Name: isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Ein Dank gebührt Gregg Sealy und Alain Conti für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Kommission im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms, dem Schweizerischen Nationalfonds für Wissenschaften und der Schmieder-Bohrisch-Stiftung unterstützt. Das Z.I. wurde vom Europäischen Forschungsrat, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] und B.M.W. aus einem Fulbright Research Grant und einem Bundes-Exzellenz-Stipendium gefördert.

Die Protokolle, an denen Tiere beteiligt waren, wurden von zertifiziertem Personal und nach Genehmigung durch das kantonale Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale von Genf, Schweiz, und gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung (Genehmigungs-Nr. GE/94/17). Erwachsene gesunde Braune Wanderratten, C57BL/6-Mäuse und neuseeländische weiße Kaninchen wurden durch eine Überdosis Pentobarbital (150 mg/kg), verdü...

Standardisierte Methoden zur Isolierung und Kultivierung von PE-Zellen sind von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapieansätze für netzhautdegenerative Erkrankungen. Mit den hier vorgestellten Protokollen können PE-Zellen erfolgreich aus verschiedenen Spezies isoliert und über lange Zeiträume kultiviert werden (bisher wurde die längste Kultur 2 Jahre lang gepflegt1,38); typische PE-Zellmorphologie, Pigmentierung und Funktion wurde beobac...

Unsere Gruppe konzentriert sich auf die Entwicklung regenerativer Ansätze zur Behandlung der neuroretinalen Degeneration, d.h. AMD, durch RPE- und IPE-basierte nicht-virale Gentherapie. Die präklinische Etablierung solcher Therapien erfordert auf den Menschen übertragbare In-vitro-Modelle. Ziel der hier vorgestellten Studie ist es daher, Protokolle für die Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären RPE- und IPE-Zellen bereitzustellen. Die Begründung für die Isolierung von PE-Zellen aus mehreren Spezies besteht darin, die Sicherheit und Effizienz des Ansatzes robust zu bestätigen und seine Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit zu erhöhen. Die verfügbare humane RPE-Zelllinie ARPE-19 unterscheidet sich von Primärzellen (z.B. sind sie weniger pigmentiert) und ist daher für präklinische Analysen nur von begrenztem Wert1. Darüber hinaus können nicht-menschliche Säugetierzellen für weniger Kosten und in größeren Mengen gekauft werden; menschliches Spendergewebe kann aus verschiedenen Augenbanken bezogen werden, aber die Verfügbarkeit ist begrenzt und teuer. Schließlich müssen neue Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP, d. h. Zell-, Gewebe- oder Gentherapeutikum) in mindestens zwei verschiedenen Spezies angewendet werden, bevor sie an Patienten getestet werden, und diese In-vivo-Studien erfordern die Vorbereitung allogener Zelltransplantate.
Retinale neurodegenerative Erkrankungen sind die Hauptursache für Blindheit in Industrieländern und umfassen häufige Erkrankungen wie AMD sowie seltene Krankheiten wie Retinitis pigmentosa, bei denen der retinale Zelltod schließlich zur Erblindung führt. RPE-Zellen, Photorezeptoren und retinale Ganglienzellen (RGC) können in einigen Fällen verlangsamt werden, aber es gibt derzeit keine kurativen Therapien. ATMPs bieten das Potenzial, Gendefekte zu korrigieren, therapeutische Gene zu integrieren oder degenerierte Zellen zu ersetzen, wodurch die Entwicklung regenerativer und kurativer Therapien für Krankheiten wie AMD ermöglicht wird; 13 Gentherapien haben bereits die Marktzulassung erhalten, darunter eine Therapie zur Behandlung der RPE65-Mutation-assoziierten Netzhautdegeneration2,3. Unter den älteren Erwachsenen (>60 Jahre) sind weltweit ~ 30 Millionen Menschen entweder von neovaskulärer (nvAMD) oder avaskulärer (aAMD) AMD4betroffen. Beide Formen werden durch altersbedingte Auslöser induziert, darunter oxidative Schäden, Funktionsstörungen und Verlust von RPE-Zellen, gefolgt von einem Photorezeptorabbau, unter anderem (z. B. genetische Risikoallele, Rauchen, Bluthochdruck)5,6. Bei nvAMD wird die Pathogenese durch ein Ungleichgewicht von angiogenen und anti-angiogenen Faktoren zugunsten des angiogenen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) verschlimmert, der die choroidale Neovaskularisation (CNV) induziert. Bisher ist nur nvAMD durch monatliche intravitreale Injektionen von Inhibitoren des VEGF-Proteins behandelbar, um das CNV zu unterdrücken; für aAMD6,7ist noch keine wirksame Behandlung verfügbar.
Mehrere Studien evaluierten zellbasierte Therapien, um die Anti-VEGF-Therapie zu ersetzen: Studien von Binder et al., in denen frisch geerntete autologe RPE-Zellen in Patienten mit nAMD 8,9,10transplantiert wurden, zeigten eine moderate visuelle Verbesserung, aber nur eine kleine Gruppe von Patienten erreichte eine endgültige Sehschärfe, die hoch genug war, um das Lesen zu ermöglichen. Kürzlich verwendete eine klinische Phase-I-Studie ein aus embryonalen Stammzellen gewonnenes RPE-Pflaster zur Behandlung von AMD mit vielversprechenden Ergebnissen; d. h. Wirksamkeit, Stabilität und Sicherheit des RPE-Pflasters für bis zu 12 Monate bei 2 der 10 behandelten Patienten11. Darüber hinaus haben mehrere Gruppen Studien veröffentlicht, in denen autologe RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Flecken aus der peripheren Netzhaut entnommen und in die Makula transplantiert wurden12,13,14; und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete RPE-Pflaster wurden für die Transplantation erzeugt15. Für aAMD wurden Antikörper, die auf den Komplementweg abzielen, in den klinischen Studien6,16 getestet und eine Phase-I-Studie unter Verwendung einer einzigen intravitrealen Injektion eines adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektors, der das Gen für den Faktor CD59 (AAVCAGsCD59) bei Patienten mit geografischer Atrophie (GA) kodiert, wurde abgeschlossen17; Die Kürzlich gestartete Phase-II-Studie zielt darauf ab, 132 Patienten mit fortgeschrittener aAMD zu rekrutieren und das Ergebnis 2 Jahre nach der Intervention zu bewerten18. Schließlich hat die FocuS-Studiengruppe eine multizentrische klinische Phase-I/II-Studie gestartet, in der die Sicherheit, das Dosis-Wirkungs-Verhältnis und die Wirksamkeit eines rekombinanten, nicht replizierenden AAV-Vektors untersucht wurden, der für einen menschlichen Komplementfaktor19kodiert.
Das Ziel einer regenerativen AMD-Therapie ist in erster Linie die Transplantation von funktionellen RPE-Zellen, die beschädigt wurden oder verloren gegangen sind. IPE- und RPE-Zellen teilen jedoch viele funktionelle und genetische Ähnlichkeiten (z. B. Phagozytose und Retinolstoffwechsel), und da IPE-Zellen besser geerntet werden können, wurden sie als RPE-Ersatz vorgeschlagen20. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass die IPE-Zelltransplantation die Photorezeptordegeneration in den Tiermodellen21,22 verzögert und die Sehfunktion bei Patienten mit nvAMD im Endstadium stabilisiert, wurde bei diesen Patienten keine signifikante Verbesserung beobachtet23. Der Mangel an Wirksamkeit kann auf die geringe Anzahl transplantierter Zellen und / oder das Ungleichgewicht neuroprotektiver Netzhautfaktoren zurückzuführen sein. Ein alternativer Ansatz wäre die Transplantation von transfizierten Pigmentepithelzellen, die neuroprotektive Faktoren überexprimieren, um die retinale Homöostase wiederherzustellen, verbleibende RPE-Zellen aufrechtzuerhalten und Photorezeptoren und RGCs vor Degeneration zu schützen. Daher schlagen wir eine neue Therapie vor, die die Transplantation von funktionellen RPE- oder IPE-Zellen umfasst, die gentechnikalisiert wurden, um neuroprotektive und antiangiogene Proteine wie PEDF, GM-CSF oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) abzusondern. Der Vorteil der Entwicklung und Analyse dieses Ansatzes in mehreren Spezies anstelle einer Zelllinie, nur einer Spezies oder menschlichem Gewebe ist: 1) erhöhte Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der Ergebnisse, wie zahlreiche Studien in unabhängigen Labors und verschiedenen Spezies zeigen1,24,25; 2) Schweine- oder Rinderzellen sind ohne die Opfer zusätzlicher Tiere möglicherweise wegwerfbar; 3) Die Verfügbarkeit insbesondere von Schweine- und Rinderzellen ermöglicht große Versuchsreihen, um robuste Ergebnisse zu erzielen; 4) das Wissen, Zellen aus den am häufigsten verwendeten Modellen zu isolieren, zu kultivieren und genetisch zu verändern, ermöglicht In-vivo-Analysen bei mehreren Spezies24,25,26 und bietet somit ein verbessertes Nutzen-Risiko-Verhältnis für die ersten behandelten Patienten; 5) Die Flexibilität des vorgestellten Protokolls ermöglicht den Einsatz in verschiedenen Modellen und Versuchsanordnungen sowie für alle augenzellbasierten Therapien mit und ohne Gentechnik. Im Gegensatz dazu sind alternative Techniken wie Zelllinien oder menschliches Gewebe nur von begrenzter Übertragbarkeit und/oder begrenzter Verfügbarkeit. Zelllinien wie die ARPE-19 sind ideal für Vorversuche; Niedrige Pigmentierung und hohe Proliferation unterscheiden sich jedoch signifikant von Primärzellen1. RPE- und IPE-Zellen, die aus menschlichem Spendergewebe isoliert werden, bieten eine wertvolle Quelle für übertragbare In-vitro-Experimente; Wir beziehen jedoch menschliches Gewebe aus einer US-amerikanischen Augenbank, was bedeutet, dass das Gewebe mindestens zwei Tage alt ist (nach Enukleation) und einen langen und teuren Transport erfordert, aber lokales Spendergewebe nicht in ausreichenden Mengen für eine produktive Forschung zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung von Primärzellen wird durch mehrere Studien aus anderen Gruppen27,28bestätigt.
Für die Entwicklung einer zellbasierten nicht-viralen Gentherapie unter Verwendung des SB100X-Transposon-Systems zur Transfizierung primärer RPE- und IPE-Zellen mit den Genen, die für PEDF und/oder GM-CSF kodieren, zur Behandlung von nvAMD bzw. aAMD29,30,31,32, haben wir zunächst die Transfektion von ARPE-19-Zellen etabliert1 . Als nächstes wurden die Isolations- und Transfektionsprotokolle in leicht zugänglichen Primärzellen von Rindern und Schweinen etabliert. Jetzt wurde die Isolierung und Transfektion von primären RPE- und IPE-Zellen aus fünf verschiedenen Arten etabliert, von kleinen (als Maus) bis zu großen Säugetieren (als Rinder). Es wurde in primären RPE- und IPE-Zellen aus menschlichen Spenderaugen bestätigt30. Die GMP-konforme Produktion (Good Manufacturing Practices) des ATMP wurde ebenfalls unter Verwendung von menschlichem Spendergewebe validiert33. Schließlich wurden sowohl die Sicherheit als auch die Effizienz des Ansatzes in vivo bei drei verschiedenen Spezies bewertet, für die das Protokoll angepasst wurde: Maus, Ratte und Kaninchen. Im klinischen Aufbau wird eine Irisbiopsie vom Patienten geerntet und IPE-Zellen werden isoliert und im Reinraum transfiziert, bevor die Zellen subretinal in denselben Patienten zurück transplantiert werden. Der gesamte Prozess findet während einer einzigen chirurgischen Sitzung statt, die etwa 60 Minuten dauert. Die Entwicklung des Behandlungsansatzes und die Bewertung seiner Effizienz erforderten ausgezeichnete In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, um robuste und effiziente Genliefermethoden zu implementieren, die Effizienz der Genabgabe, die therapeutische Proteinproduktion und die neuroprotektiven Wirkungen zu analysieren und Zelltransplantate zu produzieren, um den Ansatz in vivozu testen1,24,25,29,30 . Erwähnenswert ist, dass die Therapie von der Ethikkommission für Forschung des Kantons Genf (Nr. 2019-00250) über die ethische Genehmigung für eine klinische Phase-Ib/IIa-Studie verfügt und derzeit die letzten präklinischen Daten, die von den Schweizer Zulassungsbehörden zur Genehmigung angefordert wurden, mit dem vorgestellten Protokoll gesammelt werden. In dieser Hinsicht zeigten präklinische In-vivo-Daten eine signifikante Reduktion des CNV und eine ausgezeichnete Sicherheit24,25,31.
Hier wird die Isolierung und Kultur von RPE/IPE-Zellen aus Rind, Schwein, Kaninchen, Ratte und Maus sowie der Einsatz des integrativen TRANSPONON-Systems SB100X in Kombination mit der Elektroporation als effiziente Gen-Delivery-Methode beschrieben. Insbesondere primäre PE-Zellen wurden transfiziert, um PEDF und GM-CSF zu überexprimieren. Die Sammlung dieser Protokolle ermöglicht die Durchführung der In-vitro- und In-vivo-Studien in allen präklinischen Phasen der ATMP-Entwicklung. Darüber hinaus hat der Aufbau das Potenzial, an andere interessante Gene und Krankheiten angepasst zu werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>7657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham`s F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drape (sterile)</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>800530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation buffer 3P.14</td>
			<td>3P Pharmaceutical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Brunschwig</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (different size) (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze compress</td>
			<td>PROMEDICAL AG</td>
			<td>25403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (0.9%)</td>
			<td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td>
			<td>1000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (18G)&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TER-NN1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection kit 10 &#181;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (fire-polish)</td>
			<td>Witeg</td>
			<td>4100150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td>
			<td>Ospedalia AG</td>
			<td>31408025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-PEDF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-SB100X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFAR4-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSB100X (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M&#225;t&#233;s et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CAGGS-Venus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Johnen et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned in our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/&#181;L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pastor et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scarpel no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tali Image-Based Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T10796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25050014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 5%/EDTA 2%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors curved (sterile)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and genetic engineering of mammalian primary pigment epithelial cells for non-viral gene therapy

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Patienten >60 Jahren und betrifft weltweit ~ 30 Millionen Menschen. AMD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst wird, die aufgrund einer degeneration retinaler Pigmentepithelzellen (RPE) mit anschließendem Abbau des Photorezeptors zu einer funktionellen Beeinträchtigung der Netzhaut führen. Eine ideale Behandlung wäre die Transplantation gesunder RPE-Zellen, die neuroprotektive Faktoren sezernieren, um den RPE-Zelltod und die Degeneration des Photorezeptors zu verhindern. Aufgrund der funktionellen und genetischen Ähnlichkeiten und der Möglichkeit einer weniger invasiven Biopsie wurde die Transplantation von Irispigmentepithelzellen (IPE) als Ersatz für die degenerierte RPE vorgeschlagen. Die Sekretion neuroprotektiver Faktoren durch eine geringe Anzahl subretinal transplantierter Zellen kann durch transpononvermittelte Transfektion von Dornröschen (SB100X) mit Genen erreicht werden, die für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) und/oder den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kodieren. Wir etablierten die Isolierung, Kultur und SB100X-vermittelteTransfektion von RPE- und IPE-Zellen verschiedener Spezies, darunter Nagetiere, Schweine und Rinder. Globen werden explantiert und die Hornhaut und linse werden entfernt, um Zugang zur Iris und zur Netzhaut zu erhalten. Mit einem speziell angefertigten Spatel werden IPE-Zellen aus der isolierten Iris entfernt. Um RPE-Zellen zu ernten, kann je nach Art eine Trypsin-Inkubation erforderlich sein. Dann werden die Zellen mit RPE-angepasstem Spatel im Medium suspendiert. Nach der Aussaat werden die Zellen zweimal pro Woche überwacht und nach Erreichen des Zusammenflusses durch Elektroporation transfiziert. Genintegration, Expression, Proteinsekretion und -funktion wurden durch qPCR, WB, ELISA, Immunfluoreszenz und funktionelle Assays bestätigt. Je nach Art können pro Auge 30.000-5 Millionen (RPE) und 10.000-1,5 Millionen (IPE) Zellen isoliert werden. Genetisch veränderte Zellen zeigen eine signifikante PEDF/GM-CSF-Überexpression mit der Fähigkeit, oxidativen Stress zu reduzieren, und bieten ein flexibles System für Ex-vivo-Analysen und In-vivo-Studien, die auf den Menschen übertragbar sind, um okuläre Gentherapieansätze zu entwickeln.

PE-Isolierung aus verschiedenen Säugetierarten Mit den oben genannten Protokollen wurden IPE- und RPE-Zellen erfolgreich isoliert und aus fünf verschiedenen Spezies kultiviert. Die Anzahl der Zellen, die aus jedem Verfahren gewonnen werden, hängt von der Art und Größe des Auges ab (Tabelle 1). Wie in Abbildung 1gezeigt, zeigen die Zellen eine typische PE-Zellmorphologie und Pigmentierung (mit Ausnahme der gezeigten Kaninchenzellen, die von Albino New...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy at JoVE.com

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Transinfektion primärer Iris- und retinaler Pigmentepithelzellen aus verschiedenen Säugetieren (Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine und Rinder) vorgestellt. Die Methode eignet sich ideal, um okuläre Gentherapieansätze in verschiedenen Setups für Ex-vivo-Analysen und auf den Menschen übertragbare In-vivo-Studien zu untersuchen.

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Das Protokoll ist von Bedeutung, da es die Isolierung und Transfektion von Pigmentepithelzellen von fünf Säugetieren als optimales System zur Untersuchung der okulären Gentherapie in verschiedenen Setups zeigt. Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Flexibilität, Übertragbarkeit, hohe Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Transfektionsrate aufgrund der fünf Spezies und des verwendeten nicht-viralen SB100X-Transposonsystems. Diese Techniken wurden entwickelt, um gentherapeutische Ansätze zu untersuchen, die auf netzhaut- und Irispigmentepithelzellen abzielen, die im vorliegenden Protokoll isoliert und transfiziert werden, aber für jede Augenforschung verwendbar sind.Das Verfahren wird Gregg Sealy, ein Techniker aus dem Labor, demonstrieren. Nachdem Sie das Tier eingeschläfert haben, verwenden Sie eine gekrümmte Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen zu enukleieren, und reinigen Sie dann das verbleibende Muskelgewebe und die Haut von den Augen. Sammeln Sie die Augen in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen auf die Laminar-Flow-Haube.Desinfizieren Sie sie, indem Sie zwei Minuten lang in Jodlösung eintauchen, und übertragen Sie dann die Augen auf ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit sterilem PBS gefüllt ist. Legen Sie ein Auge auf eine sterile Mullkompresse und halten Sie das Auge fest an den Sehnerv. Dann schneiden Sie in der Nähe der Grenze der Iris mit einem Skalpell Nummer 11.Schneiden Sie mit einer Schere um die Iris herum und entfernen Sie das vordere Segment und legen Sie es in eine Petrischale, wobei Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper belassen, bis das retinale Pigmentepithel oder DIE RPE-Zellen isoliert sind. Um Irispigmentepithel- oder IPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie die Iris, die die IPE-Zellen enthält, vorsichtig heraus. Legen Sie die Iris in eine Petrischale und waschen Sie sie mit sterilem PBS.Fügen Sie 500 Mikroliter 0,25% Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter komplettes Medium hinzu und kratzen Sie das IPE vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Zählen Sie die Zellen mit der Neubauer-Kammer und säen Sie 0,2 Millionen Zellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit einem Milliliter vollständigem Medium. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut mit einer dünnen Pinzette aus dem hinteren Segment.Legen Sie die Zwiebeln in die 24-Well-Platte und fügen Sie 500 Mikroliter von 0,25% Trypsin pro Auge hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter komplettes Medium pro Globus hinzu und kratzen Sie die RPE-Zellen vorsichtig mit einer gekrümmten, feuerpolierten Pasteurpipette. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Zählen Sie die Zellen mit der Neubauer-Kammer und säen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben aus. Legen Sie die Platte in den Inkubator. Reinigen Sie das verbleibende Muskelgewebe und die Haut von den Augen und desinfizieren Sie die Augen in jodbasierter Lösung und spülen Sie sie mit PBS aus.Um IPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie die Linse und ziehen Sie die Iris wie zuvor beschrieben heraus. Nachdem Sie zwei Iris vorbereitet haben, fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium hinzu und isolieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer flachen, feuerpolierten Pasteur-Pipette kratzen, dann zählen und säen Sie die Zellen. Legen Sie die Platte in den Inkubator.Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut aus dem hinteren Segment und legen Sie die Zwiebel in eine Petrischale. Füllen Sie die Glühbirne mit einem Milliliter kompletten Medium. Entfernen Sie die RPE-Zellen mit einer gekrümmten, feuerpolierten Pasteurpipette.Sammeln Sie die Zellsuspension in der Glühbirne mit einer 1.000 Mikroliter Pipette und geben Sie sie zur Rückgewinnung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann zählen und säen Sie die Zellen und inkubieren Sie die Platte wie zuvor gezeigt. Öffnen Sie nach der Reinigung das Auge und schneiden Sie um die Iris herum, um das vordere Segment zu entfernen, und legen Sie es dann in eine Petrischale.Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind. Um IPE-Zellen zu isolieren, wenn die Linse mit dem vorderen Segment geliefert wird, entfernen Sie die Linse und verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Iris, die die IPE-Zellen enthält, vorsichtig herauszuziehen. Legen Sie die Iris in eine Petrischale und waschen Sie sie mit sterilem PBS.Schneiden Sie den Ziliarkörper mit einem Skalpell Nummer 10 ab. Nachdem Sie die Iris vorbereitet haben, inkubieren Sie sie mit zwei Millilitern 0,25% Trypsin bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie zwei Milliliter komplettes Medium hinzu, dann isolieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen.Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei 120 mal G.Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen in zwei Millilitern vollständigem Medium. Säen Sie 0,32 Millionen Zellen pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte in drei Millilitern komplettem Medium. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut mit einer Pinzette aus dem hinteren Segment. Vermeiden Sie es, das retinale Pigmentepithel zu beschädigen. Waschen Sie die Glühbirne mit PBS.Nachdem Sie beide Augen vorbereitet haben, füllen Sie die Zwiebel etwa zu drei Vierteln mit Trypsin und inkubieren Sie für 25 Minuten bei 37 Grad Celsius mit dem Petrischalendeckel auf dem Zwiebelauge. Entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie einen Milliliter des vollständigen Mediums hinzu. Entfernen Sie die RPE-Zellen mit einer gekrümmten, feuerpolierten Pasteurpipette.Sammeln Sie die Zellsuspension in der Glühbirne und geben Sie sie zur Wiederverwendung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei 120 mal G.Seed 0,32 Millionen Zellen pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte in drei Millilitern komplettem Medium. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Nach drei bis vier Tagen pipettieren Sie auf und ab, um nicht adhärente Zellen zu sammeln, und geben Sie die Hälfte des Volumens in eine andere Vertiefung. Füllen Sie den Brunnen auf einen Milliliter mit komplettem Medium.Wiederholen Sie nach weiteren drei bis vier Tagen die Zellentnahme, diesmal die nicht adhäsiven Zellen aus zwei Vertiefungen in einer. Fügen Sie allen Vertiefungen Medium hinzu. Beobachten Sie die Zellen und wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.Wenn die Zellen den Zusammenfluss erreichen, wechseln Sie zu einem vollständigen Medium mit 1% FBS. Mit den oben genannten Protokollen wurden IPE- und RPE-Zellen erfolgreich isoliert und aus fünf verschiedenen Spezies kultiviert. Das RPE-Expressionsmuster wurde in primären bovinen IPE-Zellen durch Immunfluoreszenz für RPE65 bestätigt.Die Zelllebensfähigkeit wurde untersucht, um eine potenzielle Toxizität des Elektroporationspuffers unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Zytotoxizitätstestkits und einer knotenelektroporierten Kontrolle auszuschließen. Es wurde kein Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen beobachtet. Vorkultivierte Pigmentepithelzellen verschiedener Spezies wurden mit dem gelb fluoreszierenden Venusprotein transfiziert.Transfizierte RPE19-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet. Die Quantifizierung der Transfektionseffizienz in vorkultiviertem Schweine-RPE ist hier dargestellt. Frisch isolierte Kaninchenpigmentepithelzellen wurden mit dem gelb fluoreszierenden Protein Venus transfiziert und mikroskopisch überwacht.Pigmentepithelzellen wurden mit einem von Pigmentepithel abgeleiteten Faktor transfiziert und die Proteinsekretion wurde durch Western Blot überwacht. Das Signal für transfizierte Zellen war im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen für alle untersuchten Spezies und Tage höher, und innerhalb dieser Zeit wurde keine Abnahme der Proteinsekretion beobachtet. Es ist wichtig, das Abkratzen der Zellen mit scharfen Werkzeugen zu vermeiden.Hier werden feuerpolierte Pasteurpipetten verwendet, außer in kleinen Mausaugen, wo ein rundes Skalpell verwendet werden muss. Pigmentepithelzellen können verwendet werden, um gentherapeutische Ansätze zu entwickeln und pathologische Zustände, zum Beispiel oxidative Stressschäden, zu simulieren. Diese Modelle können auch verwendet werden, um therapeutische Medikamente zu testen.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...