Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
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Un grand merci à Gregg Sealy et Alain Conti pour leur excellente assistance technique. Ces travaux ont été soutenus par la Commission européenne dans le cadre du septième programme-cadre, du Fonds national suisse de la recherche scientifique et de la Fondation Schmieder-Bohrisch. Z.I. a reçu un financement du Conseil européen de la recherche, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] et B.M.W. d’une bourse de recherche Fulbright et d’une bourse d’excellence de la Confédération suisse.

Les protocoles dans lesquels les animaux ont été impliqués ont été réalisés par du personnel certifié et après autorisation du Département cantonal de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale de Genève, Suisse, et conformément à la Déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle (approbation no. GE/94/17). Des rats bruns de Norvège adultes en bonne santé, des souris C57BL/6 et des lapins blancs néo-zél...

Avoir des méthodes normalisées pour isoler et mettre en culture des cellules PE est fondamental dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine. Avec les protocoles présentés ici, les cellules PE peuvent être isolées avec succès de différentes espèces et cultivées pendant de longues périodes (jusqu’à présent, la culture la plus longue était maintenue pendant 2 ans1,38); la morphologie,...

Notre groupe se concentre sur le développement d’approches régénératives pour traiter la dégénérescence neurorétinienne, c’est-à-dire la DMLA, par thérapie génique non virale basée sur l’EPR et l’IPE. L’établissement préclinique de telles thérapies nécessite des modèles in vitro transférables à l’homme. Ainsi, l’objectif de l’étude présentée ici est de fournir des protocoles pour l’isolement, la culture et le génie génétique des cellules PRIMAIRES RPE et IPE. La raison d’être de l’isolement des cellules PE de plusieurs espèces est de confirmer de manière robuste l’innocuité et l’efficacité de l’approche et d’accroître sa reproductibilité et sa transférabilité. La lignée cellulaire ARPE-19 humaine disponible diffère des cellules primaires (par exemple, elles sont moins pigmentées) et n’a donc qu’une valeur limitée pour les analyses précliniques1. De plus, les cellules de mammifères non humains peuvent être achetées à moindre coût et en plus grandes quantités; les tissus de donneurs humains peuvent être obtenus à partir de diverses banques d’yeux, mais la disponibilité est limitée et coûteuse. Enfin, les nouveaux médicaments de thérapie innovante (ATMP, c’est-à-dire les cellules, les tissus ou les médicaments de thérapie génique) doivent être appliqués à au moins deux espèces différentes avant d’être testés chez les patients et ces études in vivo demandent la préparation de greffes de cellules allogéniques.
Les maladies neurodégénératives de la rétine sont la principale cause de cécité dans les pays industrialisés, comprenant des maladies courantes comme la DMLA, ainsi que des maladies rares comme la rétinite pigmentaire, dans laquelle la mort cellulaire rétinienne conduit finalement à la cécité. Les lésions des cellules EPR, des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) peuvent dans certains cas être ralenties, mais il n’existe actuellement aucun traitement curatif. Les ATMP offrent la possibilité de corriger les défauts génétiques, d’intégrer des gènes thérapeutiques ou de remplacer les cellules dégénérées, permettant ainsi le développement de thérapies régénératives et curatives pour des maladies telles que la DMLA; 13 thérapies géniques ont déjà obtenu l’autorisation de commercialisation, y compris une thérapie pour traiter la dégénérescence rétinienne associée à la mutation RPE652,3. Parmi les personnes âgées (>60 ans), environ 30 millions de personnes dans le monde sont touchées par la DMLA néovasculaire (nvAMD) ou avasculaire (aAMD)4. Les deux formes sont induites par des déclencheurs associés à l’âge, y compris des dommages oxydatifs, une altération de la fonction et une perte de cellules EPR suivies d’une dégradation des photorécepteurs, entre autres (par exemple, allèles de risque génétique, tabagisme, hypertension)5,6. Dans la nvAMD, la pathogenèse est aggravée par un déséquilibre des facteurs angiogéniques et anti-angiogéniques en faveur du facteur de croissance endothélial vasculaire angiogénique (VEGF) qui induit la néovascularisation choroïdienne (CNV). À ce jour, seule la nvAMD peut être traité par des injections intravitréennes mensuelles d’inhibiteurs de la protéine VEGF pour supprimer le CNV; aucun traitement efficace n’est encore disponible pourl’AAMD 6,7.
Plusieurs études ont évalué les thérapies cellulaires pour remplacer le traitement anti-VEGF: des études réalisées par Binder et al., dans lesquelles des cellules RPE autologues fraîchement récoltées ont été transplantées chez des patients atteints de nAMD8,9,10, ont montré une amélioration visuelle modérée, mais seul un petit groupe de patients a atteint une acuité visuelle finale suffisamment élevée pour permettre la lecture. Récemment, une étude clinique de phase I a utilisé un patch RPE dérivé de cellules souches embryonnaires pour traiter la DMLA avec des résultats prometteurs; c’est-à-dire l’efficacité, la stabilité et l’innocuité du timbre RPE jusqu’à 12 mois chez 2 des 10 patients traités11. En outre, plusieurs groupes ont publié des études dans lesquelles des plaques autologues de la membrane-choroïde de BRUCH ont été récoltées dans la rétine périphérique et transplantées dans la macula12,13,14; et des patchs d’EPR induits dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) ont été générés pour la transplantation15. Pour l’aAMD, des anticorps ciblant la voie du complément ont été testés dans les essais cliniques6,16 et une étude de phase I utilisant une seule injection intravitréenne d’un vecteur viral adéno-associé (AAV) codant le gène du facteur CD59 (AAVCAGsCD59) chez des patients atteints d’atrophie géographique (GA) a été réalisée17; l’étude de phase II a récemment débuté et vise à recruter 132 patients atteints de DMA avancée et à évaluer le résultat à 2 ans après l’intervention18. Enfin, le groupe d’étude FocuS a entamé un essai clinique multicentrique de phase I/II évaluant l’innocuité, la dose-réponse et l’efficacité d’un vecteur AAV recombinant non répliquant codé pour un facteur de complément humain19.
Principalement, l’objectif d’une thérapie régénérative de la DMLA est la transplantation de cellules RPE fonctionnelles, qui ont été endommagées ou perdues. Cependant, les cellules IPE et RPE partagent de nombreuses similitudes fonctionnelles et génétiques (par exemple, la phagocytose et le métabolisme du rétinol), et comme les cellules IPE sont plus facilement récoltées, elles ont été proposées comme substitut RPE20. Même s’il a déjà été démontré que la greffe de cellules IPE retarde la dégénérescence des photorécepteurs dans les modèles animaux21,22 et stabilise la fonction visuelle chez les patients atteints de nvAMD en phase finale, aucune amélioration significative n’a été observée chez ces patients23. Le manque d’efficacité peut être dû au faible nombre de cellules transplantées et/ou au déséquilibre des facteurs rétiniens neuroprotecteurs. Une autre approche consisterait à transplanter des cellules épithéliales pigmentaires transfectées qui surexpriment les facteurs neuroprotecteurs pour restaurer l’homéostasie rétinienne, maintenir les cellules EPR restantes et protéger les photorécepteurs et les CRG de la dégénérescence. Par conséquent, nous proposons une nouvelle thérapie qui comprend la transplantation de cellules RPE ou IPE fonctionnelles qui ont subi un génie génétique pour sécrétiser des protéines neuroprotectrices et anti-angiogéniques, telles que le PEDF, le GM-CSF ou les facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGF). L’avantage de développer et d’analyser cette approche chez plusieurs espèces au lieu d’utiliser une lignée cellulaire, une seule espèce, ou un tissu humain est : 1) une reproductibilité et une transférabilité accrues des résultats comme le montrent de nombreuses études réalisées dans des laboratoires indépendants et différentes espèces1,24,25; 2) les cellules de porc ou de bovin sont jetables sans le sacrifice d’animaux supplémentaires; 3) la disponibilité de cellules de porc et de bovins en particulier permet à de grandes séries d’essais de produire des résultats robustes; 4) la connaissance de l’isolement, de la culture et de la modification génétique des cellules à partir des modèles les plus utilisés permet des analyses in vivo chez plusieurs espèces24,25,26 et offre ainsi un meilleur rapport bénéfice-risque pour les premiers patients traités; 5) la flexibilité du protocole présenté permet son utilisation dans divers modèles et dispositifs expérimentaux et pour toutes les thérapies à base de cellules oculaires avec et sans génie génétique. En revanche, les techniques alternatives telles que les lignées cellulaires ou les tissus humains ne sont que d’une transférabilité limitée et/ou d’une jetabilité limitée. Les lignées cellulaires telles que l’ARPE-19 sont idéales pour les expériences préliminaires; cependant, une faible pigmentation et une prolifération élevée diffèrent significativement des cellules primaires1. Les cellules RPE et IPE, qui sont isolées à partir de tissus de donneurs humains, constituent une source précieuse pour des expériences in vitro transférables; cependant, nous obtenons du tissu humain auprès d’une banque d’yeux américano-américaine, ce qui signifie que le tissu a au moins deux jours (après l’énucléation) et nécessite un transport long et coûteux, mais que le tissu du donneur local n’est pas disponible en quantité suffisante pour une recherche productive. L’avantage de l’utilisation de cellules primaires est confirmé par de multiples études d’autres groupes27,28.
Pour le développement d’une thérapie génique non virale à base de cellules utilisant le système de transposon SB100X pour transfecter les cellules RPE et IPE primaires avec les gènes codant pour PEDF et / ou GM-CSF pour traiter nvAMD et aAMD, respectivement29,30,31,32, nous avons d’abord établi la transfection des cellules ARPE-191 . Ensuite, les protocoles d’isolement et de transfection ont été établis dans des cellules primaires bovines et porcines facilement accessibles. Maintenant, l’isolement et la transfection des cellules primaires RPE et IPE de cinq espèces différentes ont été établis, des petits (comme la souris) aux grands mammifères (comme le bétail). Elle a été confirmée dans des cellules primaires RPE et IPE dérivées d’yeux de donneurs humains30. La production conforme aux Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) de l’ATMP a également été validée à l’aide de tissus de donneurshumains 33. Enfin, l’innocuité et l’efficacité de l’approche ont été évaluées in vivo chez trois espèces différentes pour lesquelles le protocole a été adapté : la souris, le rat et le lapin. Dans la configuration clinique, une biopsie de l’iris sera prélevée sur le patient et les cellules IPE seront isolées et transfectées dans la salle blanche, avant que les cellules ne soient transplantées par voie sous-rétinale chez le même patient. L’ensemble du processus aura lieu au cours d’une seule séance chirurgicale d’une durée d’environ 60 minutes. Le développement de l’approche thérapeutique et l’évaluation de son efficacité ont demandé d’excellents modèles in vitro et ex vivo pour mettre en œuvre des méthodes d’administration de gènes robustes et efficaces, pour analyser l’efficacité de l’administration de gènes, la production de protéines thérapeutiques et les effets neuroprotecteurs, et pour produire des greffes de cellules pour testerl’approche in vivo1,24, 25,29,30 . Il convient de mentionner que la thérapie a l’approbation éthique pour un essai clinique de phase Ib/IIa de la commission éthique pour la recherche du canton de Genève (n° 2019-00250) et que les dernières données précliniques actuellement demandées pour autorisation par les autorités réglementaires suisses sont collectées à l’aide du protocole présenté. À cet égard, les données précliniques in vivo ont démontré une réduction significative de la CNV et une excellente sécurité24,25,31.
Ici, l’isolement et la culture de cellules RPE/IPE de bovins, de porcs, de lapins, de rats et de souris, ainsi que l’utilisation du système de transposition intégratif SB100X combiné à l’électroporation comme méthode efficace d’administration de gènes sont décrits. En particulier, les cellules PE primaires ont été transfectées pour surexprimer le PEDF et le GM-CSF. La collecte de ces protocoles permet de réalisées dans toutes les phases précliniques du développement de l’ATMP. De plus, la configuration a le potentiel d’être adaptée à d’autres gènes d’intérêt et maladies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la cause la plus fréquente de cécité chez les patients >60 ans, affectant environ 30 millions de personnes dans le monde. La DMLA est une maladie multifactorielle influencée par des facteurs environnementaux et génétiques, qui entraînent une altération fonctionnelle de la rétine due à la dégénérescence des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) suivie d’une dégradation des photorécepteurs. Un traitement idéal comprendrait la transplantation de cellules RPE saines sécrant des facteurs neuroprotecteurs pour prévenir la mort cellulaire RPE et la dégénérescence des photorécepteurs. En raison des similitudes fonctionnelles et génétiques et de la possibilité d’une biopsie moins invasive, la transplantation de cellules épithéliales pigmentaires de l’iris (EPI) a été proposée comme substitut à l’EPR dégénérée. La sécrétion de facteurs neuroprotecteurs par un faible nombre de cellules transplantées sous-rétinales peut être obtenue par transfection à médiation transposonée par la Belle au bois dormant (SB100X)avec des gènes codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) et / ou le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF). Nous avons établi l’isolement, la culture et la transfection médiée par SB100Xdes cellules RPE et IPE de diverses espèces, y compris les rongeurs, les porcs et les bovins. Les globes sont explantés et la cornée et le cristallin sont enlevés pour accéder à l’iris et à la rétine. À l’aide d’une spatule sur mesure, les cellules IPE sont retirées de l’iris isolé. Pour récolter des cellules EPR, une incubation de trypsine peut être nécessaire, selon l’espèce. Ensuite, à l’aide d’une spatule personnalisée RPE, les cellules sont suspendues dans un milieu. Après l’ensemencement, les cellules sont surveillées deux fois par semaine et, après avoir atteint la confluence, transfectées par électroporation. L’intégration, l’expression, la sécrétion et la fonction des protéines ont été confirmées par qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence et tests fonctionnels. Selon les espèces, 30 000 à 5 millions de cellules (EPR) et 10 000 à 1,5 million de cellules (IPE) peuvent être isolées par œil. Les cellules génétiquement modifiées présentent une surexpression significative du PEDF/GM-CSF avec la capacité de réduire le stress oxydatif et offrent un système flexible pour les analyses ex vivo et les études in vivo transférables à l’homme pour développer des approches de thérapie génique oculaire.

Isolement de l’EP de différentes espèces de mammifères En utilisant les protocoles susmentionnés, les cellules IPE et RPE ont été isolées et cultivées avec succès à partir de cinq espèces différentes. Le nombre de cellules obtenues à partir de chaque procédure dépend de l’espèce et de la taille de l’œil (Tableau 1). Comme le montre la figure 1,les cellules présentent une morphologie et une pigmentation typiques des cellules PE (à ...

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Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.

Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Le protocole est important car il montre l’isolement et la transfection des cellules épithéliales pigmentaires de cinq mammifères comme un système optimal pour étudier la thérapie génique oculaire dans diverses configurations. Le principal avantage de cette méthode est sa flexibilité, sa transférabilité, son rendement cellulaire élevé, sa viabilité et son taux de transfection en raison des cinq espèces et du système de transposon SB100X non viral utilisé. Ces techniques ont été développées pour étudier les approches de thérapie génique ciblant les cellules épithéliales pigmentaires de la rétine et de l’iris, qui sont isolées et transfectées dans le présent protocole, mais qui sont utilisables pour toute recherche oculaire.Gregg Sealy, un technicien du laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir euthanasié l’animal, utilisez des ciseaux incurvés et des pinces Colibri pour énucléer les yeux, puis nettoyez le tissu musculaire et la peau restants des yeux. Recueillir les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS non stérile et transférer le tube dans la hotte à écoulement laminaire.Désinfectez-les en les immergeant dans une solution à base d’iode pendant deux minutes, puis transférez les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS stérile. Mettez un œil sur une compresse de gaze stérile et maintenez fermement l’œil près du nerf optique. Ensuite, coupez près de la limite de l’iris avec un scalpel numéro 11.À l’aide de ciseaux, coupez autour de l’iris et retirez le segment antérieur et mettez-le dans une boîte de Pétri, laissant le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules épithéliales du pigment rétinien, ou RPE, soient isolées. Pour isoler les cellules épithéliales du pigment de l’iris, ou cellules IPE, retirez le cristallin avec une pince fine et retirez délicatement l’iris contenant les cellules IPE. Placez l’iris dans une boîte de Petri et lavez-le avec du PBS stérile.Ajouter 500 microlitres de 0,25% de trypsine et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet et grattez délicatement l’IPE avec une pipette Pasteur plate et polie au feu. Recueillez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre.Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez 0,2 million de cellules par puits dans une plaque de 24 puits avec un millilitre de milieu complet. Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Pour isoler les cellules RPE, retirez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur avec une pince mince.Mettez les ampoules dans la plaque de 24 puits et ajoutez 500 microlitres de 0,25% de trypsine par œil et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet par globe et grattez délicatement les cellules RPE avec une pipette Pasteur incurvée et polie au feu. Recueillez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre.Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez les cellules comme décrit précédemment. Placez la plaque dans l’incubateur. Nettoyez les tissus musculaires et la peau restants des yeux et désinfectez les yeux dans une solution à base d’iode et rincez-les avec du PBS.Pour isoler les cellules IPE, retirez la lentille et retirez l’iris comme décrit précédemment. Après avoir préparé deux iris, ajoutez un millilitre de milieu complet et isolez les cellules en les grattant avec une pipette Pasteur plate et polie au feu, puis comptez et ensemencez les cellules. Placez la plaque dans l’incubateur.Pour isoler les cellules RPE, retirez le vitré et la rétine du segment postérieur et placez le bulbe dans une boîte de Pétri. Remplissez l’ampoule avec un millilitre de milieu complet. À l’aide d’une pipette Pasteur incurvée et polie au feu, retirez les cellules RPE.Recueillir la suspension cellulaire à l’intérieur de l’ampoule à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres et la transférer dans un tube de 1,5 millilitre pour la remise en suspension. Ensuite, comptez et ensemencez les cellules et incubez la plaque comme démontré précédemment. Après le nettoyage, ouvrez l’œil et coupez autour de l’iris pour enlever le segment antérieur, puis mettez dans une boîte de Pétri.Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules RPE soient isolées. Pour isoler les cellules IPE, si la lentille est livrée avec le segment antérieur, retirez la lentille et utilisez une pince fine pour retirer délicatement l’iris contenant les cellules IPE. Placez l’iris dans une boîte de Petri et lavez-le avec du PBS stérile.Coupez le corps ciliaire avec un scalpel numéro 10. Après avoir préparé les iris, incubez-les avec deux millilitres de 0,25% de trypsine à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez la trypsine et ajoutez deux millilitres de milieu complet, puis isolez les cellules en les rayant avec une pipette Pasteur plate et polie au feu.Transférer la suspension cellulaire dans un tube de deux millilitres et centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 120 fois G.Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu complet. Ensemencez 0,32 million de cellules par puits dans une plaque de six puits dans trois millilitres de milieu complet. Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.Pour isoler les cellules RPE, retirez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur avec une pince. Évitez d’endommager l’épithélium pigmentaire rétinien. Lavez l’ampoule avec PBS.Après avoir préparé les deux yeux, remplissez le bulbe d’environ trois quarts avec de la trypsine et incubez pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius avec le couvercle de la boîte de Petri sur le dessus de l’œil du bulbe. Retirer la trypsine et ajouter un millilitre de milieu complet. À l’aide d’une pipette Pasteur incurvée et polie au feu, retirez les cellules RPE.Recueillir la suspension cellulaire dans l’ampoule et la transférer dans un tube de 1,5 millilitre pour la remise en suspension. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 120 fois G.Seed 0,32 million de cellules par puits dans une plaque de six puits dans trois millilitres de milieu complet. Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.Culturez les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Après trois à quatre jours, pipettez de haut en bas pour recueillir les cellules non adhérentes et mettez la moitié du volume dans un autre puits. Remplissez le puits à un millilitre avec un milieu complet.Après trois à quatre jours supplémentaires, répétez la collecte de cellules, cette fois en mettant en commun les cellules non adhérentes de deux puits en un seul. Ajouter du milieu à tous les puits. Observez les cellules et changez le milieu deux fois par semaine.Lorsque les cellules atteignent la confluence, passez au milieu complet avec 1% FBS. En utilisant les protocoles susmentionnés, les cellules IPE et RPE ont été isolées et cultivées avec succès à partir de cinq espèces différentes. Le profil d’expression de l’EPR a été confirmé dans les cellules PRIMAIRES de l’EPT bovine par immunofluorescence pour l’EPR65.La viabilité cellulaire a été étudiée pour exclure une toxicité potentielle du tampon d’électroporation à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité disponible dans le commerce et d’un témoin électroporé à nœuds. Aucun impact sur la viabilité cellulaire n’a été observé. Des cellules épithéliales pigmentaires précultées de différentes espèces ont été transfectées avec la protéine jaune fluorescente de Vénus.Les cellules RPE19 transfectées ont été utilisées comme témoin positif. La quantification de l’efficacité de transfection dans l’EPR de porc préculé est présentée ici. Des cellules épithéliales pigmentaires de lapin fraîchement isolées ont été transfectées avec la protéine fluorescente jaune Venus et ont été surveillées par microscopie.Les cellules épithéliales pigmentaires ont été transfectées avec un facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire et la sécrétion de protéines a été surveillée par transfert western. Le signal pour les cellules transfectées était plus élevé que pour les cellules non transfectées pour toutes les espèces et tous les jours étudiés, et aucune diminution de la sécrétion de protéines n’a été observée au cours de cette période. Il est crucial d’éviter de gratter les cellules avec des outils tranchants.Ici, des pipettes Pasteur polies au feu sont utilisées, sauf dans les petits yeux de souris, où un scalpel rond doit être utilisé. Les cellules épithéliales pigmentaires peuvent être utilisées pour développer des approches de thérapie génique et pour simuler des conditions pathologiques, par exemple des dommages causés par le stress oxydatif. Ces modèles peuvent également être utilisés pour tester des médicaments thérapeutiques.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Recherche

Biologie

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d&#39;embryon de souris

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Un système de culture de cellules épithéliales de l&#39;iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Culture ex vivo des cellules humaines primaires épithéliales des trompes de Fallope

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolement et culture des cellules endothéliales aortiques primaires des porcs miniatures

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...