Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

En tak fortjener gregg Sealy og Alain Conti for deres fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af Europa-Kommissionen inden for rammerne af det syvende rammeprogram, Swiss National Sciences Foundation og Schmieder-Bohrisch Foundation. Z.I. modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] og B.M.W. fra et Fulbright Research Grant og Swiss Government Excellence Scholarship.

De protokoller, hvori dyrene var involveret, blev udført af certificeret personale og efter tilladelse fra det kantonale departement de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale i Genève, Schweiz, og i henhold til ARVO-erklæringen om anvendelse af dyr i oftalmisk og visionsforskning (godkendelse nr. GE/94/17). Voksne sunde Brown Norway rotter, C57BL/6 mus, og New Zealand hvide kaniner blev aflivet af en overdosis af Pentobarbital (150 mg/kg) fortyndet i 0,9% NaCl injicere...

Under standardiserede metoder til at isolere og kultur PE celler er afgørende i udviklingen af nye behandlingsmetoder for retinale degenerative sygdomme. Med de protokoller, der præsenteres her, kan PE-celler med succes isoleres fra forskellige arter og dyrkes i lange perioder (indtil nu blev den længste kultur opretholdt i 2 år1,38); typisk PE-cellemorfologi, pigmentering og funktion blev observeret (Figur 1, <strong class="xfig...

Vores gruppe fokuserer på udvikling af regenerative tilgange til behandling af neuroretinal degeneration, dvs. AMD, ved RPE- og IPE-baseret ikke-viral genterapi. Den prækliniske etablering af sådanne behandlinger kræver in vitro-modeller, der kan overføres til mennesker. Således er målet med undersøgelsen præsenteret her at levere protokoller for isolering, kultur og genteknologi af primære RPE- og IPE-celler. Begrundelsen for at etablere isolering af PE-celler fra flere arter er at bekræfte tilgangens sikkerhed og effektivitet og øge dens reproducerbarhed og overførbarhed. Den tilgængelige menneskelige RPE-cellelinje ARPE-19 adskiller sig fra primære celler (f.eks. er de mindre pigmenterede) og er derfor kun af begrænset værdi for prækliniske analyser1. Derudover kan ikke-menneskelige pattedyrceller købes til mindre omkostninger og i større mængder; human donorvæv kan fås fra forskellige Eye Banks, men tilgængeligheden er begrænset og dyr. Endelig skal nye lægemidler til avanceret terapi (ATMP, dvs. celle-, vævs- eller genterapilægemiddel) anvendes i mindst to forskellige arter, før de testes hos patienter, og disse in vivo-undersøgelser anmoder om forberedelse af allogene celletransplantationer.
Retinal neurodegenerative sygdomme er den hyppigste årsag til blindhed i de industrialiserede lande, der omfatter almindelige sygdomme som AMD, samt sjældne sygdomme som retinitis pigmentosa, hvor nethinden celledød i sidste ende fører til blindhed. RPE celler, fotoreceptor, og retinal ganglion celler (RGC) skader kan i nogle tilfælde bremses, men der er i øjeblikket ingen helbredende behandlinger til rådighed. ATMPs giver mulighed for at korrigere gendefekter, integrere terapeutiske gener eller erstatte degenererede celler, hvilket muliggør udvikling af regenerative og helbredende behandlinger for sygdomme som AMD; 13 genterapier allerede fået markedsføring godkendelse, herunder en behandling til behandling af RPE65 mutation-associerede retinal degeneration2,3. Blandt ældre voksne (>60 år), ~ 30 millioner mennesker verden over er påvirket af enten neovaskulære (nvAMD) eller avaskulære (aAMD) AMD4. Begge former er induceret af aldersrelaterede udløsere, herunder oxidative skader, funktionsnedsættelse og tab af RPE-celler efterfulgt af fotoreceptorforringelse, blandt andre (f.eks. genetisk risiko alleler, rygning, forhøjet blodtryk)5,6. I nvAMD forværres patogenese af en ubalance af angiogene og anti-angiogene faktorer til fordel for den angiogene Vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF), der fremkalder choroidal neovascularization (CNV). Til dato kan kun nvAMD behandles ved månedlige intravitreale injektioner af hæmmere af VEGF-proteinet for at undertrykke CNV; der foreligger endnu ingen effektiv behandling for aAMD6,7.
Flere undersøgelser evaluerede cellebaserede behandlinger for at erstatte anti-VEGF-behandlingen: undersøgelser foretaget af Binder et al., hvor friskhøstede autologe RPE-celler blev transplanteret til patienter med nAMD8,9,10, viste moderat visuel forbedring, men kun en lille gruppe patienter nåede en endelig synsstyrke høj nok til at muliggøre læsning. For nylig brugte et klinisk fase I-studie et embryonalt stamcelleafledt RPE-plaster til behandling af AMD med lovende resultater; effekt, stabilitet og sikkerhed af RPE-plasteret i op til 12 måneder hos 2 af de 10 patienter, der blev behandlet11. Derudover har flere grupper offentliggjort undersøgelser, hvor autologe RPE-Bruch's membran-choroid patches blev høstet fra den perifere nethinde og transplanteret til macula12,13,14; og inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte RPE-patches blev genereret til transplantation15. For aAMD er antistoffer rettet mod komplementvejen blevet testet i kliniske forsøg6,16 og et fase I-studie ved hjælp af en enkelt intravitreal injektion af en adeno-associeret viral (AAV) vektor, der koder genet for faktoren CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) blev afsluttet17; fase II-studiet startede for nylig og har til formål at rekruttere 132 patienter med avanceret aAMD og at evaluere resultatet ved 2 år efter intervention18. Endelig har FocuS-studiegruppen startet et fase I/II multicenter klinisk forsøg, der evaluerer sikkerheden, dosisresponset og effekten af en rekombinant ikke-replikerende AAV-vektor, der kodning af en menneskelig komplementfaktor19.
Primært er målet med en regenerativ AMD-behandling transplantation af funktionelle RPE-celler, som blev beskadiget eller tabt. IPE- og RPE-celler deler imidlertid mange funktionelle og genetiske ligheder (f.eks. fagocytose og retinolmetabolisme), og fordi IPE-celler er mere feaably høstet, er de blevet foreslået som RPE-erstatning20. Selv om det tidligere er blevet påvist, at IPE-celletransplantationen forsinker fotoreceptordegeneration i dyremodeller21,22 og stabiliserer visuel funktion hos patienter med end-stage nvAMD, blev der ikke observeret nogen signifikant forbedring hos disse patienter23. Den manglende effekt kan skyldes det lave antal transplanterede celler, og / eller ubalancen af neuroprotektive retinale faktorer. En alternativ tilgang ville være at transplantere transfected pigment epitelceller, der overekspresser neuroprotektive faktorer for at genoprette retinale homøostase, opretholde de resterende RPE-celler og beskytte fotoreceptorer og RGCs mod degeneration. Derfor foreslår vi en ny behandling, der omfatter transplantation af funktionelle RPE- eller IPE-celler, der har gennemgået genteknologi for at udskille neuroprotektive og anti-angiogene proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinlignende vækstfaktorer (IGF'er). Fordelen ved at udvikle og analysere denne fremgangsmåde i flere arter i stedet for at bruge en cellelinje, kun én art eller humant væv er: 1) øget reproducerbarhed og overførbarhed af resultaterne som vist ved talrige undersøgelser realiseret i uafhængige laboratorier og forskellige arter1,24,25; 2) svine- eller kvægceller er stort ud til rådighed uden at ofre yderligere dyr; 3) tilgængeligheden af især svine- og kvægceller gør det muligt for store testserier at give solide resultater; 4) viden om at isolere, kultur og genetisk modificere celler fra de mest anvendte modeller muliggør in vivo-analyser hos flere arter24,25,26 og giver således et forbedret risiko-benefit-forhold for de første behandlede patienter; 5) fleksibiliteten i den præsenterede protokol gør det muligt at anvende den i forskellige modeller og eksperimentelle opsætninger og for alle øjencellebaserede behandlinger med og uden genteknologi. I modsætning hertil er alternative teknikker som cellelinjer eller humant væv kun af begrænset overførbarhed og/eller begrænset bortskaffelse. Cellelinjer som ARPE-19 er ideelle til indledende eksperimenter; Lav pigmentering og høj spredning adskiller sig dog betydeligt fraprimærcellerne 1. RPE- og IPE-celler, som er isoleret fra humant donorvæv, udgør en værdifuld kilde til in vitro-forsøg, der kan overføres. men vi får humant væv fra en amerikansk-amerikansk Eye Bank betyder, at vævet er mindst to dage gammel (efter enucleation) og kræver en lang og dyr transport, men lokale donorvæv er ikke tilgængelig i tilstrækkelige mængder til en produktiv forskning. Fordelen ved brugen af primære celler bekræftes af flere undersøgelser fra andre grupper27,28.
Til udvikling af en cellebaseret ikke-viral genterapi ved hjælp af SB100X transposon-systemet til transfecting af primære RPE- og IPE-celler med generne, der koder for PEDF og/eller GM-CSF til behandling af henholdsvis nvAMD og aAMD,henholdsvis 29,30,31,32, etablerede vi først transfektionen af ARPE-19-celler1 . Dernæst blev isolations- og transfectionprotokollerne etableret i lettilgængelige kvæg- og svin primære celler. Nu er isolation og transfektion af primære RPE- og IPE-celler fra fem forskellige arter blevet etableret, fra små (som mus) til store pattedyr (som kvæg). Det blev bekræftet i primære RPE- og IPE-celler afledt af menneskelige donorøjne30. Den gode fremstillingspraksis (GMP)-kompatibel produktion af ATMP blev valideret ved hjælp af humant donorvæv samt33. Endelig blev både sikkerheden og effektiviteten af tilgangen vurderet in vivo i tre forskellige arter, for hvilke protokollen er blevet tilpasset: mus, rotte og kanin. I det kliniske set-up vil en irisbiopsi blive høstet fra patienten, og IPE-celler vil blive isoleret og transfected i renrummet, før cellerne vil blive transplanteret subretinally tilbage til den samme patient. Hele processen vil finde sted under en enkelt kirurgisk session, der varer cirka 60 minutter. Udviklingen af behandlingsmetoden og evalueringen af dens effektivitet anmodede om fremragende in vitro- og ex vivo-modeller til at implementere robuste og effektive genleveringsmetoder, analysere effektiviteten af genlevering, terapeutisk proteinproduktion og neuroprotektive virkninger og til at producere celletransplantationer for at teste tilgangen in vivo1,24,25,29,30 . Det er værd at nævne, at behandlingen har den etiske godkendelse til et klinisk fase Ib / IIa-forsøg fra den etiske kommission for forskning i Kantonen Genève (nr. 2019-00250), og i øjeblikket indsamles sidste prækliniske data, der anmodes om tilladelse af schweiziske tilsynsmyndigheder, ved hjælp af den præsenterede protokol. I den forbindelse viste prækliniske in vivodata en signifikant reduktion i CNV og fremragende sikkerhed24,25,31.
Her beskrives isoleringen og kulturen af RPE/IPE-celler fra kvæg, gris, kanin, rotte og mus og brugen af det integrative SB100X transposonsystem kombineret med elektroporation som en effektiv genleveringsmetode. Især blev primære PE-celler overført til at overekspressere PEDF og GM-CSF. Indsamlingen af disse protokoller gør det muligt at udføre in vitro- og in vivo-studierne i alle prækliniske faser af ATMP-udviklingen. Desuden har set-up potentiale til at blive tilpasset andre gener af interesse og sygdomme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er den hyppigste årsag til blindhed hos patienter >60 år, der påvirker ~ 30 millioner mennesker på verdensplan. AMD er en multifaktoriel sygdom påvirket af miljømæssige og genetiske faktorer, som fører til funktionel svækkelse af nethinden på grund af retinale pigment epitel (RPE) celledegeneration efterfulgt af fotoreceptor nedbrydning. En ideel behandling ville omfatte transplantation af sunde RPE-celler udskille neuroprotektive faktorer for at forhindre RPE celle død og fotoreceptor degeneration. På grund af de funktionelle og genetiske ligheder og muligheden for en mindre invasiv biopsi blev transplantation af irispigmentepileleceller (IPE) foreslået som erstatning for degenererede RPE. Udskillelse af neuroprotektive faktorer ved et lavt antal subretinally transplanterede celler kan opnås ved Tornerose (SB100X) transposon-medieret transfektion med gener, der koder for pigment epitel-afledt faktor (PEDF) og / eller granulocyt makrofag-koloni stimulerende faktor (GM-CSF). Vi etablerede isolation, kultur og SB100X-medieret transfection af RPE- og IPE-celler fra forskellige arter, herunder gnavere, grise og kvæg. Glober er explanted og hornhinden og linsen fjernes for at få adgang til iris og nethinden. Ved hjælp af en skræddersyet spatel fjernes IPE-celler fra den isolerede iris. For at høste RPE-celler kan en trypsinininkubation være påkrævet, afhængigt af arten. Derefter suspenderes cellerne med RPE-tilpasset spatel med medium. Efter såning overvåges cellerne to gange om ugen og overføres efter sammenløb ved elektroporation. Genintegration, udtryk, proteinsekretion og funktion blev bekræftet af qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence og funktionelle analyser. Afhængigt af arten kan 30.000-5 millioner (RPE) og 10.000-1,5 millioner (IPE) celler isoleres pr. Øje. Genetisk modificerede celler udviser betydelig PEDF/GM-CSF-overekspression med kapacitet til at reducere oxidativ stress og tilbyder et fleksibelt system til ex vivo-analyser og in vivo-undersøgelser, der kan overføres til mennesker for at udvikle okulære genterapitilgange.

PE isolation fra forskellige pattedyr arter Ved hjælp af ovennævnte protokoller blev IPE- og RPE-celler med succes isoleret og kultiveret fra fem forskellige arter. Antallet af celler, der er fremstillet ved hver procedure, afhænger af øjets art og størrelse (tabel 1). Som vist i figur 1, celler viser typisk PE celle morfologi og pigmentering (bortset fra kaninceller vist, afledt af albino New Zealand White (NZW) kaniner). Efter 21 dage efter isolati...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Her præsenteres en protokol om at isolere og transfekte primær iris og retinale pigment epitelceller fra forskellige pattedyr (mus, rotte, kanin, gris og kvæg). Metoden er velegnet til at studere okulære genterapimetoder i forskellige set-ups til ex vivo-analyser og in vivo-studier, der kan overføres til mennesker.

Isolation, kultur og genteknologi af pattedyr primære pigment epitelceller til ikke-viral genterapi

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Protokollen er signifikant, da den viser isolering og transfektion af pigmentepælleceller fra fem pattedyr som et optimalt system til at studere okulær genterapi i forskellige opsætninger. Den største fordel ved denne metode er dens fleksibilitet, overførbarhed, højt celleudbytte, levedygtighed og transfectionhastighed på grund af de fem arter og det ikke-virale SB100X transposon-system, der anvendes. Disse teknikker er udviklet til at studere genterapi tilgange rettet mod retinale og iris pigment epitelceller, som er isoleret og transfected i den nuværende protokol, men kan anvendes til enhver okulær forskning.Det vil være Gregg Sealy, en tekniker fra laboratoriet. Efter aflivningen af dyret skal du bruge buet saks og Colibri-sammenkværn til at induckle øjnene og derefter rense det resterende muskelvæv og hud fra øjnene. Saml øjnene i et 50 milliliterrør fyldt med ikke-steril PBS og overfør røret til laminar flow hætten.Desinficer dem ved at nedsænke i jodbaseret opløsning i to minutter, og overfør derefter øjnene til et 50 milliliterrør fyldt med steril PBS. Sæt det ene øje på en steril gaze komprimere og fast holde øjet tæt på synsnerven. Derefter skæres nær grænsen for iris med en nummer 11 skalpel.Brug en saks, skæres rundt om iris og fjerne den forreste segment og sætte det i en Petri parabol, forlader pæren med glaslegeme, indtil retinal pigment epitel, eller RPE celler, er isoleret. For at isolere iris pigment epitel, eller IPE celler, fjerne linsen med fine sammentrækninger og forsigtigt trække ud iris, der indeholder IPE celler. Placer iris i en petriskål og vask den med steril PBS.Tilsæt 500 mikroliter på 0,25% trypsin og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Fjern trypsin, tilsæt 500 mikroliter af komplet medium, og skrab IPE fint med en flad, brandpoleret Pasteur pipette. Saml celleaffjedringen og læg den i et 1,5 milliliterrør.Tæl cellerne ved hjælp af Neubauer-kammeret, og frø 0,2 millioner celler pr. brønd i en 24 brøndplade med en milliliter komplet medium. Placer pladen i en inkubator og kultur det på 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. For at isolere RPE-celler skal du fjerne glasagtig humor og nethinde fra det bageste segment med tynde sammentak.Sæt pærerne i 24 brøndpladen og tilsæt 500 mikroliter på 0,25% trypsin pr. Øje og inkuber i 10 minutter ved 37 grader Celsius. Fjern trypsin, tilsæt 500 mikroliter af komplet medium pr. globus og skrab RPE-cellerne delikat med en buet, brandpoleret Pasteur-pipette. Saml celleaffjedringen og læg den i et 1,5 milliliterrør.Tæl cellerne ved hjælp af Neubauer-kammeret, og frø cellerne som beskrevet tidligere. Placer pladen i inkubatoren. Rengør det resterende muskelvæv og huden fra øjnene og desinficer øjnene i jodbaseret opløsning, og skyl dem med PBS.Hvis du vil isolere IPE-celler, skal du fjerne objektivet og trække iris ud som beskrevet tidligere. Efter at have forberedt to iris, tilsæt en milliliter komplet medium og isolere cellerne ved at ridse med en flad, brandpoleret Pasteur pipette, og derefter tælle og frø cellerne. Placer pladen i inkubatoren.For at isolere RPE-celler skal du fjerne glaslegemet og nethinden fra det bageste segment og placere pæren i en petriskål. Fyld pæren med en milliliter komplet medium. Fjern RPE-cellerne ved hjælp af en buet, brandpoleret Pasteur-pipette.Saml celleaffjedringen i pæren ved hjælp af en 1.000 mikroliter pipette, og overfør den til et 1,5 milliliterrør til resuspension. Derefter tælle og frø cellerne og inkubere pladen som tidligere påvist. Efter rengøring skal du åbne øjet og skære rundt om iris for at fjerne det forreste segment og derefter sætte i en petriskål.Lad pæren stå med glaslegemet, indtil RPE-cellerne er isoleret. For at isolere IPE-celler, hvis linsen kommer med det forreste segment, skal du fjerne linsen og bruge fine sammentrækninger til forsigtigt at trække iris, der indeholder IPE-cellerne. Placer iris i en petriskål og vask den med steril PBS.Skær ciliary kroppen med en skalpel nummer 10. Efter at have forberedt iris, inkuberer dem med to milliliter på 0,25% trypsin ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Fjern trypsin og tilsæt to milliliter af komplet medium, og isoler derefter cellerne ved at ridse med en flad, brandpoleret Pasteur pipette.Overfør celleaffjedringen til et to milliliterrør, og centrifuger cellerne i 10 minutter ved 120 gange G.Kassér supernatanten og brug cellerne i to milliliter komplet medium. Frø 0,32 millioner celler pr brønd i en seks brønd plade i tre milliliter af komplet medium. Placer pladen i en inkubator og kultur det på 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.For at isolere RPE-celler skal du fjerne glasagtig humor og nethinde fra det bageste segment med sammentak. Undgå at beskadige nethinden pigment epitel. Vask pæren med PBS.Efter at have forberedt begge øjne, fyld pæren omkring tre fjerdedele fuld med trypsin og inkuberes i 25 minutter ved 37 grader Celsius med petriskålens låg oven på pæreøjet. Fjern trypsin og tilsæt en milliliter af komplet medium. Fjern RPE-cellerne ved hjælp af en buet, brandpoleret Pasteur-pipette.Saml celleaffjedringen i pæren og overfør den til et 1,5 milliliterrør til resuspension. Centrifuge cellerne i 10 minutter ved 120 gange G.Seed 0,32 millioner celler pr godt i en seks brønd plade i tre milliliter af komplet medium. Placer pladen i en inkubator og kultur det på 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Kultur cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en befugtet inkubator. Efter tre til fire dage, pipette op og ned for at indsamle ikke-sammenhængende celler og sætte halvdelen af volumen i en anden brønd. Fyld brønden til en milliliter med komplet medium.Efter yderligere tre til fire dage skal du gentage cellesamlingen, denne gang samle de ikke-sammenhængende celler fra to brønde i en. Tilføj medium til alle brønde. Overhold cellerne og skift mediet to gange om ugen.Når cellerne når sammenløb, skifte til komplet medium med 1%FBS. Ved hjælp af ovennævnte protokoller blev IPE- og RPE-celler med succes isoleret og kultiveret fra fem forskellige arter. RPE-ekspressionsmønstret blev bekræftet i primære IPE-celler af immunfluorescence for RPE65.Celle levedygtighed blev undersøgt for at udelukke en potentiel toksicitet af elektroporation buffer ved hjælp af en kommercielt tilgængelige cytotoksicitet assay kit og en knude elektroporated kontrol. Der blev ikke observeret nogen indvirkning på celle levedygtigheden. Prækulturelle pigment epitelceller fra forskellige arter blev transfected med den gule fluorescerende Venus protein.Transfected RPE19 celler blev brugt som en positiv kontrol. Kvantificeringen af transfection effektivitet i prækulturel gris RPE er vist her. Frisk isolerede kaninpigment epitelceller blev transfected med det gule fluorescerende protein Venus og blev overvåget af mikroskopi.Pigment epitelceller blev transfected med pigment epitel afledt faktor og protein sekretion blev overvåget af vestlige blot. Signalet for transfected celler var højere sammenlignet med ikke-transfected celler for alle undersøgte arter og dage undersøgt, og ingen fald i protein sekretion blev observeret inden for denne tid. Det er afgørende at undgå at skrabe cellerne med skarpe værktøjer.Her anvendes ildpolerede Pasteur pipetter, undtagen i små museøjne, hvor der skal anvendes en rund skalpel. Pigment epitelceller kan bruges til at udvikle genterapi tilgange og til at simulere patologiske tilstande, for eksempel, oxidative stressskader. Disse modeller kan også bruges til at teste terapeutiske lægemidler.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation og kultur af primære aorta endotelceller fra miniature grise

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...