性研究。使用原代细胞的优势被来自其他组的多项研究证实，27，28。
为了开发一种基于细胞的非病毒基因疗法，使用SB100X转座子系统转染原代RPE和IPE细胞，这些细胞的基因编码为PEDF和/或GM-CSF，分别用于治疗nvAMD和aAMD，分别为29，30，31，32，我们首先建立了ARPE-19细胞的转染1.接下来，在易于接近的牛和猪原代细胞中建立了分离和转染方案。现在，已经建立了来自五个不同物种的原代RPE和IPE细胞的分离和转染，从小型（如小鼠）到大型哺乳动物（如牛）。在源自人类供体眼睛的原代RPE和IPE细胞中得到证实30。符合良好生产规范（GMP）的ATMP生产也使用人类供体组织进行了验证33。最后，在体内评估了该方法在三种不同物种中的有效性，这些物种已经适应了该协议：小鼠，大鼠和兔子。在临床设置中，将从患者身上采集虹膜活检，IPE细胞将在洁净室中分离和转染，然后将细胞网膜下移植回同一患者体内。整个过程将在持续约60分钟的单次手术过程中进行。治疗方法的开发和对其效率的评估要求优秀的体外和离体模型来实现稳健有效的基因递送方法，分析基因递送效率，治疗性蛋白质产生和神经保护作用，并产生细胞移植以在体内测试该方法1，24，25，29，30 .值得一提的是，该疗法已获得日内瓦州研究伦理委员会（编号：2019-00250）对临床Ib / IIa期试验的伦理批准，目前瑞士监管机构要求授权的最后临床前数据是使用所提出的协议收集的。在这方面，临床前体内数据显示CNV显著降低，安全性优良24、25、31。
本文介绍了从牛、猪、兔、大鼠和小鼠中分离和培养RPE/IPE细胞，以及使用整合 SB100X 转座子系统与电穿孔相结合作为有效的基因递送方法。特别是，转染原代PE细胞以过表达PEDF和GM-CSF。这些方案的收集使得 体外 和 体内 研究能够在ATMP开发的所有临床前阶段进行。此外，该设置有可能适应其他感兴趣的基因和疾病。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

年龄相关性黄斑变性（AMD）是60>患者失明的最常见原因，影响全球约3000万人。AMD 是一种受环境和遗传因素影响的多因素疾病，由于视网膜色素上皮 （RPE） 细胞变性，随后出现感光器降解，导致视网膜功能受损。理想的治疗方法包括移植分泌神经保护因子的健康RPE细胞，以防止RPE细胞死亡和光感受器变性。由于功能和遗传相似性以及侵入性较小的活检的可能性，建议移植虹膜色素上皮（IPE）细胞作为退化RPE的替代品。通过睡美人（SB100X）转座子介导的转染，可以实现低数量的视网膜下移植细胞分泌神经保护因子，这些转染体的基因编码色素上皮衍生因子（PEDF）和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。我们建立了来自各种物种（包括啮齿动物，猪和牛）的RPE和IPE细胞的分离，培养和SB100X介导的转染。球体被外植，角膜和晶状体被移除以进入虹膜和视网膜。使用定制的刮刀，从分离的虹膜中取出IPE细胞。为了收获RPE细胞，可能需要胰蛋白酶孵育，具体取决于物种。然后，使用RPE定制的刮刀，将细胞悬浮在培养基中。接种后，每周监测细胞两次，并在达到汇合点后，通过电穿孔转染。通过qPCR、WB、ELISA、免疫荧光和功能测定证实了基因整合、表达、蛋白分泌和功能检测。根据物种的不同，每只眼睛可以分离出30，000-500万（RPE）和10，000-150万（IPE）细胞。基因修饰细胞显示出显着的PEDF / GM-CSF过表达，具有降低氧化应激的能力，并为离体分析和可转移到人类的体内研究提供了灵活的系统，以开发眼部基因治疗方法。

从不同哺乳动物物种中分离PE 使用上述方案，IPE和RPE细胞成功从五种不同物种中分离和培养。从每个程序中获得的细胞数量取决于眼睛的种类和大小（表1）。如图 1所示，细胞显示出典型的PE细胞形态和色素沉着（除了显示的兔细胞，来自新西兰白化（NZW）兔）。在分离后21天，细胞汇合，准备用于进一步的实验（例如，转染）。必须注意的是，?...

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Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

在这里，提出了一种从各种哺乳动物（小鼠，大鼠，兔子，猪和牛）中分离和转染原代虹膜和视网膜色素上皮细胞的方案。该方法非常适合在各种设置中研究眼部基因治疗方法，以进行离体分析和可转移到人类的体内研究。

哺乳动物原色素上皮细胞的分离、培养和基因工程用于非病毒基因治疗

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

该协议具有重要意义，因为它显示了来自五种哺乳动物的色素上皮细胞的分离和转染，作为在各种设置中研究眼部基因治疗的最佳系统。该方法的主要优点是其灵活性，可转移性，高细胞产量，活力和转染率，由于使用了五种物种和非病毒SB100X转座子系统。这些技术已被开发用于研究靶向视网膜和虹膜色素上皮细胞的基因治疗方法，这些细胞在本方案中被分离和转染，但可用于任何眼部研究。演示该程序的将是实验室的技术人员Gregg Sealy。对动物实施安乐死后，使用弯曲的剪刀和Colibri镊子对眼睛进行去核，然后从眼睛上清洁剩余的肌肉组织和皮肤。将眼睛收集在充满非无菌PBS的50毫升管中，并将管转移到层流罩中。将它们浸没在碘基溶液中两分钟，然后将眼睛转移到充满无菌PBS的50毫升管中。将一只眼睛放在无菌纱布上，并牢牢地将眼睛靠近视神经。然后用11号手术刀切近虹膜的极限。使用剪刀，在虹膜周围切割并取出前段并将其放入培养皿中，将球茎与玻璃体一起留下，直到分离出视网膜色素上皮或RPE细胞。要分离虹膜色素上皮或IPE细胞，请用细镊子取出晶状体，并小心地拉出含有IPE细胞的虹膜。将虹膜放入培养皿中，用无菌PBS清洗。加入500微升0.25%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育10分钟。除去胰蛋白酶，加入500微升完整培养基，然后用扁平的、经过火抛光的巴斯德移液器精细地刮擦IPE。收集细胞悬浮液并将其放入1.5毫升管中。使用Neubauer室计数细胞，并将每孔0.2百万个细胞接种在具有1毫升完整培养基的24孔板中。将板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳下培养。为了分离RPE细胞，用薄镊子从后段取出玻璃体和视网膜。将球茎放入24孔板中，每只眼睛加入500微升0.25%胰蛋白酶，并在37摄氏度下孵育10分钟。除去胰蛋白酶，每球加入500微升完整培养基，并用弯曲的、经过火抛光的巴斯德移液管精细地刮擦RPE细胞。收集细胞悬浮液并将其放入1.5毫升管中。使用Neubauer室计数细胞并如前所述接种细胞。将板放入培养箱中。清洁眼睛上剩余的肌肉组织和皮肤，用碘基溶液对眼睛进行消毒，并用PBS冲洗。要分离IPE细胞，请取下晶状体并拉出虹膜，如前所述。制备两个鸢尾花后，加入一毫升完整培养基，并通过用扁平的，经过火抛光的巴斯德移液管刮擦来分离细胞，然后计数并接种细胞。将板放入培养箱中。要分离RPE细胞，请从后段取出玻璃体和视网膜，并将球茎置于培养皿中。用一毫升完整的培养基填充灯泡。使用弯曲的、经过火抛光的巴斯德移液器，去除RPE细胞。使用1， 000微升移液管收集灯泡内的细胞悬浮液，并将其转移到1.5毫升管中进行重悬。然后计数并接种细胞并孵育板，如前所述。清洁后，睁开眼睛，在虹膜周围切开以去除前节，然后放入培养皿中。将球茎与玻璃体一起放置，直到分离出RPE细胞。为了分离IPE细胞，如果晶状体带有前段，请取下晶状体并使用细镊子小心地拉出含有IPE细胞的虹膜。将虹膜放入培养皿中，用无菌PBS清洗。用10号手术刀切开睫状体。准备鸢尾花后，用两毫升0.25%胰蛋白酶在37摄氏度下孵育10分钟。除去胰蛋白酶并加入两毫升完整培养基，然后用扁平的，经过火抛光的巴斯德移液器刮擦分离细胞。将细胞悬浮液转移到两毫升管中，并以120倍G离心细胞10分钟，弃去上清液并将细胞重悬于两毫升完全培养基中。将每孔0.32万个细胞接种在三毫升完整培养基的六孔板中。将板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳下培养。为了分离RPE细胞，用镊子从后段取出玻璃体和视网膜。避免损害视网膜色素上皮。用PBS清洗灯泡。准备双眼后，用胰蛋白酶填充大约四分之三的灯泡，并在37摄氏度下孵育25分钟，将培养皿盖放在灯泡眼的顶部。除去胰蛋白酶并加入一毫升完整培养基。使用弯曲的、经过火抛光的巴斯德移液器，去除RPE细胞。收集球内的细胞悬浮液并将其转移到1.5毫升的管中进行重悬。将细胞以120倍G.Seed 0.32百万个细胞在三毫升完全培养基中的六孔板中离心10分钟。将板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳下培养。在加湿的培养箱中以37摄氏度和5%二氧化碳培养细胞。三到四天后，上下移液以收集不粘附的细胞，并将一半体积放入另一个孔中。用完整的培养基将孔填充到一毫升。再过三到四天后，重复细胞收集，这次将两个孔中的非粘附细胞合并为一个。向所有孔中加入培养基。观察细胞并每周更换两次培养基。当细胞达到汇合时，切换到具有1%FBS的完整培养基。使用上述方案，IPE和RPE细胞成功从五种不同物种中分离和培养。通过RPE65的免疫荧光在原代牛IPE细胞中证实了RPE表达模式。使用市售的细胞毒性测定试剂盒和结电穿孔对照研究细胞活力以排除电穿孔缓冲液的潜在毒性。未观察到对细胞活力的影响。来自不同物种的预培养色素上皮细胞用黄色荧光金星蛋白转染。转染的RPE19细胞被用作阳性对照。此处显示了预培养猪RPE中转染效率的量化。新鲜分离的兔色素上皮细胞用黄色荧光蛋白Venus转染，并通过显微镜监测。用色素上皮衍生因子转染色素上皮细胞，并通过蛋白质印迹监测蛋白质分泌。与所有物种和研究天数的转染细胞相比，转染细胞的信号更高，并且在这段时间内没有观察到蛋白质分泌的减少。至关重要的是要避免用锋利的工具刮擦细胞。在这里，使用火抛光的巴斯德移液器，除了小老鼠的眼睛，其中必须使用圆形手术刀。色素上皮细胞可用于开发基因治疗方法和模拟病理状况，例如氧化应激损伤。这些模型也可用于测试治疗药物。

Research

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