Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Een bedankje verdient Gregg Sealy en Alain Conti voor hun uitstekende technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Europese Commissie in het kader van het zevende kaderprogramma, de Zwitserse National Sciences Foundation en de Schmieder-Bohrisch Foundation. Z.I. ontving financiering van de European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] en B.M.W. van een Fulbright Research Grant en Swiss Government Excellence Scholarship.

De protocollen waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd door gecertificeerd personeel en na toestemming van het kantonnale Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale uit Genève, Zwitserland, en volgens de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visionair onderzoek (goedkeuringsnr. GE/94/17). Volwassen gezonde bruine fijnratten, C57BL /6-muizen en Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden geëuthanaseerd door een overdosis Pentobar...

Het hebben van gestandaardiseerde methoden om PE-cellen te isoleren en te kweken is van fundamenteel belang bij het ontwikkelen van nieuwe therapiebenaderingen voor retinale degeneratieve ziekten. Met de hier gepresenteerde protocollen kunnen PE-cellen met succes worden geïsoleerd van verschillende soorten en gedurende lange perioden worden gekweekt (tot nu toe werd de langste cultuur gedurende 2 jaargehandhaafd 1,38); typische PE-celmorfologie, pigmentatie en f...

Onze groep richt zich op de ontwikkeling van regeneratieve benaderingen voor de behandeling van neuroretinale degeneratie, d.w.z. AMD, door RPE- en IPE-gebaseerde niet-virale gentherapie. De preklinische oprichting van dergelijke therapieën vereist in vitro modellen die overdraagbaar zijn op de mens. Het doel van de hier gepresenteerde studie is dus om protocollen te leveren voor de isolatie, cultuur en genetische manipulatie van primaire RPE- en IPE-cellen. De reden om de isolatie van PE-cellen van meerdere soorten vast te stellen, is om de veiligheid en efficiëntie van de aanpak robuust te bevestigen en de reproduceerbaarheid en overdraagbaarheid ervan te vergroten. De beschikbare menselijke RPE-cellijn ARPE-19 verschilt van primaire cellen (ze zijn bijvoorbeeld minder gepigmenteerd) en is daarom slechts van beperkte waarde voor preklinische analyses1. Bovendien kunnen niet-menselijke zoogdiercellen worden gekocht voor minder kosten en in grotere hoeveelheden; menselijk donorweefsel kan worden verkregen bij verschillende oogbanken, maar de beschikbaarheid is beperkt en duur. Ten slotte moeten nieuwe geneesmiddelen voor geavanceerde therapie (ATMP, d.w.z. cel-, weefsel- of gentherapiegeneesmiddel) in ten minste twee verschillende soorten worden toegepast voordat ze bij patiënten worden getest en deze in vivo studies vragen om de voorbereiding van allogene celtransplantaties.
Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van blindheid in geïndustrialiseerde landen, waaronder veel voorkomende ziekten zoals AMD, evenals zeldzame ziekten zoals retinitis pigmentosa, waarbij de retinale celdood uiteindelijk leidt tot blindheid. RPE-cellen, fotoreceptor en retinale ganglioncellen (RGC) schade kan in sommige gevallen worden vertraagd, maar er zijn momenteel geen curatieve therapieën beschikbaar. ATMP's bieden het potentieel om gendefecten te corrigeren, therapeutische genen te integreren of gedegenereerde cellen te vervangen, waardoor de ontwikkeling van regeneratieve en curatieve therapieën voor ziekten zoals AMD mogelijk wordt; 13 gentherapieën kregen al goedkeuring voor het op de markt brengen, waaronder een therapie voor de behandeling van RPE65 mutatie-geassocieerde retinale degeneratie2,3. Onder oudere volwassenen (>60 jaar) worden ~ 30 miljoen mensen wereldwijd getroffen door neovasculaire (nvAMD) of avasculaire (aAMD) AMD4. Beide vormen worden geïnduceerd door leeftijdsgebonden triggers, waaronder oxidatieve schade, functiestoornissen en verlies van RPE-cellen gevolgd door fotoreceptordegradatie, onder andere (bijv. Genetische risico-allelen, roken, hypertensie)5,6. Bij nvAMD wordt de pathogenese verergerd door een onbalans van angiogene en anti-angiogene factoren ten gunste van de angiogene Vasculaire Endotheliale Groeifactor (VEGF) die choroïdale neovascularisatie (CNV) induceert. Tot op heden is alleen nvAMD te behandelen door maandelijkse intravitreale injecties van remmers van het VEGF-eiwit om het CNV te onderdrukken; er is nog geen effectieve behandeling beschikbaar voor aAMD6,7.
Verschillende studies evalueerden celgebaseerde therapieën om de anti-VEGF-therapie te vervangen: studies uitgevoerd door Binder et al., waarbij vers geoogste autologe RPE-cellen werden getransplanteerd in patiënten met nAMD8,9,10, toonden matige visuele verbetering, maar slechts een kleine groep patiënten bereikte een uiteindelijke gezichtsscherpte die hoog genoeg was om lezen mogelijk te maken. Onlangs gebruikte een fase I klinische studie een embryonale stamcel-afgeleide RPE-pleister om AMD te behandelen met veelbelovende resultaten; d.w.z. werkzaamheid, stabiliteit en veiligheid van de RPE-pleister gedurende maximaal 12 maanden bij 2 van de 10 behandelde patiënten11. Daarnaast hebben verschillende groepen studies gepubliceerd waarin autologe RPE-Bruch's membraan-vaatvliespleisters werden geoogst van het perifere netvlies en getransplanteerd naar de macula12,13,14; en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide RPE-pleisters werden gegenereerd voortransplantatie 15. Voor aAMD zijn antilichamen gericht op de complementroute getest in klinische onderzoeken6,16 en een fase I-studie met behulp van een enkele intravitreale injectie van een adeno-geassocieerde virale (AAV) vector die codeert voor het gen voor de factor CD59 (AAVCAGsCD59) bij patiënten met geografische atrofie (GA) werd voltooid17; de fase II-studie is onlangs gestart en heeft tot doel 132 patiënten met gevorderde aAMD te werven en de uitkomst 2 jaar na de interventie te evalueren18. Ten slotte is de FocuS-studiegroep begonnen met een fase I / II multicenter klinische studie ter evaluatie van de veiligheid, dosisrespons en werkzaamheid van een recombinante niet-replicerende AAV-vector die codeert voor een humane complementfactor19.
In de eerste plaats is het doel van een regeneratieve AMD-therapie de transplantatie van functionele RPE-cellen, die beschadigd of verloren zijn gegaan. IPE- en RPE-cellen delen echter veel functionele en genetische overeenkomsten (bijv. Fagocytose en retinolmetabolisme), en omdat IPE-cellen haalbaarder worden geoogst, zijn ze voorgesteld als een RPE-substituut20. Hoewel eerder is aangetoond dat de IPE-celtransplantatie de degeneratie van fotoreceptoren in diermodellenvertraagt 21,22 en de visuele functie stabiliseert bij patiënten met nvAMD in het eindstadium, werd bij deze patiënten geen significante verbetering waargenomen23. Het gebrek aan werkzaamheid kan te wijten zijn aan het lage aantal getransplanteerde cellen en / of de onbalans van neuroprotectieve retinale factoren. Een alternatieve benadering zou zijn om getransfecteerde pigmentepitheelcellen te transplanteren die neuroprotectieve factoren overexpressie hebben om retinale homeostase te herstellen, resterende RPE-cellen te behouden en fotoreceptoren en RGC's te beschermen tegen degeneratie. Daarom stellen we een nieuwe therapie voor die de transplantatie omvat van functionele RPE- of IPE-cellen die genetische manipulatie hebben ondergaan om neuroprotectieve en anti-angiogene eiwitten, zoals PEDF, GM-CSF of insuline-achtige groeifactoren (IGF's) uit te scheiden. Het voordeel van het ontwikkelen en analyseren van deze aanpak in verschillende soorten in plaats van het gebruik van een cellijn, slechts één soort of menselijk weefsel is: 1) verhoogde reproduceerbaarheid en overdraagbaarheid van de resultaten zoals aangetoond door talrijke studies gerealiseerd in onafhankelijke laboratoria en verschillende soorten1,24,25; 2) varkens- of rundercellen zijn mogelijk wegwerpbaar zonder dat er extra dieren worden opgeofferd; 3) de beschikbaarheid van met name varkens- en rundercellen maakt het mogelijk grote testreeksen om robuuste resultaten te produceren; 4) de kennis om cellen uit de meest gebruikte modellen te isoleren, te kweken en genetisch te modificeren maakt in vivo analyses in meerdere soorten24,25,26 mogelijk en biedt zo een verbeterde risico-batenverhouding voor de eerste behandelde patiënten; 5) de flexibiliteit van het gepresenteerde protocol maakt het gebruik ervan mogelijk in verschillende modellen en experimentele opstellingen en voor alle op oculaire cellen gebaseerde therapieën met en zonder genetische manipulatie. Alternatieve technieken zoals cellijnen of menselijk weefsel hebben daarentegen slechts een beperkte overdraagbaarheid en/of beperkte disposeerbaarheid. Cellijnen zoals de ARPE-19 zijn ideaal voor voorbereidende experimenten; lage pigmentatie en hoge proliferatie verschillen echter aanzienlijk van primaire cellen1. RPE- en IPE-cellen, die worden geïsoleerd uit menselijk donorweefsel, bieden een kostbare bron voor overdraagbare in vitro experimenten; we verkrijgen echter menselijk weefsel van een Amerikaans-Amerikaanse oogbank, wat betekent dat het weefsel minstens twee dagen oud is (na enucleatie) en een lang en duur transport vereist, maar lokaal donorweefsel is niet in voldoende hoeveelheden beschikbaar voor een productief onderzoek. Het voordeel van het gebruik van primaire cellen wordt bevestigd door meerdere studies uit andere groepen27,28.
Voor de ontwikkeling van een op cellen gebaseerde niet-virale gentherapie met behulp van het SB100X transposonsysteem voor het transfecteren van primaire RPE- en IPE-cellen met de genen die coderen voor PEDF en / of GM-CSF voor de behandeling van nvAMD en aAMD, respectievelijk29,30,31,32, hebben we eerst de transfectie van ARPE-19-cellen vastgesteld1 . Vervolgens werden de isolatie- en transfectieprotocollen vastgesteld in gemakkelijk toegankelijke primaire cellen van runderen en varkens. Nu is de isolatie en transfectie van primaire RPE- en IPE-cellen van vijf verschillende soorten vastgesteld, van kleine (als muis) tot grote zoogdieren (als vee). Het werd bevestigd in primaire RPE- en IPE-cellen afgeleid van menselijke donorogen30. De good manufacturing practices (GMP)-conforme productie van het ATMP werd gevalideerd met behulp van menselijk donorweefsel33. Ten slotte werden zowel de veiligheid als de efficiëntie van de aanpak in vivo beoordeeld bij drie verschillende soorten waarvoor het protocol is aangepast: muis, rat en konijn. In de klinische opstelling zal een irisbiopsie van de patiënt worden geoogst en IPE-cellen zullen worden geïsoleerd en getransfecteerd in de cleanroom, voordat de cellen subretinaal terug in dezelfde patiënt worden getransplanteerd. Het hele proces vindt plaats tijdens een enkele chirurgische sessie die ongeveer 60 minuten duurt. De ontwikkeling van de behandelingsaanpak en de evaluatie van de efficiëntie ervan vroegen om uitstekende in vitro en ex vivo modellen om robuuste en efficiënte genafgiftemethoden te implementeren, om de efficiëntie van genafgifte, therapeutische eiwitproductie en neuroprotectieve effecten te analyseren, en om celtransplantaties te produceren om de aanpak in vivote testen1,24,25,29,30 . Het is vermeldenswaard dat de therapie de ethische goedkeuring heeft voor een klinische fase Ib / IIa-studie van de ethische commissie voor onderzoek van het kanton Genève (nr. 2019-00250) en momenteel worden de laatste preklinische gegevens die door Zwitserse regelgevende instanties om toestemming worden gevraagd, verzameld met behulp van het gepresenteerde protocol. In dit verband toonden preklinische in vivo gegevens een significante vermindering van CNV en uitstekende veiligheid24,25,31.
Hier wordt de isolatie en kweek van RPE/IPE-cellen van runderen, varkens, konijnen, ratten en muizen en het gebruik van het integratieve SB100X transposonsysteem in combinatie met elektroporatie als een efficiënte genafgiftemethode beschreven. Met name primaire PE-cellen werden getransfecteerd om PEDF en GM-CSF te overexpressie te maken. De verzameling van deze protocollen maakt het mogelijk om de in vitro en in vivo studies uit te voeren in alle preklinische fasen van ATMP-ontwikkeling. Bovendien heeft de opstelling de potentie om aangepast te worden aan andere genen en ziekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is de meest voorkomende oorzaak van blindheid bij patiënten >60 jaar en treft ~ 30 miljoen mensen wereldwijd. AMD is een multifactoriële ziekte die wordt beïnvloed door omgevings- en genetische factoren, die leiden tot functionele stoornissen van het netvlies als gevolg van retinale pigmentepitheel (RPE) celdegeneratie gevolgd door afbraak van fotoreceptoren. Een ideale behandeling zou de transplantatie van gezonde RPE-cellen omvatten die neuroprotectieve factoren afscheiden om RPE-celdood en fotoreceptordegeneratie te voorkomen. Vanwege de functionele en genetische overeenkomsten en de mogelijkheid van een minder invasieve biopsie, werd de transplantatie van irispigmentepitheelcellen (IPE) voorgesteld als vervanging voor de gedegenereerde RPE. Secretie van neuroprotectieve factoren door een laag aantal subretinaal getransplanteerde cellen kan worden bereikt door Doornroosje (SB100X)transposon-gemedieerde transfectie met genen die coderen voor de pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en / of de granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (GM-CSF). We hebben de isolatie, cultuur en SB100X-gemedieerdetransfectie van RPE- en IPE-cellen van verschillende soorten vastgesteld, waaronder knaagdieren, varkens en runderen. Bollen worden geëxplanteerd en het hoornvlies en de lens worden verwijderd om toegang te krijgen tot de iris en het netvlies. Met behulp van een op maat gemaakte spatel worden IPE-cellen uit de geïsoleerde iris verwijderd. Om RPE-cellen te oogsten, kan een trypsine-incubatie nodig zijn, afhankelijk van de soort. Vervolgens worden met behulp van RPE-aangepaste spatel cellen in medium gesuspendeerd. Na het zaaien worden de cellen twee keer per week gecontroleerd en, na het bereiken van confluentie, getransfecteerd door elektroporatie. Genintegratie, expressie, eiwitsecretie en functie werden bevestigd door qPCR, WB, ELISA, immunofluorescentie en functionele assays. Afhankelijk van de soort kunnen 30.000-5 miljoen (RPE) en 10.000-1,5 miljoen (IPE) cellen per oog worden geïsoleerd. Genetisch gemodificeerde cellen vertonen een significante PEDF/GM-CSF overexpressie met het vermogen om oxidatieve stress te verminderen en bieden een flexibel systeem voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen om oculaire gentherapiebenaderingen te ontwikkelen.

PE-isolatie van verschillende zoogdiersoorten Met behulp van de bovengenoemde protocollen werden IPE- en RPE-cellen met succes geïsoleerd en gekweekt van vijf verschillende soorten. Het aantal cellen dat bij elke procedure wordt verkregen, is afhankelijk van de soort en de grootte van het oog(tabel 1). Zoals weergegeven in figuur 1,vertonen cellen typische PE-celmorfologie en pigmentatie (behalve voor getoonde konijnencellen, afgeleid van albino New Zeal...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Het protocol is belangrijk omdat het de isolatie en transfectie van pigmentepitheelcellen van vijf zoogdieren laat zien als een optimaal systeem om oculaire gentherapie in verschillende opstellingen te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de flexibiliteit, overdraagbaarheid, hoge celopbrengst, levensvatbaarheid en transfectiesnelheid als gevolg van de vijf soorten en het gebruikte niet-virale SB100X-transposonsysteem. Deze technieken zijn ontwikkeld om gentherapiebenaderingen te bestuderen die gericht zijn op retinale en irispigmentepitheelcellen, die geïsoleerd en getransfecteerd zijn in het huidige protocol, maar bruikbaar zijn voor elk oculair onderzoek.Gregg Sealy, een technicus van het laboratorium, demonstreert de procedure. Gebruik na het euthanaseren van het dier een gebogen schaar en Colibri-tang om de ogen te enucleeren en reinig vervolgens het resterende spierweefsel en de huid van de ogen. Verzamel de ogen in een buis van 50 milliliter gevuld met niet-steriel PBS en breng de buis over naar de laminaire stroomkap.Desinfecteer ze door ze gedurende twee minuten onder te dompelen in een oplossing op basis van jodium en breng de ogen vervolgens over naar een buis van 50 milliliter gevuld met steriel PBS. Plaats één oog op een steriel gaaskompres en houd het oog stevig dicht bij de oogzenuw. Snijd vervolgens in de buurt van de limiet van de iris met een nummer 11 scalpel.Knip met een schaar rond de iris en verwijder het voorste segment en doe het in een petrischaaltje, waarbij de bol met het glasvocht blijft totdat het retinale pigmentepitheel of RPE-cellen zijn geïsoleerd. Om irispigmentepitheel- of IPE-cellen te isoleren, verwijdert u de lens met een fijne tang en trekt u de iris met de IPE-cellen voorzichtig uit. Leg de iris in een petrischaaltje en was hem met steriel PBS.Voeg 500 microliter 0,25% trypsine toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder de trypsine, voeg 500 microliter volledig medium toe en schraap de IPE voorzichtig met een platte, vuurgepolijste Pasteurpipet. Verzamel de celsuspensie en doe deze in een buis van 1,5 milliliter.Tel de cellen met behulp van de Neubauer-kamer en zaai 0,2 miljoen cellen per put in een plaat van 24 putten met één milliliter volledig medium. Plaats de plaat in een couveuse en kweek het op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Om RPE-cellen te isoleren, verwijdert u de glasvochthumor en het netvlies uit het achterste segment met een dunne tang.Doe de bollen in de 24 putjesplaat en voeg 500 microliter 0,25% trypsine per oog toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder trypsine, voeg 500 microliter volledig medium per bol toe en schraap de RPE-cellen voorzichtig met een gebogen, vuurgepolijste Pasteurpipet. Verzamel de celsuspensie en doe deze in een buis van 1,5 milliliter.Tel de cellen met behulp van de Neubauer-kamer en zaai de cellen zoals eerder beschreven. Plaats het bord in de couveuse. Reinig het resterende spierweefsel en de huid van de ogen en desinfecteer de ogen in een oplossing op basis van jodium en spoel ze met PBS.Om IPE-cellen te isoleren, verwijdert u de lens en trekt u de iris eruit zoals eerder beschreven. Voeg na het bereiden van twee irissen een milliliter volledig medium toe en isoleer de cellen door te krabben met een platte, vuurgepolijste Pasteur-pipet, tel en zaai vervolgens de cellen. Plaats het bord in de couveuse.Om RPE-cellen te isoleren, verwijdert u het glasvocht en het netvlies uit het achterste segment en plaatst u de bol in een petrischaaltje. Vul de bol met één milliliter volledig medium. Verwijder met behulp van een gebogen, vuurgepolijste Pasteur-pipet de RPE-cellen.Verzamel de celsuspensie in de lamp met behulp van een pipet van 1.000 microliter en breng deze over in een buis van 1,5 milliliter voor resuspensie. Tel en zaai vervolgens de cellen en incubeer de plaat zoals eerder aangetoond. Open na het reinigen het oog en snijd rond de iris om het voorste segment te verwijderen en doe het vervolgens in een petrischaaltje.Laat de bol met het glasvocht totdat RPE-cellen zijn geïsoleerd. Om IPE-cellen te isoleren, als de lens wordt geleverd met het voorste segment, verwijdert u de lens en gebruikt u een fijne tang om de iris met de IPE-cellen voorzichtig uit te trekken. Leg de iris in een petrischaaltje en was hem met steriel PBS.Snijd het ciliaire lichaam met een scalpel nummer 10. Na het bereiden van de irissen, incubeer ze met twee milliliter van 0,25% trypsine bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de trypsine en voeg twee milliliter volledig medium toe en isoleer de cellen door te krabben met een platte, vuurgepolijste Pasteurpipet.Breng de celsuspensie over in een buis van twee milliliter en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 120 maal G.Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in twee milliliter volledig medium. Zaai 0,32 miljoen cellen per put in een plaat met zes putten in drie milliliter volledig medium. Plaats de plaat in een couveuse en kweek het op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Om RPE-cellen te isoleren, verwijdert u de glasvochthumor en het netvlies met een tang uit het achterste segment. Vermijd beschadiging van het retinale pigmentepitheel. Was de bol met PBS.Na het bereiden van beide ogen, vul de bol ongeveer driekwart vol met trypsine en incubeer gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius met het petrischaaldeksel bovenop het boloog. Verwijder de trypsine en voeg een milliliter volledig medium toe. Verwijder met behulp van een gebogen, vuurgepolijste Pasteur-pipet de RPE-cellen.Verzamel de celsuspensie in de bol en breng deze over in een buis van 1,5 milliliter voor resuspensie. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 120 keer G.Zaad 0,32 miljoen cellen per put in een plaat met zes putten in drie milliliter volledig medium. Plaats de plaat in een couveuse en kweek het op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Kweek de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in een bevochtigde incubator. Pipetteer na drie tot vier dagen op en neer om niet-aangrenzende cellen te verzamelen en doe de helft van het volume in een andere put. Vul de put tot één milliliter met volledig medium.Herhaal na nog eens drie tot vier dagen de celverzameling, deze keer waarbij de niet-aangrenzende cellen uit twee putten in één worden samengevoegd. Voeg medium toe aan alle putten. Observeer de cellen en verander het medium twee keer per week.Wanneer cellen samenvloeiing bereiken, schakelt u over op een volledig medium met 1% FBS. Met behulp van de bovengenoemde protocollen werden IPE- en RPE-cellen met succes geïsoleerd en gekweekt van vijf verschillende soorten. Het RPE-expressiepatroon werd bevestigd in primaire bovine IPE-cellen door immunofluorescentie voor RPE65.De levensvatbaarheid van cellen werd onderzocht om een potentiële toxiciteit van de elektroporatiebuffer uit te sluiten met behulp van een in de handel verkrijgbare cytotoxiciteitstestkit en een knoopelektroporated controle. Er werd geen effect op de levensvatbaarheid van cellen waargenomen. Voorgekcultureerde pigmentepitheelcellen van verschillende soorten werden getransfecteerd met het gele fluorescerende Venus-eiwit.Getransfecteerde RPE19-cellen werden gebruikt als een positieve controle. De kwantificering van de transfectie-efficiëntie in voorgekcultureerd varken RPE wordt hier getoond. Vers geïsoleerde konijnenpigmentepitheelcellen werden getransfecteerd met het gele fluorescerende eiwit Venus en werden gecontroleerd door microscopie.Pigmentepitheelcellen werden getransfecteerd met pigmentepitheel afgeleide factor en eiwitsecretie werd gecontroleerd door Western blot. Het signaal voor getransfecteerde cellen was hoger in vergelijking met niet-getransfecteerde cellen voor alle bestudeerde soorten en dagen, en er werd binnen deze tijd geen afname van de eiwitsecretie waargenomen. Het is cruciaal om te voorkomen dat de cellen met scherp gereedschap worden geschraapt.Hier worden vuurgepolijste Pasteur-pipetten gebruikt, behalve in kleine muizenogen, waar een rond scalpel moet worden gebruikt. Pigmentepitheelcellen kunnen worden gebruikt om gentherapiebenaderingen te ontwikkelen en pathologische aandoeningen te simuleren, bijvoorbeeld oxidatieve stressschade. Deze modellen kunnen ook worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelen te testen.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Een systeem voor het kweken van Iris pigment epitheelcellen aan Lens Regeneratie Study in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...